ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА ИММОБИЛИЗОВАННОЙ α-АМИЛАЗЫ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

625

получение и свойства иммобилизованной а-АМИЛАЗЫ

© Шкутина Ирина Викторовна 1, Мироненко Наталья Владимировна2, Селеменев Владимир Федорович2

1 Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет 194100, г.Санкт-Петербург, ул. Литовская, 2

2 Воронежский государственный университет. 394006, г.Воронеж, Университетская пл.,1.

E-mail: irn55@mail.ru

Ключевые слова: а-амилаза; хитозан; сверхсшитые полимеры; иммобилизация; каталитическая активность

Введение. а-Амилаза (а-1.4 — глюкан — 4 — глюканогидролаза, К.Ф. 3.2.1.1) гидроли-зует а -1.4 — гликозидные связи в крахмале и гликогене с образованием мальтозы и глюкозы. Препараты а-амилазы применяется в заместительной энзимотерапии для лечения амилазной недостаточности и заболеваний органов ЖКТ как у взрослых, так и у детей. Иммобилизация фермента способствует контролируемому высвобождению белка, позволяющему пролонгировать терапевтический эффект и способствует повышению устойчивости препаратов к денатурирующим фактором, по сравнению с нативным веществом. Создание и изучение свойств препаратов иммобилизованных ферментов является задачей, представляющей повышенный интерес.

Цель исследования. Изучение процесса адсорбционной иммобилизации а-амилазы на сорбентах различного типа.

Материалы и методы. В работе был использован ферментный препарат а-амилаза Aspergillus awamori ("Диаэм"). Носителями для иммобилизации а-амилазы служили хито-зан — природный аминополисахарид и сверхс-шитые полимеры на основе стирола и диви-нилбензола — MN-100, MN-500 ("Purolite"). MN-100 — анионообменник слабоосновного типа с третичными аминогруппами, MN-500 — сульфокатионнообменник.

для получения изотерм сорбции использовали метод переменных концентраций. Навески сорбента (1.0000±0.0002 г) приводили в контакт с растворами а-амилазы с концентрациями 0.1^5.0-10-2 ммоль/дм3. Соотношение раствор / сорбент было постоянным и составляло 100 / 1. Растворы готовили на основе ацетатного буфера с разным значением рН среды. Эксперименты проводили при 293 К. Концентрацию веществ в равновесном растворе определяли спектрофотометрически по модифицированному методу Лоури. Количество веще-

ства в фазе сорбента вычисляли по разности концентраций исходного и равновесного растворов. Для изучения поверхности сорбентов использовался сканирующий электронный микроскоп JSM-6380LV.

Каталитическую активность а-амилазы измеряли фотометрическим методом. Термическую и кислотную инактивацию нативных и иммобилизованных ферментных препаратов проводили термостатированием в 0,1 М ацетатном буфере, температурах 40-700С. Остаточную активность образцов определяли по отношению к 5 10-4М раствору крахмала. Стандартное отклонение полученных результатов не превышало величину 0.01

Результаты. Исследованы кинетические особенности сорбции а-амилазы Aspergillus awamori на хитозане, MN-270, MN-500. Определено, что время установления равновесия составляет 120-140 мин в зависимости от использованного сорбента. Рассчитанные значения эффективных коэффициентов диффузии (~ 10-9 см2/с) и энергии активации при температурах 50 и 200 С (5,8-7,3 кДж) позволяют предположить, что процесс сорбции лимитируется стадией внутренней диффузии.

При изучении зависимости количества связанного с носителями фермента от различных значений рН среды было показано, что иммобилизацию а-амилазы следует проводить при рН 5,0-5,5, т.е. в области изоэлектрической точки белка.

Получены изотермы сорбции фермента в диапазоне значений рН, соответствующих наибольшему количеству иммобилизованного белка. Выявлено, что наибольшее количество белка сорбируется на сульфокатионообменнике MN-500 (4,1 ммоль/г). Предполагается, что при связывании а-амилазы со сверхсшитыми полимерами происходит формирование п-п-э-лектронного взаимодействия между гетероци-клами гистидина, триптофана, бензольным

MEDiOiNE: THEoRY AND pRACTicE

том 4 СПЕЦВЫПУСК 2019

eiSSN 2658-4204

626

ABSTRACTS

кольцом тирозина и бензольными кольцами носителя. Аминокислоты, содержащие неполярные алифатические и ароматические боковые группы (аланин, валин, лейцин, изолейцин и фенилаланин) и входящие в макромолекулу белка, также вступают в гидрофобные взаимодействия с сорбентом. После завершения формирования мономолекулярного слоя сорбата дальнейший процесс сорбции происходит уже за счет взаимодействия молекул амилазы друг с другом, которое может осуществляться как в результате контакта гидрофобных, так и гидрофильных частей макромолекул. Определенная доля фермента, кроме того, может сорбироваться за счет ионного обмена.

Связывание белка с хитозаном происходит преимущественно за счет образования водородных связей, а также ионного взаимодействия аминогрупп полисахарида и карбоксильных групп аминокислот, входящих в состав белка.

Важную роль во всех сорбционных процессах играет также растворитель. Его количество и состояние в сорбенте, изменение состояния в процессе сорбции и перераспределение между фазами контролировалось с помощью гравиметрического метода. вышеописанный механизм сорбции фермента был подтвержден исследованием по-

верхности сорбента с помощью растровой электронной микроскопии

Изотермы сорбции а-амилазы проанализированы с применением адсорбционной теории БЭТ, рассчитаны равновесные параметры сорбции: предельное количество сорбированной амилазы, константы, характеризующие взаимодействия типа сор-бат-сорбент и сорбат-сорбат.

выявлена высокая активность полученных гетерогенных биокатализаторов, которая составляет 68-89% от активности на-тивной а-амилазы. Установлено, что препараты иммобилизованного фермента по сравнению с нативным ферментом обладают повышенной устойчивостью к денатурирующим воздействиям температуры и рН среды.

отмечено, что полученные ферментные препараты при температуре хранения 0-2оС сохраняли свою каталитическую активность практически неизменной в течение 1 года.

Заключение. Из рассматриваемых сорбентов наибольшей каталитической активностью и устойчивостью к денатурирующим факторам обладает носитель МК-500. Проведенные исследования свидетельствуют о целесообразности дальнейшего изучения и использования процесса иммобилизации а-амилазы на сверхсшитом полимере.

МЕдицинА: теория и ПРАКТИКА

тоМ 4 спецвыпуск 2019

iSSN 2658-4190