CC BY
56
УДК 616-003.725
Получение и характеристика биологически активных препаратов из муки крупного рогатого скота
Мацкова Людмила Валентиновна, PhD, доцент кафедры «Бионанотехнология» e-mail: liudmila.matskova@ki.se
Институт живых систем, Балтийский федеральный университет им. И. Канта, г. Калининград,
Кемеровский государственный университет, г. Кемерово,
Karolinska Institutet, Department of Microbiology, Tumor and Cell Biology (MTC),
Stockholm, Sweden
Асякина Людмила Константиновна, кандидат технических наук, младший научный сотрудник
e-mail: alk_kem@mail.ru
Кемеровский государственный университет, г. Кемерово
Чупахин Евгений Геннадьевич, биолог e-mail: chupakhinevgen@gmail.com
Институт живых систем, Балтийский федеральный университет им. И. Канта, г. Калининград
Бабич Ольга Олеговна, доктор технических наук, доцент, директор института e-mail: oobabich@kantiana.ru
Институт живых систем, Балтийский федеральный университет им. И. Канта, г. Калининград,
Кемеровский государственный университет, г. Кемерово
Аннотация. Проблема стареющего населения актуальна для всего мира и для России в частности. Объектом исследований являются протеогликаны костной муки крупного рогатого скота (КМ КРС). В методику выполнения работы входило приготовление экстракта костной муки, раствора кластерного серебра, электрофо-ретическое разделение протеогликанов, определение содержания уроновых кислот в исследуемых препаратах карбазольным методом, определение суммарного содержания полианионов, хондроитиназной активности. Далее проводили высокоэффективную жидкостную хроматографию для фракционирования протеогликанов и ММТ-анализ. Определено, что препарат экстракта из костной муки обладает биологической активностью. Исследуемые препараты, сравнимые по содержанию белка, проверяли на способность оказывать влияние на выживаемость лимфоцитов, В-клеток здорового человека. Исследуемый препарат - экстракт КМ КРС, очищенный с помощью кластерного серебра, продемонстрировал чувствительность к хондроитиназе А, В, С, сравнимую с «Терафлекс» и с химически однородным хон-
дроитином, что позволяет сделать вывод о присутствии хондроитинсульфатов А, В и С в исследуемом препарате. Описан процесс выделения биологически активных компонентов из КМ КРС, которая характеризуется как хондроитин- и гепаран-суль-фаты. Результаты исследований позволили получить биологические препараты из отходов мясного производства, которые обладают биологической активностью и могут позиционироваться как хондропротекторы, аналогичные коммерческим препаратам. Кроме того, как показали исследования на культуре клеток, экстракты могут заменить сыворотку крови животных, самый дорогостоящий реагент при культивировании клеток. Разработка и производство таких препаратов как описываемый экстракт из КМ КРС для научных исследований позволили бы в перспективе заменить дорогостоящий реагент на гораздо более экономичный отечественный аналог, который имеет перспективу быть востребованным.
Ключевые слова: хондропротекторы, хондроитин сульфат, протеогликаны, терафлекс, серебро, наночастицы.
ВВЕДЕНИЕ
Проблема стареющего населения актуальна для всего мира и для России в частности. Согласно официальному демографическому прогнозу, к 2030 г. доля населения в возрасте 65 лет и старше превысит 28 % [1]. Поддержание «активной старости» становится всё более актуальным направлением в развитии медицины, биотехнологии, создании биологически активных препаратов. Остеоартроз является изнурительным возрастным заболеванием, связанным с потерей протеоглика-нов (ПГ) в суставном хряще [2].
Протеогликаны (ПГ) - сложные белково-углеводные молекулы - экспрессиру-ются как на клеточной поверхности, так существуют и вне клеток, являясь основным компонентом во внеклеточном матриксе (ВКМ), присутствующем во всех тканях млекопитающих, играя важную роль в межклеточных сообщениях и общении клеток с ВКМ [3]. Протеогликаны внеклеточного матрикса особенно важны в определении структуры суставного хряща, где ПГ синтезируются в клетках хрящевой ткани, хондроцитах, часть из которых сохраняет способность к самовоспроизведению в течение жизни. Нормально функционирующие хондроциты обеспечивают деятельность суставов в норме и позволяют регенерировать повреждённый хрящ.
ПГ состоят из центрального белка, к которому чаще всего ковалентно присоединены полисахаридные цепи глюкозаминогликанов (ГАГ). ГАГ являются линейными полимерами, состоящими из повторяющихся дисахаридных субъединиц, каждая из которых включает гексозамин ф-глюкозамин или D-галактозамин) и уроновую кислоту ^-глюкуроновую или L-идуроновую).
Каждый дисахарид может подвергаться избирательной модификации по различным положениям (сульфатирование по 2-, 3- и 6-О-положениям и ацетилиро-вание/сульфатирование по ^положению), что приводит к высокому анионному заряду самих дисахаридов и образованной из них углеводной цепи ГАГ и молекулы ПГ в целом. Степень сульфатирования молекулы ГАГ может варьировать в широких пределах (0-4 SO42- групп/дисахарид) и определяет способность ГАГ/ПГ взаимодействовать с широким кругом различных биологически активных лигандов. Максимальный отрицательный заряд ПГ служит причиной связывания большого количества молекул воды, делает их гидрофильными соединениями.
Исследования последних лет выявили существенную роль внеклеточного ма-
трикса в онкогенной трансформации клеток. ВКМ способен предотвращать миграцию раковых клеток, ангиогенез и онкотрансформацию нормальных клеток на раннем этапе. В процессе канцерогенеза происходят значительные нарушения структуры и состава ПГ, которые приводят к нарушению клеточных взаимодействий и инициируют трансформацию нормального ВКМ в опухолевое микроокружение, максимально адаптированное для поддержания роста опухолевых клеток, развития злокачественной опухоли и распространения патологического процесса путем метастазирования.
Исследования последних 20 лет выявили роль и закономерности экспрессии ПГ в ходе развития и старения организма, в нормальной и опухолевой ткани [2, 3]. Протеогликаны являются тканеспецифичными, но не видоспецифичными ингибиторами деления клеток, то есть экстрагируемые факторы из костной муки крупного рогатого скота (КМ КРС) должны оказывать такое же действие и на человеческий организм.
С возрастом баланс синтеза и протеолитической деградации протеогликанов сдвигается в сторону протеолиза, деградации ПГ, что влияет на целостность и функционирование ВКМ и, в конечном счёте, на устойчивость к сжимающим нагрузкам в суставах [2]. Биологическая коррекция дегенерации ВКМ возможна благодаря механическому восстановлению содержания основных компонентов ВКМ до оптимального функционального уровня в ходе замещающей терапии. Протеогликаны (а именно, глюкозамины и хондроитинсульфаты), поставляемые извне, могут рассматриваться как хондропротекторы, в том числе как перспективные ингибиторы роста злокачественных опухолей. В последние несколько лет популярность и распространённость хондропротекторов очень сильно выросла, но сырьё для этих препаратов по-прежнему поставляется в Россию из-за рубежа, что делает актуальным поиск сырья и отработки технологии выделения биологически активных протеогликанов здесь, в России.
Ежегодно в мясной отрасли России образуется около 1 млн т вторичных ресурсов, из которых промышленно перерабатывается около 20 % [4, 5]. Кости составляют существенную часть отходов в мясной промышленности и их переработка - актуальный фокус оптимизации производства мясных продуктов.
Очистку ПГ можно производить основываясь на ряде их свойств, высоком отрицательном заряде, сродству к лектинам и т. д. [6]. Мы описываем здесь процесс выделения биологически активных компонентов из КМ КРС в одну стадию, с использованием раствора кластерного серебра. Кластерное серебро - разновидность коллоидного серебра - получил широкое применение в последнее время, в основном, как бактерицидный препарат в большом разнообразии формулировок и в медицине, и в косметологии. Кластерное серебро также признан как препарат, обладающий противовирусным, фунгицидным и противовоспалительным свойствами [7]. Средний размер первичных кластерных частиц серебра в препаратах составляет от 4-х до 15 нм, в то время как в классических препаратах коллоидного серебра размер частиц варьирует от 10 до 300 и больше нм. Меньший размер частиц серебра повышает эффективность использования серебра и обусловливает устойчивость растворов серебра к выпадению в осадок. По сравнению с массивным серебром и коллоидным серебром, в растворах кластерного серебра развита высокодисперсная поверхность частиц, что значительно облегчает генерацию ионов серебра [8]. Простая и малозатратная технология получения биологически активного вещества содержащего хондроитинсульфаты представляет несомненный ин-
терес для замещающей терапии стареющих суставов.
Мы характеризуем полученный препарат как сравнимый по своим биохимическим качествам и биологической активности с коммерческим препаратом с хондро-протекторными свойствами «Терафлекс» и содержащий биологически активный компонент хондроитинсульфаты.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Приготовление экстракта
КМ КРС была получена из фермерского предприятия «Хозяйство Волкова». Экстракт КМ КРС был приготовлен на физиологическом растворе в концентрации 150 мг/мл в течение ночи при комнатной температуре при регулярном перемешивании. Концентрация была выбрана с учётом максимальной растворимости однородного хондроитин сульфата в 100 мг/мл. Коммерческий препарат «Терафлекс», содержащий хондроитин сульфат и гликозаминогликаны фирмы «Эвалар» и коммерческий препарат хондроитин сульфата были приготовлены в аналогичных условиях и с аналогичной концентрацией. Нерастворимая часть отделялась центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре. Экстракты КМ КРС лиофилизировали для длительного хранения.
Растворы кластерного серебра
AGL-наночастицы кластерного серебра (НОЦ КемГУ), с размером частиц до 5 нм - прозрачная жидкость с желтоватым оттенком, без запаха и с легкой опалес-ценцией. Кластерное серебро добавляли к экстрактам в соотношении объёмов 4:1 и перемешивали в течение 10 мин при комнатной температуре. Частицы серебра и связавшиеся с ними факторы отделяли центрифугированием в течение 10 мин при 10000 об/мин при комнатной температуре. Осадок ресуспендировали в 2-х кратном объёме буфера для нанесения образцов на полиакриламидный гель. Смешивали равные объёмы надосадочного раствора с 2-х кратным буфером для нанесения образцов на полиакриламидный гель. Белки денатурировали 5 мин при 96 °С. По 20 мкл полученных образцов наносили на полиакриламидные гели и анализировали после электрофоретического разделения окрашиванием 0,1 % раствором толу-идинового синего, красителем, специфически связывающимся с протеогликанами.
Электрофоретическое разделение
Электрофоретическое разделение протеогликанов было проведено в 4-12 % полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях согласно стандартному протоколу [9-11] и как описано ранее [12]. Пробы были приготовлены в присутствии 1 % NP-40 детергента. Все реагенты, используемые для приготовления ПААГ, - производства Sigma-Aldrich. ПААГ окрашивались после электрофоретического разделения красителем, специфически окрашивающим протеогликаны, 0,1 % толуидиновым синим в дистиллированной воде, C.I. 52040, Sigma-Aldrich.
Для проведения вестерн-блот анализа клеточные лизаты после электрофоретического разделения переносились на нитроцеллюлозную мембрану. Клетки лизи-ровали в присутствии 1 % NP-40 детергента как описано раньше [12]. Содержание белка в пробах выравнивалось после измерения белков по Брэдфорду [Bradford, 1976]. Интенсивность сигналов в вестерн-блот анализе оценивали в программе ImageJ. Изображения мембран были получены с помощью Gel Doc™ XR ChemiDoc™
прибора с использованием программы Image Lab™ Software 170-82657. Следующие антитела использовались в разведении 1:100, против хондроитин-сульфатов (CS-56, ab11570, Abcam) и гепаран-сульфатов (A74, ab23418, Abcam).
Карбазольный метод
Содержание уроновых кислот в исследуемых препаратах проводили карба-зольным методом [13]. Метод включает две стадии: 1) гидролиз 50 мкл исследуемых проб до уроновых кислот и гликозаминов добавлением 50 мкл 0,025 М тетра-бората натрия (Na2B4O7) (Sigma) в концентрированной серной кислоте (H2SO4); и 2) окраска уроновых кислот добавлением 500 мкл 7,5 мМ раствора карбазола (Век-тон CAS 86-74-8) в 96 % растворе этилового спирта (С2Н5ОН). Обе реакции проводили после тщательного перемешивания образцов при 100 °С в течение 10 мин. С охлаждением растворов до 4 °С между двумя этапами и по окончании. Измеряли поглощение света исследуемыми препаратами по окончании реакций при 520 нм. Результаты воспроизволились в повторных экспериментах. В качестве стандартов использовали коммерческий препарат хондроитинсульфата и галактуроновой кислоты (Вектон CAS 91510-62-2).
Определение суммарного содержания полианионов
Для определения суммарного содержания полианионов в исследуемых препаратах использовали катионный краситель 1,9-диметиленовый синий (ДММС). К 50 мкл пробы добавляли 250 мкл раствора красителя, содержащего 50 мкМ ДММС, 40 мМ глицина, 40 мМ NaCl и доведённого соляной кислотой до рН = 3,0, интенсивно перемешивали, через минуту измеряли поглощение при длине волны 525 нм. Степень среднего сульфатирования цепи гликозаминогликана определяли как отношение содержания гликозоаминов к суммарному содержанию полианионов с учётом средней степени сульфатирования гепарина в 2,5-3 единицы. Оценку проводили по следующей формуле: 2,5/(х/у) до 3/(х/у), где х - это показатели оптической плотности, полученные в ходе определения содержания уроновых кислот карбазольным методом, у - показатели оптической плотности, полученные в ходе определения содержания полианионов, определённых в реакции с ДММС, 2,5-3 сульфатных групп на один дисахарид - это средняя степень сульфатирования гепарина.
Определение хондроитиназной активности
Для определения хондроитиназной активности в исследуемых препаратах использовали коммерческий препарат хондроитиназы АВС [ЕС 4.2.2.4] (C3667, Sigma). В качестве стандарта использовали коммерческий препарат хондроитин сульфата (C9819-5G, Sigma). Определение хондроитиназной активности проводили согласно инструкции производителя хондроитиназы. Кратко: для построения калибровочной кривой брали 200 мкл 0,5 % растворов исследуемых препаратов, предположительно содержащих хондроитин-сульфат, добавляли к 800 мкл буфера, содержащего 0,1 ед./мл хондроитиназы (250 мМ Tris-HCl (pH=8.0), 300 мМ ^3^0Na, 0,05 % альбумин бычьей сыворотки), инкубировали при 37 °С, отбирали по 100 мкл в интервале от от 1 до 21 минуты, останавливая реакцию внесением этих аликвот к 900 мкл 50 мМ КС1, pH 1,8, измеряли оптическую плотность растворов при 232 нм, рассчитывали концентрацию по формуле расчёта хондрои-
тиназной активности, описанной в инструкции производителя (Sigma №С-2905 для EC 4.2.2.4). Пробы для ВЭЖХ подвергали расщеплению хондроитиназой в тех же условиях.
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)
Колонки Shim-Pack ISA - 07/S2504 (Shimadzu) используются для анализа гли-копротеинов (Shimadzu site), так как неподвижной матрицей в этих колонках является полистирольный гель, что позволяет использовать как электростатические, так и гидрофобные взаимодействия, характерные для соединений сахаров (ISA).
Хроматографическое разделение проводили согласно протоколу использования колонки от производителя. Работу проводили следующим образом: фракцио-нированировали с помощью хроматографической системы «Shimadzu» LC-20AD, детектирование вели с помощью диодно-матричного детектора при длине волны 254 нм, разделение проводили на колонке Shim-Pack ISA - 07/S2504, 4,0 mm X 250 mm; в изократическом режиме; подвижная фаза: 0,3 M NaH2PO4 с лимонной кислотой, pH = 3,5; все фракции собирали на коллекторе FRC, объем фракции составил 2 мл.
Клеточные линии
Культура клеток крови, растущих в суспензии, получена из периферических В-клеток здорового человека, трансформированных с помощью вируса Эпстайн-Барра (ВЭБ) - Lymphoblastoid Cell Lines (LCLs) [14, 15], для неограниченного поддержания клеточной культуры в условиях in vitro.
Культуры эпителиальных адгезивных клеток, получены из рака носоглотки CNE2 [16], TWO3 [17] и печени эмбриона человека (HEK293). Культуры клеток поддерживались, согласно стандартных протоколов как описано ранее [12] в среде IMDM-для адгезивных клеток (Invitrogen, Carlsbad, CA., USA), RPMI среде - для В-клеток, растущих в суспензии. Клетки культивировали в отсутствии и присутствии 10 % коммерческой сыворотки, полученной из крови быка (HyClone, UK Ltd, Northumberland, UK). Сыворотка быка является стандартным компонентом сред культивирования клеток как источник ростовых факторов и других существенных компонентов, необходимых для жизнедеятельности клеток в условиях in vitro. Клеточные линии инкубировали при 37 °C в атмосфере 5 % CO2.
МТТ анализ
LCL клетки рассаживали в лунки 96-луночной планшеты в количестве 0,5х106 в 100 мкл на лунку в стандартной среде культивирования для суспензионных клеток. Доводили исследуемые препараты до сравнимых значений по белку с помощью физраствора. Исследуемые препараты добавляли в трёх повторах в разведениях 1:50, 1:100, 1:1000 в объёме 100 мкл. Помещали клетки на 37 °С в инкубатор с 5 % СО2. Спустя 48 часов, отбирали 90 мкл из каждой лунки в новую 96 планшету, добавляли по 10 мкл 12 mM раствора MTT в PBS (натрий-фосфатный буфер, НФБ), оставляли до 3-х часов при 37 °С в инкубаторе, в зависимости от развития окраски. В качестве негативных контролей использовали среду без клеток и клетки, обработанные физраствором, полученным после обработки кластерным серебром. При достижении визуально наблюдаемой разницы в окраске культуральной среды между негативными контролями и исследуемыми препаратами, либо по истечении срока, реакцию останавливали, добавляя в лунки по 100 мкл 0,1 н HCl в изопро-
паноле, способствующим растворению кристаллов формазана. Результаты реакции считывали как поглощение света при 497 нм. Результаты реакции воспроизводились при повторных экспериментах.
Анализ миграции
Культуру адгезивных клеток рассаживали в 6-ти луночные планшеты в количестве достаточном, чтобы получить монослой клеток спустя 16-18 часов культивирования. Вносили царапины в культуру монослоя стерильным носиком. Заменяли среду культивирования на свежую, в которую добавляли исследуемые препараты в различных разведениях. Клетки помещали в инкубатор. Спустя 24 часа оценивали и фотографировали ширину царапины. Анализ миграции проводили не менее трёх раз на ряде клеточных линий с воспроизводимыми результатами.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Приготовление экстракта костной муки крупного рогатого скота
Протеогликаны получали в ходе экстракции костной муки крупного рогатого скота физиологическим раствором как описано в экспериментальной части. Специфическое обогащение экстракта протеогликанами осуществляли с помощью 0,1 % раствора кластерного серебра (AgL), отличающегося положительным зарядом, основываясь на том, что ПГ негативно заряжены. Супернатанты анализировали в ходе электрофоретического разделения на 4-12 % градиентном полиакриламид-ном геле в денатурирующих условиях и окрашиванием 0,1 % раствором толуиди-нового синего (рис. 1).
Рис. 1. Электрофоретическое разделение экстрактов КМ КРС на 4-12 % полиакриламидном геле. А. Хондроитин сульфат. Б. Терафлекс. В. КМ КРС. 1,3,5-исходные растворы; 2,4,6-супернатанты после очистки
кластерным серебром.
Сульфатированные протеогликаны в исследуемых препаратах в силу своей полианионной природы вступают в реакции с этим катионным красителем. В препаратах КМ КРС краситель обнаруживал дискретные полосы размерами приблизительно 10-15 кДа и 50-70 кДа до и после обработки экстрактов кластерным серебром. В осадке после серебра полосы не наблюдаются. Коммерческий препарат
«Терафлекс» демонстрирует более широкий набор факторов, окрашиваемых то-луидиновым синим, что говорит о большем разнообразии ПГ в коммерческом препарате, чем в исследуемом нами экстракте костной муки крупного рогатого скота.
Сравнительный анализ экстракта КМ КРС. Содержание ДНК
Сравнительный спектрофотометрический анализ исследуемых препаратов на присутствие ДНК и белков позволяет оценить содержание чужеродной геномной ДНК. Анализ показал, что экстракты КМ КРС (особенно после обработки кластерным серебром) содержали даже меньше ДНК, чем препарат «Терафлекс», что свидетельствует об очистке исследуемого препарата экстракта КМ КРС от ДНК КРС. Соотношение белок:ДНК в препаратах был выше в экстракте КМ КРС чем у коммерческого препарата «Терафлекс» (рис. 2).
А
I
Б 2
1-5
0.5
до Ад после Ад
■ КМ КРС | Терафлекс
I .1
до Ад после Ад
■ КМ КРС | Терафлекс
I.
до Ад после Ад
| КМ КРС | Терафлекс
Рис. 2. Спектрофотометрический анализ исследуемых препаратов.
(А) Содержание дНк, (Б) белков, (С) соотношение концентраций белки/ДНК.
Содержание уроновых кислот
Для измерения содержания гликозаминогликанов в исследуемых препаратах использовали карбазольный метод, основанный на определении содержания уроновых кислот. Сравнивали исследуемый экстракт из КМ КРС с коммерческим препаратом «Терафлекс», согласно модифицированному протоколу (Bitter&Muir, 1962; Frazier, 2008). В качестве положительного контроля использовали химически чистый коммерческий препарат хондроитин сульфата. Используя стандарты, построили калибровочную кривую. Препарат «Терафлекс» содержал 75 мкг/мкл уроновых кислот. Присутствие уроновых кислот в экстрактах КМ КРС было гораздо ниже, чем у препарата «Терафлекс» и составляло около 0,6 мкг/мкл, но содержание уроновых кислот повышалось значительно, до 4 мкг/мкл, после обработки КМ КРС экстрактов кластерным серебром. Для препарата «Терафлекс» не было отмечено существенных изменений в содержании уроновых кислот до и после обработки кластерным серебром.
Результаты представлены в виде диаграммы мкг/мкл уроновых кислот в исследуемых препаратах.
Определение суммарного содержания полианионов
Для оценки средней степени сульфатирования гликозаминогликанов (число сульфатных групп в дисахариде) использовали метод определения полианионов, основанный на реакции гликозаминогликанов с катионным красителем 1,9-диме-тиленовым синим (ДММС).
Степень среднего сульфатирования гликозоаминогликанов в исследуемых препаратах представлены в виде диаграммы, где исследуемые препараты по горизонтальной оси сравниваются по средней степени сульфатирования (на вертикальной оси). Как видно из рисунка 3, препараты из КМ КРС, очищенные с помощью кластерного серебра, сульфатированы на порядок выше, чем коммерческий пре-
парат с хондропротекторными свойствами «Терафлекс».
1 6
5
Ü2 4
-Í з
i- -3 *
s 2
1
О
Терафлекс
КМ КРС
Б 0.9
ï ля
Средняя степень сульфатирова> о о о о о о о с 1
Терафлекс КМ КРС
Рис. 3. Сравнение препаратов по содержанию (А) гликозоаминогликанов и (Б) средняя степень их сульфатирования на дисахарид
Чувствительность к хондроитиназной активности
В случае присутствия хондроитин сульфатов в исследуемом нами экстракте КМ КРС, препарат будет чувствителен к хондроитиназной активности. Идентификацию протеогликанов в препаратах экстракта КМ КРС далее проводили с помощью фермента деградации ГАГ, хондроитиназы АВС. Хондроитиназа ABC, получена из Proteus vulgaris, катализирует расщепление N-ацетилгексозамидных связей в различных хондроитинсульфатах, хондроитин-4-сульфате, хондроитин-6-сульфате, дерматансульфате, хондроитине и гиалуроновой кислоте, продуцируя дисахариды с D-гексуронатом на концах.
Измерение хондроитиназной активности основано на производстве в ходе ферментативной реакции ненасыщенных дисахаридов, поглощающих свет в ультрафиолетовой области. Все исследуемые препараты были чувствительны к хондроитиназной активности, как следует из повышения оптической плотности на 232 нм в ходе каталитической реакции. Наиболее чувствительным был коммерческий препарат «Терафлекс», его чувствительность была выше почти в пять раз, чем у исследуемых нами экстрактов из КМ КРС. Экстракт КМ КРС после обработки кластерным серебром демонстрировал хоть и небольшое, но детектируемое повышение чувствительности к хондроитиназе (рис. 4).
А
Активность хондроитиназы на исследуемых препаратах
0.3S 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0
Min 0 3 6 9 12 15 -Tflex -КМКРС -KMKPCAg
Рис. 4. Результаты исследований о присутствии хондроитинсульфатов в исследуемом препарате КМ КРС: КМ КРС чувствителен к хондроитиназной активности как и коммерческий препарат «Терафлекс»
Продукты хондроитиназной ферментативной реакции исследовали в ходе ВЭЖХ. ВЭЖХ позволяет обнаруживать и количественно определять все типы ГАГ (глюкозамины, галактозамины, сульфатированные и нет), не искажается примесью солей и ДНК. Сравнивали коммерческие препараты хондроитина, терафлекса и экстракты КМ КРС до и после очистки кластерным серебром. В качестве негативного контроля использовали физраствор после очистки кластерным серебром. Пики показаний оптической плотности поглощений в ультрафиолетовой области, в которой поглощают отщепляемые хондроитиназой свободные ненасыщенные дис-ахариды, наблюдались в сравнимых диапозонах для исследуемого препарата КМ КРС и для коммерческих препаратов «Терафлекс» и хондроитина (рис. 5).
Экстракт КМ КРС после очищения кластерным серебром был чувствителен также к коллагеназе. По результатам анализа на ПАА геле все высокомолекулярные фракции экстракта так же, как и растворы коммерческого препарата «Терафлекс», превращаются в низкомолекулярные фракции. Использование 0,5 % коллагеназы (37 °С, 10 мин) привело к расщеплению всех толуидин-окрашиваемых факторов в экстракте до фрагментов массой прибл. 10 кДа.
Экстракт КМ КРС содержит факторы, специфически связывающиеся с антителами на хондроитин- и на гепаран-сульфаты.
Биологическую активность супернатантов после осаждения серебром анализировали по взаимодействию с антителами к хондроитин- (рис. 7А) и гепаран-сульфатам (рис. 7Б) в ходе вестерн-блот анализа. Сравнительный вестерн-блот анализ препаратов показал, что антитела, специфичные к хондроитину и гепа-рансульфату, избирательно связывались с факторами в экстрактах КМ КРС до и после обработки кластерным серебром. Интересно, что антитела не обнаруживали ничего в препаратах «Терафлекс».
Рис. 5. Результаты исследований о присутствии хондроитинсульфатов в исследуемом препарате КМ КРС: хроматографический анализ исследуемых препаратов после хондроитиназной реакции
Интересно, что экстракты КМ КРС давали тот же хроматографический профиль, что и коммерческий препарат «Терафлекс», но интенсивность аналогичного пика в КМ КРС существенно увелиличивалась после обработки кластерным серебром по сравнению с препаратом «Терафлекс». Более того, сравнение площадей последнего пика на хроматограммах, соответствующего хондроитину [18], свидетельствует о значительном его обогащении после взаимодействия с кластерным серебром именно в случае КМ КРС (рис. 6).
С Гликозоаминогликаны после ВЭЖХ 1 СП
100 50
Терафлекс Хондроитин КМ КРС сульфат
Рис. 6. Результаты исследований о присутствии хондроитинсульфатов в исследуемом препарате КМ КРС: суммарная площадь пиков на хроматограмме после ВЭЖХ анализа исследуемых препаратов
Препарат экстракта из КМ КРС обладает биологической активностью
Исследуемые препараты, сравнимые по содержанию белка, проверяли на способность оказывать влияние на выживаемость лимфоцитов, В-клеток здорового человека (иммортализованных вирусом Эпстайн-Барра для длительного существования в условиях in vitro (Lymphoblastoid Cell Line, LCL). Лимфоциты были рассажены как описано в экспериментальной части. Диаграмма на рисунке 7А представляет относительную активность митохондриальных ферментов, определяемую в колориметрическом МТТ анализе. МТТ-тетразолиевый краситель 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид (M6494, ThermoFisherScientific) восстанавливается NAD (P) H-зависимыми оксидоредуктазами до его нерастворимой формы, формазана, который имеет фиолетовый цвет, который регистрируется при 497 нм. Чем больше жизнеспособных клеток, тем интенсивнее фиолетовый цвет В-клеток подвергшихся, воздействию серии разведений «Терафлекс» и экстракта КМ КРС. В качестве негативного контроля к клеткам добавляли физраствор после обработки кластерным серебром.
МТТ анализ показал, что исследуемый экстракт КМ КРС оказывал сравнимое с коммерческим препаратом «Терафлекс» действие на выживаемость В клеток при разведении 1:500. Коммерческий препарат «Терафлекс» оказывал наибольшее благоприятное воздействие даже без обработки препарата серебром, в то время как исследуемый препарат экстракта из КМ КРС оказывал наибольшее положительное влияние на выживаемость клеток после обработки серебром. Описанный эффект воспроизводился в повторных экспериментах.
В работе оценивалось влияние исследуемых препаратов на миграцию адгезивных эпителиальных клеток ряда клеточных линий, полученных из рака носоглотки. Сравнивали движение клеток в процессе закрытия искусственно введённых царапин в культуру монослоя, при условии добавления к среде культивирования исследуемых препаратов в различных разведениях.
Рис. 7. Вестерн-блот анализ. Препарат экстракта из КМ КРС содержит факторы, которые специфически узнаются антителами на (А) хондроитин- и (Б) гепаран-сульфаты (Б). I. Экстракты «Терафлекс», II. Экстракты КМ КРС. 1, 3 - исходные препараты; 2, 4 - после инкубации с серебром
На рисунке 8 представлены результаты для клеточной линии эпителиальных клеток CNE2. Все препараты продемонстрировали способность ингибировать миграцию эпителиальных клеток. Результаты в этом эксперименте были сравнимы для коммерческого препарата «Терафлекс» и для исследуемого экстракта из КМ КРС и при разведении 1:500 и при разведении 1:1000. Результаты показаны для разведения 1:1000.
Б
1 2 3 4 5 6
Рис. 8. Результаты исследований о влиянии исследуемых препаратов на выживаемость лимфоцитов: влияние на миграцию эпителиальных раковых клеток линии CNE2. Исследуемые препараты добавлены в разведении 1:1000: 1 - исходная среда культивирования клеток; 2 - физраствор после инкубации с кластерным серебром; 3 -исходный раствор терафлекса; 4 - раствор терафлекса после инкубации с кластерным серебром; 5 - раствор исходного экстракта КМ КРС; 6 - раствор экстракта КМ КРС после инкубации с кластерным
серебром
ОБСУЖДЕНИЕ
В статье описывается методика приготовления биологически активного вещества из костной муки крупного рогатого скота (КМ КРС) с использованием кластерного серебра. Мы показываем, что полученный экстракт содержит хондроитинсульфаты, возможно, гепарансульфаты. Сравнивали коммерческий препарат с хондропротективными свойствами «Терафлекс» и полученный экстракт из костной муки КРС. Наш подход исключает использование дорогостоящих ферментных препаратов, стандартно применяемых сейчас при получении протеогликанов, сокращает время получения активной субстанции и стадии выделения.
Использование кластерного серебра позволяет получить препарат с характеристиками, сопоставимыми для коммерческого препарата «Терафлекс».
Хондроитинсульфаты избирательно остаются в супернатанте после осаждения частиц серебра. Серебро в кластерных частицах не имеет заряда, положительным зарядом обладают только ионы серебра, которые постоянно генерируются частицами серебра, которые находятся в капсуле из инертных молекул пропиленгли-коля и крахмаха [7]. Можно предположить, что молекулы ДНК, присутствующие в растворе экстракта КМ КРС, контактируют с ионами серебра вследствие своего малого размера и осаждаются при центрифугировании. То есть, использование кластерного серебра предлагает избирательное очищение препарата от чужеродной ДНК, что и подтверждается при спектрофотометрическом анализе очищенного препарата (см. рис. 2).
Интересно преобладание низкомолекулярных, характерных для хондроитин-сульфатов, фракций в препарате КМ КРС.
Исследуемый препарат - экстракт КМ КРС, очищенный с помощью кластерного серебра, продемонстрировал чувствительность к хондроитиназе А, В, С, сравнимую с «Терафлекс» и с химически однородным хондроитином, что позволяет сделать вывод о присутствии хондроитинсульфатов А, В и С в исследуемом препарате.
По сравнению с коммерческим препаратом «Терафлекс», содержащим ГАГ и хондроитинсульфаты (разновидности ГАГ), исследуемый нами экстракт хондроитинсульфатов, полученный из КМ КРС с помощью кластерного серебра, содержит ограниченный набор факторов. Тем не менее, описываемый препарат характеризуется сравнимыми физико-химическими и биологическими характеристиками.
Экстракт препятствует миграции раковых клеток, так же, как и коммерческий «Терафлекс».
«Терафлекс» после обработки кластерным серебром способствует выживанию В-клеток при разведении 1:100, основываясь на МТТ анализе (рис. 9). Экстракты КМ КРС до и после обработки серебром давали сравнимый результат с «Тераф-
лекс» при большом разведении 1:1000. Интересно, что все препараты и при всех трёх разведениях способствовали образованию кластеров В-клеток, эффект, подлежащий дальнейшему исследованию. Возможно, именно образование кластеров влияет на выживаемость лимфоцитов.
Illlllll
Рис. 9. Влияние исследуемых препаратов на выживаемость лимфоцитов: МТТ анализ жизнеспособности лимфоцитов после обработки клеток различными разведениями препаратов в течение 48 часов
Электрофоретические и хроматографические профили (окрашивание толу-идиновым синим, спектрофотометрический анализ, чувствительность к хондро-итиназной активности, анализ ВЭЖХ) и биологические свойства (способствует выживаемости клеток) экстрактов из КМ КРС и коммерческого препарата с хон-дропротекторными свойствами являются сравнимыми и свидетельствуют о присутствии протеогликанов и ГАГ в полученном экстракте из КМ КРС.
Интригующим является наличие дискретных низкомолекулярных (около 15 кДа) факторов в экстрактах КМ КРС, а не смеси, как в препаратах «Терафлекс» и коммерческого хондроитина, как показало разделение препаратов на полиакри-ламидном геле в ходе электрофореза и окрашивания геля толуидиновым синим. Препараты «Терафлекс» и коммерческий хондроитин показали наибольшее сходство по цвету (оба были ближе к пурпурному цвету, характерному для неповреждённых протеогликанов), в то время как экстракты КМ КРС окрашивались в более синие цвета, характерные для белков с большим количеством отрицательно заряженных групп. Было бы интересно подвергнуть препарат экстракта КМ КРС масс-спектрометрическому анализу, чтобы идентифицировать эти дискретно окрашивающиеся факторы.
Использование кластерного серебра предлагает упрощённую схему получения ПГ по сравнению с общепринятыми методами выделения ПГ (наиболее типичный протокол включает преципитацию сульфатом аммония, гельфильтрацию и аффинную хроматографию на иммобилизованном гепарине).
Кроме того, вероятно, остающиеся микроскопические следы серебра могут способствовать бактерицидным свойствам создаваемого по предложенной методике препарата с хондропротективными свойствами [8].
Показано, что экзогенные ГАГ существенно облегчают организму задачу про-
тиводействия неблагоприятным факторам окружающей среды, так как клетки под воздействием этих ГАГ более эффективно метаболизируют ксенобиотики. Преимуществом введения экзогенных ГАГ должно быть также то, что при поступлении в организм они, в отличие от эндогенных ГАГ, не содержат связанных медиаторов воспаления и, сорбируя токсические вещества, не увеличивают концентрацию провоспалительных агентов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Получение коммерчески успешного препарата из вторичного сырья позволит заинтересовать производителей в комплексной переработке животноводческого сырья, позволяющей его более рационально использовать, а также увеличивать объем и ассортимент производимой продукции.
Мы описываем здесь процесс выделения биологически активных компонентов из костной муки крупного рогатого скота, которую мы характеризуем как хондро-итин- и гепаран-сульфаты. Результаты наших исследований позволили получить биологические препараты из отходов мясного производства, которые обладают биологической активностью и могут позиционироваться как хондропротекторы, аналогичные коммерческим препаратам.
Кроме того, как показали исследования на культуре клеток, экстракты могут заменить сыворотку крови животных - самый дорогостоящий реагент при культивировании клеток. Разработка и производство таких препаратов как описываемый экстракт из КМ КРС для научных исследований позволили бы в перспективе заменить дорогостоящий реагент на гораздо более экономичный отечественный аналог, который имеет перспективу быть востребованным не только в России, но и во всем мире.
Авторы выражают благодарность Ю.Ю. Сидорину (сотруднику научно-образовательного центра Кемеровского государственного университета) за любезное предоставление препаратов кластерного серебра, лаборатории профессора Инге-мара Эрнберга (MTC, Каролинский институт, Стокгольм, Швеция) за возможность воспользоваться рядом реагентов, использованных в работе.
Финансовая поддержка исследования была предоставлена Минобрнауки России в рамках выполнения работ ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы», соглашение о предоставлении субсидии от 18.06.2019 г. № 075-15-20191383 (уникальный идентификатор проекта RFMEFI57418X0207).
Авторы не имеют взаимных претензий друг к другу коммерческого характера.
Список литературы:
1. Пожилое население России: проблемы и перспективы / В. Трубин, Н. Николаева, М. Палеева, С. Гавдифаттова // Социальный бюллетень. - 2016. - С. 3-32.
2. Русова Т.В., Баитов В.С. Биохимические изменения протеогликанов суставного хряща при прогрессирующем остеоартрозе // Бюллетень СО РАМН. - 2008. - №2 (130). - С. 25-29.
3. Суховских, А.В. Функциональная роль протеогликанов при раке предстательной железы человека: дис. ... канд. биол. наук: 03.01.03 / Суховских Анастасия Владимировна. 2018. 95 с.
4. Коноваленко, Л.Ю. Развитие информационных систем управления мясо-
перерабатывающими предприятиями / Л.Ю. Коноваленко // Вестник ВНИИМЖ. -2014. - № 3. - С. 118-121.
5. Файвишевский, М.Л. Переработка кости на мясоперерабатывающих предприятиях / М.Л. Файвишевский // Мясная индустрия. - 2010. - № 1. - С. 62-65. -ISSN 0869-3528.
6. Matsui F., Oohira A. Isolation, purification, and analysis of chondroitin sulfate proteoglycans // Adv Pharmacol. - 2006. - Р. 3-20.
7. Большая медицинская энциклопедия / Бочкарев В.В., Рубцов А.Ф., Муратов В.К. Серебров; под ред. Б.В. Петровского. - 3-е изд. - М.: Советская энциклопедия, 1984. - Т. 23. - С. 190-192.
8. Военкова, А.А. Исследование и разработка фармацевтических бактерицидных композиций на основе кластерного серебра / А.А. Военкова. - Кемерово: Кем-ТИПП. 2015. 95 с.
9. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature.1970; 227(5259): 680-685.
10. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 1976. May; 72: 248-254. "
11. Burnette W.N. Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate—polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 1981; 112(2): 195-203.
12. Short Chain Fatty Acids (SCFA) Reprogram Gene Expression in Human Malignant Epithelial and Lymphoid Cells.PLoS One / Astakhova L., Ngara M., Babich O., Prosekov A., Asyakina L.,Dyshlyuk L., Midtvedt T., Zhou X., Ernberg I., Matskova L. 2016 Jul 21; 11(7).
13. Bitter T., Muir H.M. A modified uronic acid carbazole reaction.Anal Biochem 1962; 4: 330-333.
14. Epstein M.A., Achong B.G., Barr Y.M. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma. Lancet 1964; 15. 702-705.
15. Miller G., Lipman M. Release of infectious Epstein-Barr virus by transformed marmoset leukocytes. Proc Natl Acad Sci USA 1973; 70. 190- 93.
16. Sizhong Z,. Xiukung G., Yi Z. Cytogenetic studies on an epithelial cell line derived from poorly differentiated nasopharyngeal carcinoma. Int. J. Cancer. 1983; 31: 587-590.
17. Characterization of seven newly established nasopharyngeal carcinoma cell lines / Lin C.T., Chan W.Y., Chen W., Huang H.M., Wu H.C., Hsu M.M., Chuang S.M., Wang C.C. Lab Invest. 1993 Jun; 68(6): 716-743.
18. The Quantification of Glycosaminoglycans: A Comparison of HPLC, Carbazole, and Alcian Blue Methods / Frazier S.B., Roodhouse K.A., Hourcade D.E., Zhang L. Open Glycosci. 2008 Jan 1; 1: 31-39.
References:
1. Trubin V., Nikolaeva N., Paleeva M., Gavdifattova S. The older population in Russia: problems and prospects. SotsiallUnyy byulletenD [Social Bulletin]. 2016, pp. 3-32. (in Russian)
2. Rusova T.V., Baitov V.S. Biochemical changes of proteoglycans of articular
cartilage in progressive osteoarthritis. ByulletenD SO RAMN [Bulletin of SO RAMN], 2008, no. 2 (130), pp. 25-29. (in Russian)
3. Sukhovskikh A.V. FunktsionalDnaya rolD proteoglikanov pri rake predstatelDnoy zhelezy cheloveka. Kand, Diss. [A functional role of proteoglycans in human prostate cancer. Cand. Diss.] 2018. 95 p.
4. Konovalenko L.Yu. Development of information systems in managing meat processing enterprises. Vestnik VNIIMZH [Bulletin of VNIIMZH], 2014, no. 3, pp. 118121. (in Russian)
5. Fayvishevskiy M.L. Bone processing in the meat industry. Myasnaya industriya [Meat industry], 2010, no. 1, pp. 62-65. (in Russian)
6. Matsui F., Oohira A. // Isolation, purification, and analysis of chondroitin sulfate proteoglycans. Adv Pharmacol. 2006; 53: 3-20.
7. Bochkarev V.V., Rubtsov A.F., Muratov V.K. Silver. BolDshaya meditsinskaya ehntsiklopediya [The Great Medical Encyclopedia], 1984, Vol. 23, pp. 190-192.
8. Voenkova A.A. Issledovanie i razrabotka farmatsevticheskikh bakteritsidnykh kompozitsiy na osnove klasternogo serebra [Research and development of pharmaceutical bactericidal compositions based on cluster silver]. Kemerovo, 2015. 95 p.
9. Laemmli U. K. // Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature.1970; 227(5259): 680-685.
10. Bradford M.M. // A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 1976. May; 72: 248-254. "
11. Burnette W.N. // Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate—polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 1981; 112(2): 195-203.
12. Astakhova L., Ngara M., Babich O., Prosekov A., Asyakina L.,Dyshlyuk L., Midtvedt T., Zhou X., Ernberg I., Matskova L. // Short Chain Fatty Acids (SCFA) Reprogram Gene Expression in Human Malignant Epithelial and Lymphoid Cells.PLoS One. 2016 Jul 21; 11(7).
13. Bitter T., Muir H.M. // A modified uronic acid carbazole reaction.Anal Biochem 1962; 4: 330-333.
14. Epstein M.A., Achong B.G., Barr Y.M. // Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma. Lancet 1964; 15. 702-705.
15. Miller G., Lipman M. // Release of infectious Epstein-Barr virus by transformed marmoset leukocytes. Proc Natl Acad Sci USA 1973; 70. 190- 93.
16. Sizhong Z,. Xiukung G., Yi Z. // Cytogenetic studies on an epithelial cell line derived from poorly differentiated nasopharyngeal carcinoma. Int. J. Cancer. 1983; 31: 587-590.
17. Lin C.T., Chan W.Y., Chen W., Huang H.M., Wu H.C., Hsu M.M., Chuang S.M., Wang C.C. // Characterization of seven newly established nasopharyngeal carcinoma cell lines. Lab Invest. 1993 Jun; 68(6): 716-743.
18. Frazier S.B., Roodhouse K.A., Hourcade D.E., Zhang L. // The Quantification of Glycosaminoglycans: A Comparison of HPLC, Carbazole, and Alcian Blue Methods.Open Glycosci. 2008 Jan 1; 1: 31-39.
Production and characteristic of biologically active preparations from cattle bone meal
Matskova Lyudmila Valentinovna, PhD, Associate Professor of Bionanotechnology Department
e-mail: liudmila.matskova@ki.se
Institute of Living Systems, Baltic Federal University, Kaliningrad, Kemerovo State University, Kemerovo,
Karolinska Institutet, Department of Microbiology, Tumor and Cell Biology (MTC), Stockholm, Sweden
Asyakina Lyudmila Konstantinovna, Candidate of Science (Technics), Junior Researcher
e-mail: alk_kem@mail.ru Kemerovo State University, Kemerovo
Chupakhin Eugene Gennad'evich, biologist e-mail: chupakhinevgen@gmail.com
Institute of Living Systems, Baltic Federal University, Kaliningrad
Babich Olga Olegovna, Doctor of Science (Technics), Associate Professor, Director of the Institute
e-mail: oobabich@kantiana.ru
Institute of Living Systems, Baltic Federal University, Kaliningrad, Kemerovo State University, Kemerovo
Abstract. The problem of an ageing population is relevant for the whole world and for Russia in particular. The object of the research is cattle bone meal (CBM) proteoglycans. The methodology of the work included preparing a bone meal extract, a cluster silver solution, separating proteoglycans by electrophoresis, determining the uronic acids content in the investigated preparations by the carbazole method, defining the total polyanions content, chondroitinase activity. Then, high performance liquid chromatography for fractionating proteoglycans and MMT analysis were performed. It was determined that the bone meal extract preparation has biological activity. The investigated preparations, comparable in protein content, were tested for their ability to influence the survival of lymphocytes, healthy human B-cells. The preparation under study — CBM extract purified by using cluster silver — showed sensitivity to chondroitinase A, B, C, comparable to Theraflex and chemically homogeneous chondroitin, which gives ground to conclusion about the presence of chondroitin sulfates A, B, and C in the investigated preparation. The process of isolating biologically active components from CBM is described, which is characterized as chondroitin and heparan sulfates. The research results allowed obtaining biological preparations from meat production wastes that have biological activity and can be positioned as chondroprotectors similar to commercial preparations. In addition, the studies on cell culture have shown that extracts can replace animal blood serum, which is the most expensive cell culture reagent. The development and production of such preparations as the described CBM extract for scientific research would allow in the future to replace an expensive reagent with a much more economical domestic analogue, which has the prospect of being in demand.
Keywords: chondroprotectors, chondroitin sulfate, proteoglycans, teraflex, silver, nanoparticles.
