CC BY
22
Vol. 16, no. 6. 2018
PRACTICAL MEDICINE ^ 155
УДК 675.015.22:616.511
А.К. ШЕРСТЕННИКОВА, С.Л. КАШУТИН, Л.М. ЖУРАВЛЁВ, В.С. НЕКЛЮДОВА, Е.И. ТЕДДЕР
Северный государственный медицинский университет МЗ РФ, 163000, г. Архангельск, пр. Троицкий, д. 51
Получение изолированных клеток эпидермиса и дермы посредством метода клеточно-щелочной диссоциации
Шерстенникова Александра Константиновна — кандидат медицинских наук, доцент кафедры нормальной физиологии, тел. +7-911-555-23-28, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0001-8576-6459 Кашутин Сергей Леонидович — доктор медицинских наук, заведующий кафедрой кожных и венерических болезней, тел. +7-906-281-23-90, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0002-2687-3059
Журавлев Леонид Михайлович — ординатор кафедры хирургии, тел. +7-952-306-09-96, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0003-2655-9649
Неклюдова Виктория Сергеевна — ассистент кафедры кожных и венерических болезней, тел. +7-911-878-70-80, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0001-6669-2992
Теддер Елена Игоревна — ассистент кафедры кожных и венерических болезней, тел. +7-911-572-72-82, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0003-0801-6181
цель работы — обоснование применения метода, позволяющего получить изолированные клетки дермы и эпидермиса для дальнейшей их идентификации.
Материал и методы. Методика клеточно-щелочной диссоциации клеток кожи в модифицированном варианте проводилась в соответствии с предложенным Л.М. Журавлевым и соавт. патентом РФ 2617237 «Способ получения препаратов изолированных клеток дермы».
Результаты. На примере сравнительного анализа гистологических срезов псориатической папулы, келлоидного рубца, среза папулы при угревой болезни и результатов клеточно-щелочной диссоциации аналогичных биоптатов были показаны возможности использования клеточно-щелочной диссоциации в дерматологии.
Заключение. Использование метода клеточно-щелочной диссоциации позволяет получить информацию относительно изолированных клеточных элементов эпидермиса и дермы, в том числе гемопоэтического происхождения, степень дифференцировки кератиноцитов с учетом их митотической активности, что не удается достичь при исследовании гистологических срезов.
Ключевые слова: изолированные клетки, эпидермис, дерма.
DOI: 10.32000/2072-1757-2018-16-6-155-158
(Для цитирования: Шерстенникова А.К., Кашутин С.Л., Журавлев Л.М., Неклюдова В.С., Теддер Е.И. Получение изолированных клеток эпидермиса и дермы посредством метода клеточно-щелочной диссоциации. Практическая медицина. 2018. Том 16, № 6, С. 155-158)
A.K. SHERSTENIKOVA, S.L. KASHUTIN, L.M. ZHURAVLEV, V.S. NEKLYUDOBA, E.I. TEDDER
Northern State Medical University of the MH of RF, 51 Troitskiy prospekt, 163000 Arkhangelsk, Russian Federation
Obtaining isolated cells of epidermis
and derma by method of cellular alkaline dissociation
Sherstennikova A.K. — PhD (medicine), Associate Professor of the Normal Physiology Department, tel. +7-911-555-23-28, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0001-8576-6459
Kashutin S.L. — D. Sc. (medicine), Head of the Skin and Venereal Diseases Department, tel. +7-906-281-23-90, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0002-2687-3059
Zhuravlev L.M. — resident of the Surgery Department, tel.: +7-952-306-09-96, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0003-2655-9649 Neklyudova V.S. — Assistant Lecturer of the Skin and Venereal Diseases Department, tel.: +7-911-878-70-80, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0001-6669-2992
Tedder E.I. — Assistant Lecturer of the Skin and Venereal Diseases Department, tel. +7-911-572-72-82, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0003-0801-6181
OBSTETRICS AND GYNECOLOGY
Objective. To substantiate application of the method to obtain isolated cells of the dermis and epidermis for their further identification.
Materials and methods. The technique of cell-alkaline dissociation of skin cells in the modified version was carried out in accordance with the patent of the Russian Federation 2617237"Method of obtaining preparations of isolated cells of the dermis" proposed by L.M. Zhuravlev et al.
Results. Using the comparative analysis of microscopic sections of psoriatic papules, keloid scar, slice of acne papules and the results of alkaline dissociation of corresponding bioptates, the possibilities of using cell-base dissociation in dermatology were shown.
Conclusions. The use of alkaline dissociation method allows obtaining information on the isolated cellular elements of the epidermis and dermis, including hematopoietic origin, degree of differentiation of keratinocytes based on their mitotic activity, which is not possible to achieve in the study of microscopic sections.
Key words: isolated cells, epidermis, dermis.
(For citation: Sherstennikova A.K., Kashutin S.L., Zhuravlev L.M., Neklyudova V.S., Tedder E.I. Obtaining isolated cells of epidermis and derma by method of cellular alkaline dissociation. Practical Medicine. 2018. Vol. 16, no 6, P. 155-158)
Введение
Известно, что гистологические срезы кожи позволяют визуально определить наличие патомор-фологических изменений, связанных с нарушением эпидермальной кинетики, дифференцировки кера-тиноцитов и эпидермальных связей, воспалительными и дистрофическими процессами в дерме. При этом цитометрические характеристики клеточных элементов эпидермиса и дермы необходимо осуществлять на изолированных клетках, что на гистологическом срезе реализовать не представляется возможным [1]. С другой стороны, существуют методы определения иммуногистохимическим путем процентного содержания клеток, экспрессирующих тот или иной рецептор. Однако в ряде случаев аналогичный рецептор может быть выявлен на различных клетках, что также исключает возможность идентификации клетки [2, 3, 4, 5].
Рисунок 1
Клеточные элементы эпидермиса и дермы после клеточно-щелочной диссоциации: К — ке-ратиноцит; М — миоциты; Ф — фибробласт; Л — лимфоцит; Н — нейтрофил; Кв — колла-геновые волокна. Гематоксилин-эозин. 06.40, ок.10 Figure 1
Cell elements of epidermis and derma after cellular-alkaline dissociation: K — keratinocyte; M — myocytes; F — fibroblast; L — lymphocyte; N — neutrophil; Cf — collagen fibers. Hematoxyilin — eosin. Vol. 40, oc. 10
АКУШЕРСТВО И ГИНЕКОЛОГИЯ
Ранее для получения изолированных клеток тканей Л.Н. Белов, М.Е. Коган и др. предложили метод клеточно-щелочной диссоциации [6, 7]. Однако для получения изолированных клеток дермы и эпидермиса он оказался малоэффективным. В дальнейшем этот метод был модифицирован и адаптирован для изучения клеточных элементов кожи Л.М. Журавлевым и соавт. [8]. С учетом вышесказанного актуальным является обоснование применения метода, позволяющего получить изолированные клетки дермы и эпидермиса с целью дальнейшей их идентификации.
Материалы и методы
Проводили цитологическое исследование 105 биоптатов кожи, из которых 25 биоптатов была
Рисунок 2
Клеточные элементы эпидермиса и дермы после клеточно-щелочной диссоциации био-птата папулы при псориазе: К — кератиноцит; Э — эндотелиоцит; Л — лимфоциты. Гематоксилин-эозин. 06.40, ок.10 Figure 2
Cell elements of epidermis and derma after cellular-alkaline dissociation of biopsy of a papula in psoriasis: K — keratinocyte; E — endoteliocyte; L - lymphocytes. Hematoxyilin — eosin. Vol. 40, oc. 10
Vol. 16, no. б. 2018
PRACTICAL MEDICINE ^ 157
кожа лиц, не имеющих хронической патологии в анамнезе, в том числе кожной, 22 биоптата псориа-тической папулы в прогрессирующую и стационарную стадии, 20 биоптатов келлоидных рубцов и по 19 биоптатов папул угревой болезни и васкулитов.
Забор биоптата здоровой кожи, псориатических папул проводили на передней стенке живота, при угревой болезни папулы локализовались на спине, при васкулитах — на передней поверхности голеней. Кусочки кожи брали панч-скальпелем №5 после инфильтрационной анестезии 2 % лидокаином с соблюдением правил асептики и антисептики. Келлоидная ткань была получена в результате хирургического иссечения келлоидных рубцов в абдоминальной области.
Обследование проводили с письменного согласия респондентов, с соблюдением основных норм биомедицинской этики в соответствии с документом «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов исследования» (Хельсинкская декларация Всемирной медицинской ассоциации 1964 года с изменениями и дополнениями на 2008 год).
В ходе исследования использовали методику клеточно-щелочной диссоциации клеток кожи, в модифицированном варианте проводилась в соответствии с предложенным Л.М. Журавлевым и со-авт. патентом РФ 2617237 «Способ получения препаратов изолированных клеток дермы» [8].
Результаты исследования
Методика клеточно-щелочной диссоциации (рис. 1) позволяет получить изолированные клетки эпидермиса и дермы: кератиноциты, миоциты, фи-бробласты, лимфоциты, нейтрофилы, а также кол-лагеновые волокна.
На гистологических срезах псориатической папулы хорошо визуализируется гиперкератоз с па-
ракератозом и акантоз с папилломатозом, а также лимфо-гистиоцитарные инфильтраты в сосочковой и сетчатой дерме. Однако данный срез не дает возможности идентифицировать лимфоидные элементы и т. п. Напротив, в результате проведения метода клеточно-щелочной диссоциации биоптата псориатической папулы определяются наряду с ке-ратиноцитами лимфоциты, эндотелиоциты, фибро-бласты (рис. 2). Посредством предлагаемого метода достигается возможность не только оценить степень дифференцировки кератиноцитов, но и учитывать митотическую активность кератиноцитов: двуядер-ные кератиноциты показаны на рис. 3. Учитывая то, что лимфоидные элементы могут иметь различный фенотип и по морфологическим признакам не всегда удается отличить их от макрофагов и фи-бробластов, необходима дальнейшая идентификация рецепторного аппарата клеток путем непрямой иммунопероксидазной реакции с моноклональными антителами методом «высушенной капли». Ценность представленного метода определяется еще и тем, что для исследования становятся доступными изолированные эндотелиоциты. Сведения о роли этих клеток в патогенезе псориаза довольно противоречивы, хотя именно эндотелиальные клетки участвуют в роллинге, прочной адгезии и трансмиграции непосредственных участников патогенеза псориаза — нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов. От эндо-телиоцитов зависит, насколько выраженной будет миграционная активность гемопоэтических клеток в дерму, а следовательно, насколько выраженным будет воспалительный компонент [9, 10, 11].
Келоидный рубец характеризуется наличием в дерме склероза и гиалиноза с хаотичным расположением волокон, а также скудными лимфоидными инфильтратами вокруг сосудов.
Клеточные элементы келоидного рубца, полученные в ходе клеточно-щелочной диссоциации, были
Рисунок 3
Двуядерные кератиноциты (стрелка) после клеточно-щелочной диссоциации биоптата псориатической папулы. Гематоксилин-эозин. 06.90, ок. 10 Figure 3
Two-nucleus keratinocytes (arrow) after cellular-alkaline dissociation of biopsy of a papula in psoriasis. Hematoxyilin - eosin. Vol. 90, oc. 10
Рисунок 4
Отростчатые клетки (стрелка) после клеточ-но-щелочной диссоциации биоптата папулы при угревой болезни. Гематоксилин-эозин. Об. 40, ок. 10 Figure 4
Dendritic cells (arrow) after cellular-alkaline dissociation of biopsy of a papula in acne. Hematoxyilin - eosin. Vol. 40, oc. 10
OBSTETRICS AND GYNECOLOGY
представлены морфологическими аналогами фи-бробластов, лимфоидных клеток и эндотелиоцитов, причем некоторые эндотелиоциты полностью изолировать не получилось, и в поле зрения визуализировались фрагменты капилляров.
На гистологических срезах папулы при угревой болезни в эпидермисе не зарегистрированы изменения эпидермальной кинетики, однако хорошо определялась лейкоцитарная инфильтрация. В со-сочковой дерме были выраженны лейко-лимфоид-ные инфильтраты. Сальные железы были гипер-плазированы, у одной из них наблюдалось гнойное разрушение. В сетчатой дерме имелись массивные округлые очаги лейко-лимфоидной инфильтрации. Определялась дезорганизация коллагеновых волокон сосочковой и сетчатой дермы.
Проведение клеточно-щелочной диссоциации показало наличие лимфоидных элементов, фибро-бластов, кератиноцитов, нейтрофилов, остатков ядерного материала нейтрофилов, а также отрост-чатые клетки (рис. 4), которые могут относиться либо к меланоцитам, либо к клеткам Лангерганса. Безусловно, что для более точной идентификации необходимо проведение гистохимического анализа и непрямой иммунопероксидазной реакции, но факт выявления изолированных клеток несомненно представляет интерес.
Таким образом, использование метода клеточно-щелочной диссоциации позволяет получить изолированные клетки эпидермиса и дермы, в том числе гемопоэтического происхождения, с целью дальнейшей их идентификации и проведения цитоме-трического анализа.
ЛИТЕРАТУРА
1. Цветкова Г.М., Мордовцева В.В., Вавилов А.М., Мордовцев В.Н. Патоморфология болезней кожи: Руководство для врачей. — М.: Медицина, 2003. — 496 с.
2. Волнухин В.А., Вавилов А.М., Кравцова И.В., Катунина О.Р. Гистологические и иммуногистохимические изменения кожи больных псориазом при лечении ПУВА-ваннами // Вестник дерматологии и венерологии. — 2007. — № 2. — С. 3-7.
3. Катунина О.Р., Резайкина А.В. Иммуногистохимический и морфометрический анализ содержания Толл-подобных рецепторов 2 и 4, клеток Лангерганса и субпопуляций Т-лимфоцитов в пораженной коже больных псориазом // Иммунопатология, аллергология, инфектология. — 2012. — № 2. — С. 51-54.
4. Новиков А.И., Кононов А.В., Охлопков В.А., Правдина О.В. Иммунохимическое исследование при псориазе // Вестник дерматологии и венерологии. — 2003. — № 3. — С. 26-28.
5. Новиков А.И., Охлопков В.А., Губарева A.B. Морфологическая характеристика элементов сыпи при угревой болезни (биоп-сийное исследование) // Клиническая дерматология и венерология. — 2007. — № 2. — С. 62-67.
6. Павлов А.В., Шашкина М.В., Гансбургский М.А., и др. Получение изолированных клеток для цитологических и цитогенетиче-ских исследований эпителия щитовидной железы // Морфология.
— 2006. Т. 130. — № 6. — С. 81-83.
7. Белов Л.Н., Коган М.Е., Леонтьева Т.А., и др. Получение изолированных клеток методом щелочной диссоциации фиксированных формалином тканей // Цитология. — 1975. — №17(11). — С. 1332-1338.
8. Журавлёв Л. М., Вилова К. Г., Мизгирёв Д. В., Зашихин А. Л., Кашутин С. Л. Способ получения препаратов изолированных клеток дермы. Патент РФ 2617237, заявка 2015124695, 23.06.2015.
9. Пальцев М.А., Иванов А.А. Межклеточные взаимодействия. — М.: Медицина; 1995. — 224 с.
10. Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. Клетки иммунной системы. — СПб.: Наука. — 2001. — 231 с.
11. Гарифуллина Э.Ф., Хисматуллина З.Р., Тухватуллина З.Г. Нарушение дифференцировки эпидермальных клеток при лимфо-пролиферативных заболеваниях кожи // Практическая медицина.
— 2012. —№ 6 (61) . — С. 106-109.
АКУШЕРСТВО И ГИНЕКОЛОГИЯ
