CC BY
160
УДК 615.322:548.56:543.226
ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ СОЛЬВАТОВ БЕТУЛИНА
© М.Л. Михайленко1,2 , Т.П. Шахтшнейдер1,2, M.E. Брезгунова1’2, В.А. Дребущак2,3, С.А. Кузнецова4,
В.В. Болдырев1,2
1Институт химии твердого тела и механохимии СО РАН, ул. Кутателадзе 18, Новосибирск, 630128 (Россия) e-mail: mikhailenko@solid.nsc.ru 2Научно-образовательный центр «Молекулярный дизайн и экологически безопасные технологии» при НГУ, Новосибирск (Россия)
3Институт геологии и минералогии СО РАН, пр. ак. Коптюга, 3,
Новосибирск, 630090 (Россия) e-mail: dva@xray.nsu.ru
4Институт химии и химической технологии СО РАН, ул. К. Маркса, 42,
Красноярск, 660049 (Россия) e-mail: ksa@icct.ru
Перекристаллизацией бетулина из растворителей различной полярности (ацетона, метанола, этанола, пропанола, бу-танола, этилацетата, хлороформа, дихлорметана) получены псевдополиморфные формы (сольваты) бетулина. Физикохимические свойства сольватов изучены методами оптической микроскопии, рентгеновской дифракции, термического анализа и ИК-спектроскопии. Показано, что перекристаллизация из растворителей и последующее высушивание при температуре 170-180 °С позволяют понизить содержание лупеола в образцах бетулина менее чем на 1%.
Ключевые слова: сольваты бетулина, термический анализ, рентгеновская дифракция.
Работа выполнена при финансовой поддержке Президиума СО РАН (программа РАН «Фундаментальные науки - медицине»), CRDF (RUXO-OO8-NO-O6), РФФИ (08-03-12130).
Введение
Бетулин (3р,28-дигидрокси-20(29)-лупен) относится к пентациклическим тритерпеноидам ряда лупана и является одним из основных компонентов, получаемых из коры березы [1]. В последнее время широко исследуется биологическая активность бетулина и его производных как противовирусных, противовоспалительных, противоопухолевых средств [2, 3]. Однако физико-химические свойства бетулина недостаточно изучены. В литературе отсутствует информация о полиморфных и псевдополиморфных (сольватных) формах бетулина. В работах [4-6] сообщаются различные температуры плавления бетулина, выделенного разными способами и перекристаллизованного из различных растворителей, что может указывать на существование нескольких полиморфных модификаций или сольватов бетулина с органическими растворителями. Исследование полиморфизма лекарственных и биологически активных веществ, как известно, является необходимым этапом при создании новых лекарственных форм [7, 8]. С другой стороны, перекристаллизация из органических растворителей используется для очистки выделенного бетулина, и применение различных растворителей может оказаться перспективным для удаления примесей из полученных образцов, в том числе и постоянного спутника бетулина в коре березы - лупеола.
Цель настоящей работы - исследование возможности образования сольватов бетулина при перекристаллизации его из различных растворителей. Физико-химические свойства полученных образцов были исследованы методами оптической микроскопии, рентгеновской дифракции, термического анализа и ИК-спектроскопии. Содержание лупеола в полученных продуктах определяли с помощью хроматографических методов.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальная часть
В работе использовали бетулин, полученный в ИХХТ СО РАН (Красноярск) по оригинальной технологии [9]. Измельченную бересту обрабатывали смесью вода-спирт-щелочь при использовании ударноакустического воздействия в течение 5 мин при температуре 70 °С. Ударно-акустическая активация интенсифицирует гидролиз бересты, ускоряет переход бетулина в раствор и способствует повышению его выхода. Бетулин осаждали из упаренного раствора при разбавлении его водой и отделяли фильтрованием. Перед проведением экспериментов бетулин дополнительно очищали путем промывания гексанового экстракта 15%-ным раствором NaOH.
В работе использовали растворители ацетон ч.д.а., метанол техн., этанол ГОСТ 5963-67, н-пропанол х.ч., н-бутанол х.ч., этилацетат ч.д.а., хлороформ ч.д.а., дихлорметан х.ч.. Метанол очищали по методу, описанному в [10], хлороформ и этилацетат предварительно подвергали перегонке.
Анализ методом газо-жидкостной хроматографии масс-спектрометрии (ГЖХ-МС) проводили на приборе Agilent 5080 (Varian), колонка DB-1, температура колонки 280°С. ВЭЖХ анализ осуществляли на микроко-лоночном хроматографе Милихром А-02 (Эконова, Россия) с УФ-детектором. Условия хроматографирования: колонка N2301 2,0x75 мм, сорбент ProntoSIL 120-5C18 AQ, размер частиц 5.0 мкм, подвижная фаза Н2О (А) - CH3CN (В), градиентный режим 80-100-100% В. Объем аликвоты составлял 2 мкл. Скорость потока 100 мкл/мин, Т=35 °С. Содержание бетулина и лупеола определяли на длине волны 200 и 210 нм. Коэффициенты поглощения на этих длинах волн считали одинаковыми. Хроматограммы обработаны в программе МультиХром, прилагаемой к данному оборудованию.
Для перекристаллизации бетулина готовили его растворы с концентрацией 90% от равновесной при н.у. растворимости в используемых растворителях [11], растворение проводили при нагревании на водяной бане. Полученные растворы отфильтровывали и оставляли на воздухе при комнатной температуре для медленного испарения растворителя. После испарения 80-90% объема растворителя кристаллы извлекали. Нагреванием перекристаллизованных образцов при температуре 180 °С в течение 5 ч получали десольватированные продукты.
Для микроскопических исследований использовали оптический микроскоп NU-2E (Carl Zeiss Jena), снабженный цифровой камерой, увеличение x50.
Порошковые рентгенограммы регистрировали на дифрактометре D8 DISCOVER с двухкоординатным детектором GADDS (Bruker), CuKa-излучение. Образцы мягко растирали перед съемкой. Дифрактограммы снимали с вращением держателя с образцом.
Термогравиметрические (ТГ и ДТГ) измерения были выполнены на приборе TG-209 (Netzch) с использованием алюминиевых тиглей в атмосфере сухого аргона (25 мл/мин) в температурной области от 25 до 270 °С при скорости 10 °С/мин. Масса образцов составляла 2,77-2,78 мг. Измеренные значения m(T) были скорректированы с помощью эксперимента с пустым тиглем. Калориметрические измерения (ДСК) осуществляли на приборе DSC-204 (Netzch) в стандартных алюминиевых тиглях, закрытых крышками, но не запаянных, в атмосфере чистого N2 при скорости протока 100 см3/мин. Эксперименты проводили со скоростью 10 °С/мин в температурной области - (140-160) °С - 270 °C.
Инфракрасные спектры нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) в диапазоне частот 4000600 см-1 снимали на Фурье ИК-спектрометре Digilab Excalibur 3100 (США) с использованием приставки НПВО фирмы Pike с кристаллом ZnSe без прессования образцов.
Обсуждение результатов
Согласно данным ГЖХ-МС, исходный образец содержал не менее 95% бетулина и 5% лупеола.
Оптико-микроскопические исследования полученных перекристаллизацией кристаллических форм бету-лина показали, что кристаллы из различных растворителей отличаются по своей морфологии: имеют разную длину, толщину и различного типа сочленение игольчатых кристаллов в агрегаты (рис. 1). Большинство образцов оказались относительно хорошо окристаллизованными, о чем свидетельствует наличие четких рефлексов на рентгеновских дифрактограммах в области 20=5-25°. Дифрактограммы различались для образцов, полученных из разных растворителей (рис. 2, 3). Рентгенограммы снимали как для свежеприготовленных образцов, так и после их хранения при комнатной температуре в течение 2,5 и 8 ч, а также после нагревания до 180 °C. Результаты показали, что перекристаллизованные образцы неустойчивы при хранении при ком-
натной температуре. В случае растворителей с малым размером молекул и низкой температурой кипения, такими как ацетон, метанол, этанол или пропанол, рентгенограммы изменялись уже после 2,5 ч (рис. 2). Сольваты с бутанолом, хлороформом, дихлорметаном и этилацетатом были более стабильны при хранении при комнатной температуре, их рентгенограммы начинали изменяться только после 8 ч хранения (рис. 3). Тем не менее даже неустойчивые сольваты можно было получить в виде хорошего качества монокристаллов, достаточно устойчивых при комнатной температуре. Были выращены монокристаллы сольвата бетули-на с этанолом и определена их структура [12].
Рис. 1. Микрофотографии сольватов бетулина, полученных перекристаллизацией из ацетона (1), метанола (2), дихлорметана (3), этилацетата (4), бутанола (5), пропанола (6), этанола (7), хлороформа (8)
a)
2®, degree
в)
2®, degree
б)
2®, degree
г)
2®, degree
Рис. 2. Рентгеновские дифрактограммы образцов бетулина, перекристаллизованного из ацетона (а); метанола (б); этанола (в); пропанола (г): 1 - исходный; 2 - после 2,5 ч хранения; 3 - после нагревания
a)
2®, degree
б)
в)
15
2®, degree
г)
2®, degree
Рис. 3. Рентгеновские дифрактограммы образцов бетулина, перекристаллизованного из бутанола (а); этилацетата (б); хлороформа (в); дихлорметана (г): 1 - исходный; 2 - после 8 ч хранения; 3 - после нагревания
Рентгенограммы для сольватов бетулина с метанолом, этанолом и пропанолом имели сходные положения и интенсивности рефлексов, и при хранении образцов пики на дифрактограммах сдвигались одинаковым образом. Можно предположить, что эти растворители входят в решетку бетулина одинаковым образом, образуя одни и те же связи с молекулами бетулина. В случае образцов, перекристаллизованных из дихлор-метана, нагревание не оказывало влияния на положение и форму рентгеновских пиков. Это позволяет предположить, что при образования сольвата растворитель входит в кристаллическую решетку бетулина с образованием структуры типа клатратной. Рентгеновские дифрактограммы всех других перекристаллизованных образцов изменялись при нагревании (рис. 2, 3), что может быть результатом десольватации или полиморфного превращения бетулина из одной кристаллической модификации в другую.
Результаты термоаналитических исследований полученных перекристаллизацией образцов бетулина представлены на рисунке 4 и в таблице 1. Согласно данным ТГ и ДТГ, образцы, выделенные из различных растворителей теряют массу при нагревании, что является доказательством образования сольватов при перекристаллизации. На термоаналитических кривых образцов, полученных кристаллизацией из ацетона и метанола, наблюдается несколько стадий потери массы. Это может быть связано с удалением не только кристаллизационного растворителя из структуры сольвата, но также растворителя, окклюдированного в кристаллической решетке или между зернами твердого тела. Нельзя также исключить возможность образования разного типа сольватов бетулина при кристаллизации из данных растворителей. Только одна стадия потери массы наблюдалась в случае продуктов перекристаллизации из бутанола, этилацетата, хлороформа.
Количественный анализ потери массы в процессе десольватации показал близкие к стехиометрическим соотношения масс бетулина и сольвента в кристаллической решетке в случае всех исследованных образцов (табл. 1).
Эндотермические эффекты на кривых ДСК совпадают с эффектами на кривых ДТГ, которые отвечают потере растворителя, а также соответствуют плавлению лупеола (200-220 °С) и бетулина (254-259 °С) (рис. 4). Измерение кривых ДСК при низких температурах показало, что в образцах отсутствовал окклюди-
3
2
10
20
25
рованный растворитель в виде отдельной фазы. В случае продуктов, перекристаллизованных из метанола, этанола, хлороформа и ацетона, наблюдался эндотермический пик при 0 °C, свидетельствующий о том, что при кристаллизации из этих растворителей в кристаллах была окклюдирована вода. На рисунке 5 представлены два крайних случая присутствия окклюдированной воды в образцах сольватов бетулина в случае хлороформа (максимальное) и метанола (минимальное). Анализ теплоты плавления показывает, что содержание окклюдированной воды в кристаллах не превышает 1-1,5%.
Точно определить температуру плавления бетулина после разложения сольватов оказалось затруднительным вследствие процессов сублимации и испарения, протекающих одновременно с плавлением. Уширение пиков плавления может быть также связано с повышенной дефектностью образцов после десольватации.
a)
temperature, C
б)
temperature, C
в)
temperature, C
г)
temperature, oC
Рис. 4. ДСК и ДТГ кривые сольватов бетулина: а - с метанолом; б - с этанолом; в - с пропанолом; г - с хлороформом
Рис. 5. Кривые ДСК сольватов бетулина с хлороформом и метанолом в области температуры плавления воды
temperature, oC
0,0
3,5
Таблица 1. Термические характеристики перекристаллизованных образцов бетулина
Растворитель Температура десольватации, оС "Потеря массы, % Соотношение бетулин -растворитель (моль) Температура плавления, оС
Т 1 начала Т -‘-тах
Ацетон 56, 85 74, 100 3,0 2 1 258
Метанол 50, 71, 122 57, 87, 134 6,0 1 1 261
Этанол 130 135 7,3 1 1 261
н-пропанол 96 102 11,0 1 1 257
н-бутанол 20 58 13,0 1 1 **259(257)
Этилацетат 67 75 11,0 2 1 258
Хлороформ 51 73 7,8 2 1 261
Дихлорметан 75 145 4,5, 6,3 2 1 262
Потерю массы при десольватации оценивали как потерю массы до 200 0С (или, в случае дихлорметана, отдельно до 200
и до 250 °С).
Сольват с бутанолом имеет пик плавления с точкой перегиба, и дифференцирование показывает возможное наличие второго пика при 257 °С.
На кривых ДСК фиксируется также протекание экзотермических процессов. Например, в случае распада сольвата бетулина с хлороформом потеря массы заканчивается при 135-140 °С, затем наблюдается экзотермический эффект в области 150-190 °С с максимумом при 170 °С (рис. 4). Таким процессом может быть рекристаллизация, которая является обычной стадией для топохимических реакций разложения твердого тела, поскольку продукты разложения могут иметь повышенную дефектность и значительную степень разупорядочения кристаллической решетки. Аналогичные процессы рекристаллизации могут протекать и в случае разложения других сольватов. Так, между 170 и 200 °С, согласно данным ДСК, происходит уменьшение теплоемкости образцов, полученных из этанола и пропанола, что может свидетельствовать о протекании экзотермического процесса. Полученные данные позволяют предполагать, что можно выбрать наиболее оптимальные условия проведения разложения сольватов для получения фаз бетулина с высокой степенью разупорядочения и высокой энергией кристаллической решетки, которые, как известно, обладают более высокой реакционной способностью, в частности, скоростью растворения и растворимостью, что может иметь значение при использовании бетулина в фармации.
На ИК-спектрах всех перекристаллизованных образцов бетулина (данные не приведены) наблюдались дополнительные полосы, принадлежащие соответствующим растворителям, что подтверждает образование сольватов.
Поведение ИК-спектров при разложении сольватов исследовано на примере сольвата бетулина с этанолом при проведении процесса при различных температурах. При нагревании образцов при 170 °С полосы растворителя исчезают (рис. 6). Так, в ИК-спектре исходных кристаллов сольвата бетулина с этанолом имеются шесть полос, отвечающих симметричным и асимметричным колебаниям трех видов С-О связей: при первичном и вторичном атомах углерода молекулы бетулина и в молекуле этанола. После нагрева до 170 °С, когда, согласно данным ТГ, завершается разложение сольвата, в ИК-спектре остаются четыре полосы поглощения, относящиеся к молекуле бетулина. Кроме того, наблюдаются изменения в области валентных колебаний ОН. Для сольвата в области валентных колебаний О-Н наблюдаются три полосы, принадлежащие этанолу (3480 см-1) и отличающимся по своему окружению ОН группам бетулина (~3350 и 3270 см-1). После нагревания при 170 °С в течение 30 мин полоса при 3480 см-1 исчезает, а колебания ОН бетулина испытывают гипсохромный сдвиг и уширяются. Изменение данных полос бетулина свидетельствует о том, что при нагревании происходит разрыв водородных связей между молекулами бетулина и растворителя, которые образовались при кристаллизации, что было подтверждено результатами рентгеноструктурного анализа [12], и образуется разупорядоченная структура бетулина. При проведении процесса разложения сольвата с этанолом при 200 и 230 °С на ИК-спектрах наблюдается батохромный сдвиг полос поглощения валентных колебаний С-О и ОН относительно исходного сольвата, что говорит о формировании водородных связей между молекулами бетулина и образовании упорядоченной кристаллической структуры. Таким образом, из ИК-спектроскопических исследований видно, что разложение сольвата бетулина с этанолом при различных температурах может приводить к продукту с различной степенью разупорядочения.
Данные по содержанию лупеола в полученных перекристаллизацией продуктах и десольватированных образцах представлены в таблице 2. Видно, что перекристаллизация и последующее удаление растворителя в процессе сушки позволяют понизить содержание примеси лупеола в бетулине менее чем на 1%. Снижение содержания лупеола при сушке обусловлено, по-видимому, его более низкой, по сравнению с бетулином, температурой возгонки.
Рис. 6. ИК-спектры сольвата бетулина с этанолом: 1 - исходный; 2 - после 30 мин нагрева при 170 °С 3 - при 200 °С; 4 - при 230 °С
Таблица 2. Содержание примеси лупеола в кристаллах, полученных из различных растворителей
Растворитель Содержание лупеола в полученных сольватах, % Содержание лупеола после прогрева при 180оС, %
Метанол менее 1,0 менее 1,0
Этанол 1,0 менее 1,0
Пропанол 1,0 менее 1,0
Бутанол 1,2 1,0
Лцетон 1,5 менее 1,0
Этилацетат 1,7 1,5
Дихлорметан 1,9 менее 1,0
Хлороформ 2,7 менее 1,0
Выводы
Перекристаллизацией бетулина из восьми растворителей различной полярности выделены псевдополи-морфные формы (сольваты) бетулина. Показано, что сольваты, перекристаллизованные из ацетона, метанола, этанола и пропанола, являются нестабильными и теряют растворитель при хранении при комнатной температуре. Более стабильными оказались сольваты, полученные из бутанола, этилацетата, хлороформа и ди-хлорметана. Многостадийный характер десольватации при нагревании сольватов с метанолом и ацетоном позволяет предположить, что молекулы растворителя могут иметь различное окружение в кристаллической решетке сольвата. Перекристаллизация из растворителей и последующее высушивание образцов при температуре 170-180 °С позволяют понизить содержание лупеола в образцах бетулина менее чем на 1%. Образование сольватов бетулина при перекристаллизации его из различных растворителей следует принимать во внимание при выборе оптимальных условий высушивания перекристаллизованных продуктов с целью получения материалов с различной степенью разупорядочения кристаллической решетки и, следовательно, реакционной способностью.
Авторы выражают благодарность Т. Дребущак и Н. Туманову за съемку рентгеновских дифракто-грамм.
Список литературы
1. Кислицын А.Н. Экстрактивные вещества бересты: выделение, состав, свойства, применение // Химия древесины. 1994. №3. С. 3-28.
2. Толстиков Г.А., Флехтер О.Б., Шульц Э.Э., Балтина Л.А., Толстиков А.Г. Бетулин и его производные. Химия и биологическая активность // Химия в интересах устойчивого развития. 2005. №13. С. 1-30.
3. Кузнецова С.А., Васильева Н.Ю., Калачева Г.С., Титова Н.М., Редькина Е.С., Скворцова Г.П. Получение диацетата бетулина из бересты коры березы и изучение его антиоксидантной активности // Журнал Сибирского федерального университета. Химия. 2008. Т. 1. №2. С. 151-165.
4. Hayek E.W.H., Jordis U., Moche W., Sauter F. A bicentennial of betulin // Phytochemistry. 1989. V. 28. Pp. 2229-2242.
5. Komissarova N.G., Belenkova N.G., Spirikhin L.V., Shitikova O.V., Yunusov M.S. Selective oxidation of betulin by Cr(VI) reagents // Chemistry of Natural Compounds. 2002. V. 38. Pp. 58-61.
f—і—1—і—1—і—1—і—//—1—і—1—і—1—і—1—і—1—і—1—і
3600 3400 3200 3000 28001200 1150 1100 1050 1000 950 900
v, cm ’1
6. Tong-Shuang Li, Jian-Xin Wang, Xue-Jing Zheng. Simple synthesis of allobetulin, 28-oxyallobetulin and related biomarkers from betulin and betulinic acid catalysed by solid acids // J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1998. V. 1. Pp. 3957-3965.
7. Byrn S.R., Pfeiffer R.R., Stowell J.G. Solid-State Chemistry of Drugs. SSCI, West Lafayette, IN, 1999.
8. Winter G. Polymorphs and solvates of molecular solids in the pharmaceutical industry // Reactivity of Molecular Solids. Ed. Boldyreva, E.V., Boldyrev, V.V. New York a.o.: John Wiley & Sons LTD, 1999. Pp. 241-270.
9. Патент 2264411 (РФ) Способ получения бетулина / Кузнецова С.А., Кузнецов Б.Н., Михайлов А.Г., Левдан-ский В.А. // БИ. 2005. №33.
10. Титце Л., Айхер Т. Препаративная органическая химия. M. 1999. 704 с.
11. Dan Cao, Guoling Zhao, Weidong Yan. Solubilities of betulin in fourteen organic solvents at different temperatures // J. Chem. Eng. Data. 2007. V. 52. Pp. 1366-1368.
12. Дребущак Т.А., Михайленко М.А., Брезгунова M.E., Шахтшнейдер Т.П., Кузнецова С.А. Кристаллическая структура сольвата бетулина с этанолом // Журнал структурной химии. (в печати).
Поступило в редакцию 10 апреля 2009 г.
После переработки 25 марта 2010 г.
