CC BY
41
EXPERIMENTAL ARTICLES
УДК 577(112+25+354.9)+57(085.2+086.2)
ОДЕРЖАННЯ ТА ХАРАКТЕРИСТИКА ФЛУОРЕСЦЕНТНИХ ПОХ1ДНИХ РЕКОМБ1НАНТНОГО АНАЛОГА СЕКРЕТОРНО1 ФОРМИ HB-EGF ЛЮДИНИ
Н. В. Короткевич
А. Ю. Лабинцев 1нститут бюх1мп iM. О. В. Палладша НАН Укра'ши, Кшв
Д. В. Колибо С. В. Ком^аренко
E-mail: gnr.nata@gmail.com
Отримано 21.11.2013
Гепаринзв'язувальний фактор росту, под1бний до етдермального ростового фактора — HB-EGF (Heparin-Binding Epidermal growth factor-like Growth Factor), належить до родини етдермальних ростових фактор1в i синтезуеться у вигляд1 мембранно-заякореного попередника pro-HB-EGF. Зв'язування секреторно! форми фактора sHB-EGF (soluble HB-EGF) з рецепторами EGFR i HER-4 приводить до утворення вiдповiдних л^андрецепторних комплексiв та активаци сигнальних шляхiв, якi вiдiграють важливу роль у регулювант пролiферацü, диференщацй та м^раци клiтин.
Метою роботи було одержання рекомбшантних флуоресцентних похiдних на основ1 повнорозм!рно! форми sHB-EGF людини (mCherry-sHB-EGF) та вкорочено! форми sHB-EGFA84-106 (mCherry-sHB-EGFA84-106), яка б не мiстила гепаринзв'язувально! дiлянки.
Показано здатнiсть обох флуоресцентних похвдних специфiчно зв'язуватись i3 EGFR-рецептором клiтин та рецепторопосередковано iнтерналiзуватися всередину клггини, а також посилювати пролiферацiю клiтин мишi лшй 3Т3. При цьому вщсутшсть гепаринзв'язувально! дiлянки в структур! mCherry-sHB-EGF 84-106 суттево не впливала на його здатшсть зв'язуватись !з рецептором, проте знижувала його мггогенну актившсть майже у два рази. Одержат флуоресцентт похвдт sHB-EGF можуть бути зручним iнструментом для дослщження молекулярних механiзмiв реаизаци бюлопчно! активносм sHB-EGF та рол! гепаринзв'язувально! активносм у процесах взаемодп sHB-EGF з рецептором i подальшого внутршньоклггинного транспортування л^андрецепторного комплексу.
Ключовi слова: гепаринзв'язувальний EGF-подiбний фактор росту (HB-EGF), рецептор етдермального фактора росту.
Гепаринзв'язувальний фактор росту, що под1бний до етдермального фактора росту — HB-EGF (в1д англ.: Heparin-Binding Epidermal growth factor-like Growth Factor) належить до родини етдермальних ростових фактор1в. HB-EGF мае високу афшшсть до гепарину та гепарансульфатпротеоглшашв (ГСПГ) [1]. HB-EGF синтезуеться у вигля-д1 мембранно-заякореного попередника — pro-HB-EGF, який пщ д1ею мембранних ме-талопротешаз може переходити в розчинну форму фактора — sHB-EGF (в1д англ.: soluble HB-EGF). Рецепторами для sHB-EGF е гомо-димери рецептор1в родини етдермальних ростових фактор1в першого (HER-1, EGFR, Human Epidermal Growth Factor Receptor)
i четвертого (HER-4) типу, а також ixm ге-теродимери з HER-2 та HER-3. Зв'язування sHB-EGF з рецептором призводить до утворення л^андрецепторного комплексу sHB-EGF/EGFR i активацii сигнальних шляхiв, якi вiдiграють вирiшальну роль у регулю-ваннi пролiферацii, диференцiацii, м^рацп та iнгiбуваннi апоптозу клiтин, що е вкрай важливим за злояшсних перетворень [2].
Вiдомо, що утворений тсля зв'язування sHB-EGF iз рецептором л^андрецепторний комплекс sHB-EGF/EGFR у подальшому зазнае лiзосомальноi деградацii або «ресай-клингу» (receptor recycling), тобто повторно* появи рецептора на поверхт плазматично! мембрани [3]. З другого боку, дослщження
останшх рошв виявили здатшсть EGF, TGF-a пiсля зв'язування з EGFR стимулю-вати транслокацiю л^андрецепторного комплексу в ядро, де останнш за наявноста кшазно! активностi EGFR виконуе функцп регулятора транскрипцiï шляхом фосфори-лювання низки ядерних протешв, що сприяе посиленню прoлiферативнoгo статусу клггини [4]. Отже, пiсля утворення л^андрецепторно-го комплексу sHB-EGF/EGFRr можуть реаль зуватись декiлька сценарiïв його внутршньо-клiтиннoгo транспортування. Так, можлива повна лiзoсoмальна деградацiя лiганду та рецептора або часткова деградащя лише л^ан-ду з наступним «ресайклшгом» рецептора на поверхню клггини. Не менш цiкавим е досль дження можливих шляхiв транспортування власне л^андрецепторного комплексу до ядра клггини. Наразi немае фактичних вiдoмoстей щодо здатнoстi sHB-EGF iндукувати ядерну транслокащю EGFR, проте pro-HB-EGF вияв-ляе ядерну локатзащю у клiтинах пухлин i тканин, що активно прoлiферують [5].
Таким чином, створення молекулярних iнструментiв е важливим для дослщження здатнoстi розчинно! форми HB-EGF люди-ни iндукувати ядерну транслокащю EGFR та виявлення шляхiв транспортування sHB-EGF/EGFR лiгандрецептoрнoгo комплексу. Осшльки суттевою вiдмiннiстю sHB-EGF вiд шших ростових фактoрiв е його здатшсть взаемoдiяти iз поверхневими ГСПГ, що може впливати на його здатшсть шдукувати ядерну транслокащю EGFR та на внутршньо-клггинне транспортування sHB-EGF/EGFR лiгандрецептoрнoгo комплексу, для прове-дення дoслiджень можна застосувати такий методичний шдхщ, як створення «вкороче-ноЪ> форми sHB-EGF, яка була би позбавлена здатноста взаемoдiяти з гепарином та ГПСГ.
Метою роботи було одержання функщо-нально активних флуоресцентних похщних на oснoвi пoвнoрoзмiрнoï розчинно! форми sHB-EGF людини та «вкороченоЪ» sHB-EGFA84_106, яка б не метила гепаринзв'я-зувально! дiлянки. Також було проведено дослщження мoжливoстi використання !х для вивчення молекулярних механiзмiв реа-лiзацiï бюлопчно! активнoстi секреторно'1 форми HB-EGF людини, пoрiвняльнoгo ана-лiзу експресп рецептoрiв EGFR i HER-4 на поверхш клiтин рiзних типiв та походжен-ня, а також внутрiшньoклiтинних шляхiв транспортування лiгандрецептoрнoгo комплексу sHB-EGF/EGFR та участа гепаринзв'я-зувально! д^янки у цих процесах.
Матерiали i методи
МатерЬали. У po6oTi було використано TaKi реактиви: культуральне середовище RPMI-1640 з L-глутaмiном, фетальна сиро-ватка велико'! рогато! худоби, пенщилш, стрептомiцин, амфотерицин В (антимшо-тик), моноклональш aнтитiлa проти EGFR людини, FITC-кон'юговаш вториннi антитала до Fc-фрaгментiв aтитiл мишi, кон'югова-ш з пероксидазою хрону, вториннi антитала до Fc-фрагментав aтитiл мишi (Sigma, США), праймери, iмiдaзол, живильне середовище LB, диметилформамщ (ДМФА), MgCl2, Taq-полiмерaзa, вiльнa вiд нуклеаз вода, ен-донуклеази рестрикцп BamHI, XhoI, EcoRI, PstI, ДНК-лiгaзa Т4, лужна фосфатаза, на-бiр для вид^ення ДНК, iзопропiл-ß-D-тiо-гaлaктопiрaнозид (IPTG), протеiновi марке-ри молекулярно! маси в дiaпaзонi вiд 10 до 180 кДа, ДНК-маркери молекулярно! маси в дiaпaзонi вiд 100 до 10000 п. н. (Fermentas, Литва), Ni-NTI-агароза (Qiagen, ФРН), де-зоксирибонуклеотидтрифосфати (dNTPs), нiтроцелюлозa Hibond C-Extra (Amersham, США), вектор рЕТ-28а(+) (Novagen, ФРН), вектор pmCherry (ClonTech, США), штроце-люлоза Hibond C-Extra (Amersham, США).
Обладнання. У робота застосовували таке обладнання: конфокальний мiкроскоп Carl Zeiss LSM 510 Meta (Carl Zeiss, ФРН), про-токовий цитофлуориметр Coulter Epics XL (Beckman Coulter, США), ламшарш шафи II рiвня бiобезпеки (ESCO, Сшгапур), термоци-клер AB2720 (Applied Biosystems, США), елек-тропоратор Electroporator 2510 (Eppendorf, ФРН), трaнсiлюмiнaтор Vilber Lourmat TFX-20.LM та пристрш для документацп гелiв Vilber Lourmat DP-001.FDC (Vilber Lourmat, Фран-щя), ультразвуковий дезiнтегрaтор Labsonic M (Sartorius, ФРН), центрифуга MLW T23D (ELMI, ФРН), пристрш для вертикального електрофорезу Mini-Protein II Electrophoretic Cell (Bio-Rad, США), пристрш для горизонтального електрофорезу (Helicon, Ройя), елек-троблотер Hoefer ТЕ77 (Amersham, США).
Штами-продуценти i клтинт лти. У дослщженнях використано одержаний нами рекомбшантний аналог розчинно! форми sHB-EGF людини зi створеного раш-ше штаму-продуцента Е. coli [6]. Видiлення sHB-EGF та анаттичну експресiю проте!но-вих продуктав проводили як описано у [6]. Кттинш культури ембрiонaльних фiбро-блaстiв мишi 3Т3 та ешдермощно! карци-номи пiхви людини А431 отримали з банку клггинних лшш 1нституту експеримен-
тально! патологи, онкологи та радюбюлоги iM. Р. G. Кавецького НАН Укра'ши.
Культивування клЬтин евкарЬотЬв. Кль тини культивували за стандартних умов у культуральному середовищД RPMI-1640 з додаванням 5-10%-ï сироватки ембрюшв телят за 5% концентрацiï СО2.
Створення генетичних конструкцш pET-28a(+)-mCherry-sHB-EGF та pET-28a(+)-mCherry-sHB-EGFA84-106 на основЬ експресшного вектора та отримання кло-тв-продуцентЬв вЬдповЬдних флуоресцентних похЬдних. Для створення вищезазначе-них генетичних конструкцш як джерело нуклеотидно! послщовноста, яка кодуе мо-номерний червоний флуоресцентний проте-ш mCherry, було обрано плазмщний вектор pmCherry. Як джерело нуклеотидно! посль довностi повнорозмiрноï (sHB-EGF) та вкоро-чено! (sHB-EGFA84-106) форм sHB-EGF люди-ни обрали рашше одержану нами генетичну конструкщю pUC-19-sHB-EGF [7]. Напра-цювання нуклеотидних послщовностей, як1 кодують флуоресцентний протеш mCherry, повнорозмiрну (sHB-EGF) та вкорочену (sHB-EGFA84-106) форми sHB-EGF людини проводили за допомогою ПЛР з використанням спе-цифiчних пар праймерiв (таблиця). Одержан в результата проведення ПЛР нуклеотидш послiдовнiстi sHB-EGF та sHB-EGFA84-106 об'ед нал и з нуклеотидною послщовшстю mCherry через сайт рестрикци EcoRI для sHB-EGF та PstI для sHB-EGFA84-106. Для одержання об'еднаних нуклеотидних посль довностей mCherry-sHB-EGF та mCherry-sHB-EGFA84-106 ПЛР проводили iз праймерами Sence mCherry та Antisence sHB-EGF.
Нуклеотидш послщовност mCherry-sHB-EGF та mCherry-sHB-EGFA84-106 об'ед-нували з нуклеотидною послщовшстю експресшного векторарЕТ-28а(+), обробляючи ендонуклеазами рестрикци BamHI та XhoI з подальшим лиуванням. Пщ час проведення вищезазначених маншуляцш з ДНК дотримувались рекомендацш виробника ен-
зимiв. За трансформацiï клiтин E. coli шта-му DH10B одержаними генетичними кон-струкцiями рЕТ-28а(+)-mCherry-sHB-EGF та рЕТ-28а(+)-mCherry-sHB-EGFA84-106 за-стосовували метод електропораци з наступ-ним висiванням на тверде живильне середо-вище LB (триптону — 10 г/л, дрiжджового екстракту — 5 г/л, NaCl — 10 г/л) з 15 г/л агару, яке метило 0,005% канамщину, що слугував селективним агентом [8]. Колони кл^ин перевiряли на наявшсть нуклеотидних послiдовностей mCherry-sHB-EGF та mCherry-sHB-EGFA84-106 у складi вектора за допомогою ПЛР з використанням пари прай-мерiв, що фланкують ген mCherry на 5'-кш-щ та ген sHB-EGF/sHB-EGFA84-106 — на 3/-кiнцi. Результатом проведення ПЛР був продукт, який мав у своему складi нуклеотидш послщовност обох гешв. Колонiï, що мiстили вектор рЕТ-28а(+) зi вставками нуклеотидних послщовностей mCherry-sHB-EGF та mCherry-sHB-EGFA84-106, нарощу-вали у рiдкому живильному середовищД LB з додаванням селективного агента i засто-совували у подальшому для напрацювання отриманих генетичних конструкцш. Для одержання клошв-продуцентав проте'шових продуктав рекомбiнантних флуоресцентних похiдних sHB-EGF та sHB-EGFA84-106 проводили електропорацiю експресшного штаму E. coli Rosetta DE3 генетичними конструк-цiями рЕТ-28а(+)-mCherry-sHB-EGF та рЕТ-28а(+)-mCherry-sHB-EGFA84-106 .
Аналтична експресЬя протетових про-дуктЬв флуоресцентних похЬдних mCherry-sHB-EGF та mCherry-sHB-EGFA84-106. Кль тини клошв-продуцентав E. coli Rosetta DE3 вийвали у рщке живильне середовище LB з додаванням 2% глюкози та шкубували за 37 °С в умовах штенсивно! аераци до досяг-нення культурою оптично! густини 0,5-0,7 за OD600. Для шдукци експресiï рекомбшант-них протеïнiв додавали iзопропiл-ß-D-тiо-галактопiранозид (IPTG) у концентраци 1мМ. Iндукцiю експресiï проводили протя-
Одержання нуклеотидних послiдовностей, якi кодують флуоресцентний протеш mCherry, noBHopo3MipHy (sHB-EGF) та вкорочену (sHB-EgFA84-106) форми sHB-EGF людини за допомогою ПЛР з використанням специфiчних пар праймерiв
Sence sHB-EGF 5— GGATCCATGGACTTGCAAGAGGCAGATC -3'
Sence sHB-EGF A84-106 5— CTGCAGTTCTCTCGGCACTGGT -3'
Antisence sHB-EGF 5— CTCGAGTCAGAGGCTCAGCCCATG -3'
Sence mCherry 5'- GAAGGATCCACCATGGTGAGCAAGGG -3'
Antisence mCherry 5— CCAGACGTCTTTGTACAGCTCGTCCATGCC -3'
ПримЬтка: * — шдкреслено сайти щеплення ендонуклеаз рестрикцiï.
гом 3 год при 30 °С. Для проведення аналь зу експресп проте'шв готували розчинну й нерозчинну фракцп з подальшим електро-форезом у ПААГ. Шсля напрацювання 2 мл кл^инно' бiомаси осаджували центрифугу-ванням при 10 000 g. Осад ресуспендували у забуференому фосфатному розчиш (ЗФР), концентруючи його в 20 разiв, i обробляли ультразвуковим дезштегратором. Залишки клiтин вiдокремлювали центрифугуванням при 10 000 g. Супернатант м^тив розчинну фракцiю протеiнiв E. coli, зокрема й щльо-вого протешу, а осад — нерозчинну. Kni-тинний осад промивали 1% Triton-X100 та ресуспендували у ЗФР. Аналiз проте'нових фракцiй здiйснювали за допомогою електро-форезу в 10% ДСН-ПААГ з використанням трис-HCl буферно'' системи та додаванням трицину [9]. Застосовували маркери моле-кулярно'! маси в дiапазонi вiд 10 до 180 кДа. Проби для електрофорезу готували з дода-ванням буфера для зразшв (40 мг ДСН, 0,48 г сечовини, 50 мкл ß-меркаптоетанолу, 1-2 мкл бромфенолового синього на 1 мл буферного розчину), ям попередньо прорвали за тем-ператури 70-75 °С протягом 20-30 хв.
Видшення рекомбшантних протегтв sHB-EGF, mCherry-sHB-EGF i mCherry-sHB-EGFA84_106 та 'ix очищення. Нарощення кль тинно'! бiомаси та шдукщю експресii проводили за описаною вище методикою. Пiсля цього кл^инну бiомасу осаджували центрифугуванням при 10 000 g, осад ресуспендували в 5 мл буферного розчину, що м^тив 0,3 M NaCl, 20 мМ Tris-HCl, 1мМ DTT та 6 М сечовини, рН 8,0. Отриману кл^инну бюма-су обробляли ультразвуковим дезштеграто-ром. Залишки кл^ин вiдокремлювали центрифугуванням при 13 000 об/хв протягом 25 хв. Супернатант наносили на попередньо врiвноважену колонку з Ni-NTI-агарозою. Для виконання процедури рефолдингу колонку iз сорбованим проте'ном промивали буферним розчином того самого складу, але з градieнтом сечовини (8, 6, 4, 2 та 1 М), до-даючи 10 мМ iмiдазолу. Елющю протешу проводили 400 мМ iмiдазолом. З метою ство-рення умов для формування дисульфщних зв'язкiв до елюйованого протешу додавали вiдновлений та окиснений глутатаон у кон-центрацп 6 мМ i 1,2 мМ вщповщно. Для по-дальшого використання проте'н дiалiзували проти ЗФР (0,8% NaCl, 0,25% KCl, 0,144% Na2HPO4 та 0,024% KH2PO4, рН 7,2). Ана-лiз проте'нових фракцiй у 10% ДСН-ПААГ здшснювали за описаною вище методикою.
Одержання iMyHHOï сироватки мишей проти sHB-EGF людини. 1мушзащю мишей лшп Balb/c проводили одержаним рашше рекомбiнантним аналогом sHB-EGF людини
3 використанням повного i неповного ад'ю-ванту Фрейнда [10].
Вестерн-блот-аналiз. Перенесення про-те!шв i3 ПААГ на штроцелюлозу здшсню-вали за допомогою електроблотера. Шт-роцелюлозну мембрану попередньо витри-мували у буферному розчиш для перенесення (25 мМ Tris, 0,1% ДСН, 20% метилового спирту, 192 мМ глщину) протягом шлькох хвилин. Шсля перенесення мембрану витри-мували в 1%-му розчиш знежиреного молока в ЗФР за температури 37 °С упродовж 1 год. Шсля промивання штроцелюлозну мембрану витримували за тих самих умов у розчиш полшлонально! сироватки мишi в розведенш 1:400 у твш-фосфатному буфе-рi (ТФБ), що являв собою ЗФР з додаванням 0,04% Tween 20. Як вторинш антитала використовували моноклональш антитала проти Fс-фрагментiв iмуноглобулiнiв мишi в розведенш 1:10 000. Проявлення штроце-люлозно! мембрани здiйснювали протягом шлькох хвилин у розчинi для забарвлення, що м^тив 0,07% дiамiнобензидинтетрагiд-рохлориду (ДАБ) та 0,035% H2O2 в ЗФР.
Конфокальна мтроскотя. Кттини виро-щували до досягнення 70-90% конфлюент-ного стану, потiм пересiвали на попередньо знежиреш покривнi скельця та культивува-ли ще 24 год. Перед забарвленням клггини промивали розчином RPMI-1640. Зразки за-барвлювали у RPMI-1640, додаючи вщповщ-нi флуоресцентш похiднi (mCherry-sHB-EGF та mCherry-sHB-EGFA84-106) у концентрацп 10 мкг/мл або моноклональш антитала проти рецептора EGFR (1:2 000), попередньо шкубоваш з FITC-мiченими антиталами кози проти Fc-фрагментав iмуноглобулiнiв мишi (1:1 000), шсля цього шкубували при 37 °С протягом 15 хв. Перед фшсащею зразки двiчi промивали ЗФР. Фшсащю зразкiв проводили 5%-м параформальдегщом у на-трiйфосфатному буферi. Шсля цього зразки промивали ЗФР та дистильованою водою. На кожен препарат кл^ин наносили 25 мкл DABCO-PVA для подальшого збереження та аналiзу. До проведення конфокально'1 мiкроскопiï зразки зберпали в темрявi при
4 °С. Колокалiзацiю флуоресцентних мiток FITC (зелений канал) та mCherry (червоний канал) визначали iз застосуванням програм-ного забезпечення Fiji (http://fiji.sc/Fiji).
МТТ-тест. Кттини 3Т3 нарощували до конфлуентного стану в 96-лункових планшетах. Перед внесенням рекомбшантних флуоресцентних похщних клггини промивали ЗФР та замшювали на безсироваткове середовище iз додаванням рекoмбiнантних протеШв у кoнцентрацiï 1 мкг/мл та куль-тивували за стандартних умов упродовж вщ-пoвiдних прoмiжкiв часу. Далi культураль-не середовище замшювали на нове, додавали МТТ-реагент [3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] у вщповщ-нш до рекoмендацiй виробника кoнцентрацi'ï та шкубували протягом 4 год за стандартних умов. Шсля цього середовище обережно вщ-бирали, додавали буфер для лiзису (90%-й диметилсульфоксид — ДМСО, 0,1% доде-цилсульфат натрт — ДСН) та iнкубували ще 5 хв за умов штенсивного струшування. Оптичне поглинання розчину вимiрювали за довжини хвиль 545 (тест) i 630 нм (контроль).
Результати та обговорення
Створення генетичних конструкцш pET-28a(+)-mCherry-sHB-EGF i pET-28a(+)-mCherry-sHB-EGFA84-106 та одержання кло-тв-продуцентЬв вЬдповЬдних флуоресцентних похЬдних. Для створення генетичних конструкцш pET-28a(+)-mCherry-sHB-EGF та pET-28a(+)-mCherry-sHB-EGFA84-106 було одержано ПЛР-продукти об'еднаних нукле-отидних послщовностей mCherry-sHB-EGF i mCherry-sHB-EGFA84-106 з використанням вщповщних пар праймерiв (рис. 1, А). Шсля цього нуклеотидш послщовност mCherry-sHB-EGF i mCherry-sHB-EGFA84-106 об'едну-вали за сайтами рестрикцп BamHI та XhoI iз пoслiдoвнiстю експресiйнoгo вектора pET-
28a(+). У результатi було одержано генетич-нi конструкцп pET-28a(+)-mCherry-sHB-EGF та pET-28a(+)-mCherry-sHB-EGFA84-106 для подальшо! трансформацп клiтин E. coli штаму DH10B (рис. 1, Б).
Експресгя, видшення та очищення рекомбшантних протегтв mCherry-sHB-EGF та mCherry-sHB-EGFA84-106. Шсля трансфор-мування клиин E. coli штаму Rosetta (DE3) генетичними конструкщями pET-28a(+)-mCherry-sHB-EGF та pET-28a(+)-mCherry-sHB-EGFA84-106 серед трансформантав було ввдбрано oкремi клони для проведення експресп вщповщних рекoмбiнантних прoтеïнiв та подальшого вестерн-блoт-аналiзу з метою шдтвердження наявнoстi в лiзатi бактерiаль-них клиин цiльoвoгo продукту. Результати проведення вестерн-блот-анатзу з використанням полшлонально! сироватки мишей, iмунiзoваних sHB-EGF людини, шдтвердили наявнiсть у складi бактерiальних клгтин-про-дуцентiв цiльoвoгo проте'шового продукту (рис. 2).
За даними л^ератури, sHB-EGF мае ано-мальну електрофоретичну рухлив^ть, що пов'язано з наявшстю багато! на лiзин гепа-ринзв'язувально! дiлянки у структурi sHB-EGF, яка за нейтральних значень рН несе позитивний заряд [11]. Рекомбшантний аналог sHB-EGF людини внаслщок аномально'1 електрофоретично! рухливoстi мав на 4,5 кДа «вищу молекулярну масу», за даними елек-трофорезу та iмунoблoтингу, що становила « 18 к Да заметь теоретично розраховано'1 13,5 кДа. Аномальну електрофоретичну рух-ливiсть також мали флуoресцентнi пoхiднi: 55 кДа для mCherry-sHB-EGF заметь теоретично розраховано! 50 кДа та 45 кДа для mCherry-sHB-EGFA84-106 замiсть 40 кДа.
А
mChcrrv
рЕТ-2Яа mChcrry-sHB-ECKAM-iM
RCÏFm-iOb
Рис. 1. А — схематичне зображення генетичних конструкцш на 0CH0Bi бактершного експресiйного
вектора рЕТ-28а(+), що кодують рекомбiнантнi флуоресцентнi похiднi sHB-EGF людини: mCherry-sHB-EGF та mCherry-sHB-EGFA84_106; Б — електрофореграма ПЛР-продуктав об'еднаних нуклеотидних послщовностей mCherry-sHB-EGF та mCherry-sHB-EGF A84-106: 1 — mCherry-sHB-EGF A84-106; М — маркери довжини нуклеотидних фрагменив; 2 — mCherry-sHB-EGF
nW
52 «
II i
10»
34 261
-mCherry-sHB-EGF -mCheny-sHB-EGFA«.!«.
- rsHB-EGF
Рис. 2. Вестерн-блот-аналiз лiзатiв бактерiальних клiтин клонiв-продуцентiв рекомбiнантнтних флуоресцентних похщних mCherry-sHB-EGF та mCherry-sHB-EGFA84-106 (детекцiя полжлональною сироваткою мишi, iмунiзованою рекомбiнантним sHB-EGF): 1 — маркери молекулярноï маси; 2 — mCherry-sHB-EGFA84-106; 3 — mCherry-sHB-EGF; 4 — рекомбшантний аналог sHB-EGF людини
Для подальшого використання рекомбь нантнi протеши вид^яли з розчинно! фракцi'ï за допомогою афшного сорбенту Ni-NTI-агаро-зи. Дисульфщш зв'язки у складi EGF-подiбно-го домену молекул sHB-EGF та sHB-EGF A84-106 вщновлювали з використанням сумiшi окис-неного i вiдновленого глутатюну, яку додавали до препарату протешу тсля попереднього етапу вид^ення. Чистоту отриманого препарату перевiряли електрофоретично.
Вихiд розчинних рекомбiнантних про-тешв mCherry-sHB-EGF та mCherry-sHB-EGFA
'84-106
становив 2,1 мг i 3,5 мг вщповщно у перерахунку на 1 л бактерiальноï культури.
ДослЬдження бюлогЬчно'г активностг одержаних флуоресцентних похЬдних ре-комбтантного аналога sHB-EGF людини. Флуоресцентш похщш можна застосовува-ти для дослщження здатност секреторно'1 форми HB-EGF людини шдукувати процеси ядерно! транслокаци рецептора EGFR, про-цейв внутрiшньоклiтинного транспорту-вання лiгандрецепторного комплексу sHB-EGF/EGFR та ролi гепаринзв'язувально'1 дiлянки в механiзмах реалiзацiï бюлопчно'! активностi sHB-EGF. З огляду на це перевь ряли бiологiчну актившсть mCherry-sHB-EGF та mCherry-sHB-EGFA84-106, зокрема !хню здатнiсть специфiчно зв'язуватись ie рецептором EGFR на поверхш клiтин А431. Клiтини епiдермоïдноï карциноми людини А431 експресують рецептор EGFR у великш шлькоста i е класичною моделлю для досль дження бюлопчно! дiï ростових факторiв, що слугують лиандами для EGFR, та меха-нiзмiв !х участi у процесах канцерогенезу. Для шдтвердження здатност флуоресцентних похiдних mCherry-sHB-EGF та mCherry-
sHB-EGFA84
106 специфiчно взаемодiяти ie рецептором EGFR було використано моно-клональнi антитiла мишi проти позаклггин-ного домену EGFR. Слiд зазначити, що згщно з iнструкцiею виробника зв'язування анти-тiл iз позакл^инним доменом EGFR не пере-шкоджае прояву його здатностi зв'язувати позакл^инш лiганди. Вторинними антить лами слугували мiченi FITC антитiла проти Fc-фрагментав iмуноглобулiнiв мишi. Отже, е можлив^ть вiзуалiзувати лiгандрецептор-ний комплекс mCherry-sHB-EGF/EGFR або mCherry-sHB-EGFA84-106/EGFR, який утво-рився пiсля зв'язування флуоресцентних похщних iз рецептором. Шсля додавання до культурального середовища антитал та флуоресцентних похiдних sHB-EGF клгтини iнкубували протягом 15 хв при 37 °С за 5%-ï концентраци CO2 в атмосферi з метою створення сприятливих умов для життедiяльнос-ть Препарати для конфокально! мiкроскопi'ï готували як описано в роздШ «Матерiали i методи». Анатз препаратiв дав змогу вияви-ти колокалiзацiю двох мiток: зелено! (FITC) мгтки рецептора та червоно! (mCherry)^i-ганда у внутрiшньоклiтинних везикуляр-них структурах (жовтий колiр, утворений колокатзащею двох мiток), що свiдчить про здатшсть mCherry-sHB-EGF та mCherry-sHB-EGF A84-106 специфiчно зв'язуватись iз рецептором EGFR (рис. 3). Як показують конфо-кальш знiмки, утворений лiгандрецепторний комплекс мав здатшсть iнтерналiзуватись у кл^ину. Таким чином, результати конфо-кально! мiкроскопiï вказують на наявнiсть бюлопчно! активностi отриманих рекомбь нантних флуоресцентних похщних, зокрема !хню здатнiсть специфiчно зв'язуватись iз рецептором EGFR та шдукувати його подальшу iнтерналiзацiю в клiтину. Слiд зазначити, що вщсутшсть гепаринзв'язувального домену в складi mCherry-sHB-EGFA84-106 не впливала на здатшсть флуоресцентного похщного вза-емодiяти з рецептором EGFR.
Вщомо, що sHB-EGF е активним миоге-ном та хемоатрактантом для багатьох типiв клгтин. Тому наступним етапом роботи було дослщження здатноста одежаних рекомбь нантних флуоресцентних похщних стимулю-вати пролiферацiю клiтин. 1з цiею метою нами було проведено дослщження з використанням МТТ-тесту i клгтин 3Т3. За культивування клi-тин до ростового середовища додавали реком-бiнантнi флуоресцентнi похщш mCherry-sHB-EGF та mCherry-sHB-EGFA84-106 у концентраци 1 мкг/мл вщповщно. Результати МТТ-тесту свщ-
Рис. 3. Конфокальш зшмки препаратiв клггин А431, забарвлених флуоресцентними похiдними sHB-EGF:
mCherry-sHB-EGF та mCherry-sHB-EGFA84-106 — червоний канал; FITC-EGFR — зелений канал; накладання — об'еднане зображення по зеленому та червоному каналах; колокалiзацiя — накладання флуоресцентних м^ок по зеленому та червоному каналах (бший колiр)
чать про мггогенну актившсть флуоресцентних похiдних (рис. 4). Проте флуоресцентне похiдне mCherry-sHB-EGFA84
106, iмовiрно, мае значно меншу мiтогенну активнiсть, шж mCherry-sHB-EGF. Можна припустити, що вщсутшсть гепа-ринзв'язувально! дiлянки у склада sHB-EGF призводить до зниження його мггогенного по-тенцiалу. На тдсташ даних МТТ-тесту можна зробити висновок про можливiсть використан-ня рекомбшантних флуоресцентних похiдних
Дш КУЛЬТ 11ВЯЦ11
Рис. 4. Залежшсть кiлькостi клiтин вщ часу культивування з рекомбiнантними флуоресцентними похщними за результатами МТТ-тесту з використанням кл^ин 3Т3
mCherry-sHB-EGF i mCherry-sHB-EGFA84-106 в експериментах, спрямованих на дослiдження механiзмiв реалiзацiï бюлопчно! активности sHB-EGF людини та ролi гепаринзв'язувально'1 дiлянки у цих процесах.
Таким чином, у результатi проведено'1 роботи створено бiологiчно активнi реком-бiнантнi флуоресцентнi похiднi секреторно'1 форми sHB-EGF людини mCherry-sHB-EGF та mCherry-sHB-EGFA84-106 i показано можли-вють !х використання у дослiдженнях молеку-лярних механiзмiв реалiзацiï бiологiчноï ак-тивностi sHB-EGF i ролi гепаринзв'язувально'1 активностi у процесах зв'язування sHB-EGF з рецептором та внутршньоклиинного тран-спортування лiгандрецепторного комплексу.
REFERENCES
1. Higashiyama S., Abraham J. A., Miller J., Fiddes J. C, Klagsbrun M. A heparin-binding growth factor secreted by macrophage-like cells that is related to EGF. Science. 1991, 251(251), 936-939.
2. Higashiyama S., Nanba D. ADAM-mediated ectodomain shedding of HB-EGF in receptor cross-talk. Biochim Biophys Acta. 2005, 1751(1), 110-117.
3. Roepstorff K., Grandal M. V., Henriksen L., Knudsen S. L., Lerdrup M., Gr0vdal L, Willum-sen B. M., van Deurs B. Differential effects of EGFR ligands on endocytic sorting of the receptor. Traffic. 2009, 10(8), 1115-1127.
4. Lin S.Y., Makino K, Xia W., Matin A., Wen Y., Kwong K. Y., Bourguignon L., Hung M. C. Nuclear localization of EGF receptor and its potential new role as a transcription factor. Nat Cell Biol. 2001, 3(9), 802-808.
5. Kim J., Adam R. M., Freeman M. R. Trafficking of nuclear heparin-Binding epidermal growth factor-like growth factor into an epidermal growth factor receptor-dependent autocrine loop in response to oxidative stress. Cancer Res. 2005, 65(18), 8242-8249.
6. Korotkevych N. V., Kolybo D. V., Labyn-tsev A Ju., Romaniuk S. I,, Komisarenko S. V.
Obtaining of recombinant human hepa-rin-binding EGF-like growth factor and perspectives of its application in biotechnology. Biotechnologiya. 2010, 5(4), 44-54. (In Ukrainian).
7. Korotkevych N. V., Labyntsev A. Ju., Kaber-niuk A. A., Oliinyk O. S., Romaniuk S. I., Koly-bo D. V., Komisarenko S. V. Cytotoxicity of the B subunit of diphtheria toxin to human histocytic lymphoma U937. Ukr. Biokhim. Zh. 2009, 81(4), 69-80. (In Ukrainian).
8. Dower W. J., Miller J. F., Ragsdale C. W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 1988, 16(13), 6127-6145.
9. Schagger H., von Jagow G. Tricine-sodium do-de cyl sulfate-polyacrylamide gel electro pho re sis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 1987, 166(2), 368-379.
10. Harlow E., Lane D. Antibodies: a laboratory manual. N. Y.: Cold Spring Harbor Laboratory. 1988,726 p.
11. Higashiyama S., Lau K. E., Besner G. A., Abraham J., Klagsbrun M. Structure of heparin-binding EGF-like growth factor. Multiple forms, primary structure, and glycosylation of the mature protein. J. Biol. Chem. 1992, 267(9), 6205-6212.
ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА СЕКРЕТОРНОЙ ФОРМЫ HB-EGF ЧЕЛОВЕКА
Н. В. Короткевич А. Ю. Лабынцев
Д. В. Колибо С. В. Комисаренко
1нститут биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев
E-mail: gnr.nata@gmail.com
Гепаринсвязывающий фактор роста, подобный эпидермальному ростовому фактору — HB-EGF (Heparin-Binding Epidermal growth factor-like Growth Factor), относится к семейству эпидермальных ростовых факторов и синтезируется в виде мембранно-заякорен-ного предшественника pro-HB-EGF. Связывание секреторной формы фактора — sHB-EGF (soluble HB-EGF) с рецепторами EGFR и HER-4 приводит к образованию соответствующих лигандрецепторных комплексов и активации сигнальных путей, которые играют важную роль в регулировании пролиферации, дифференциации и миграции клеток.
Целью работы было получение рекомби-нантных флуоресцентных производных на основе полноразмерной секреторной формы sHB-EGF человека (mCherry-sHB-EGF) и укороченной формы sHB-EGFA84-106 (mCherry-sHB-EGFA84-106), которая не содержала бы ге-паринсвязывающей области.
Показана способность обоих флуоресцентных производных специфически связываться с EGFR-рецептором клеток и рецепторопосредо-ванно интернализироваться внутрь клетки, а также усиливать пролиферацию клеток мыши линии 3Т3. При этом отсутствие гепарин-связывающего участка в структуре mCherry-sHB-EGFA84-106 существенно не влияло на его способность связываться с рецептором, однако снижало его митогенную активность почти в два раза. Полученные флуоресцентные производные sHB-EGF могут быть удобным инструментом для исследования молекулярных механизмов реализации биологической активности sHB-EGF и роли гепаринсвязывающей активности в процессах взаимодействия sHB-EGF с рецептором, а также дальнейшего внутриклеточного транспортирования лигандре-цепторного комплекса.
Ключевые слова: гепаринсвязывающий EGF-подобный фактор роста (HB-EGF), рецептор эпидермального фактора роста.
OBTAINING AND CHARACTERIZATION
OF RECOMBINANT FLUORESCENT DERIVATIVES OF SOLUBLE HUMAN HB-EGF
N. V. Korotkevich A. Ju. Labyntsev
D. V. Kolibo S. V. Komisarenko
Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: gnr.nata@gmail.com
Heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF) belongs to the epidermal growth factor receptor family and is synthesized as a transmembrane precursor proHB-EGF. Binding of sHB-EGF with receptors EGFR and HER-4 results in formation of ligand-receptor complexes and activation of signaling pathways and thereby promotes survival, proliferation and migration of cells.
The aim of the study was to obtain the recombinant fluorescent derivatives of full-length soluble sHB-EGF — mCherry-sHB-EGF and truncated sHB-EGFA84-106 (without heparin-binding domain) — mCherry-sHB-EGFA84-106. The recombinant fluorescent derivatives may be used to investigate the sHB-EGF binding with receptors EGFR and HER-4, intracellular transportation of ligand-receptor complexes and the role of sHB-EGF heparin-binding domain in sHB-EGF biological activity.
It was shown the ability of both fluorescent derivatives specifically bind to EGFR, to internalize in receptor-mediated pathway and to enhance the proliferation of 3T3 cells. Absence of heparin-binding domain in structure of mCherry-sHB-EGFA84-106 significantly did not effect on its ability to bind with receptor, but decreased twice its mitogenic activity. Thus, obtained fluorescent derivatives of sHB-EGF could be a convenient tool for investigation of molecular mechanisms of sHB-EGF biological activity and role of heparin-binding domain in these processes.
Key words: heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF), epidermal growth factor receptor.
