CC BY
16
13. Прометной В.И., Водяницкая С.Ю., Верки-на Л.М. Дифференциальная серологическая диагностика клещевого вирусного энцефалита и лихорадки Западного Нила на территории Ростовской области // Современные аспекты природной очаговости болезней: матер. Всерос. науч.-практ. конф. с международ. участием. - Омск, 2011. - С. 83-84.
14. Водяницкая С.Ю., ВеркинаЛ.М., Куриленко М.Л. [и др.]. Экологические предпосылки циркуляции вируса клещевого энцефалита в Ростовской области // Эпи-демиол. и вакцинопрофил. - 2013. - № 3. - С. 47-51.
15. Водяницкая С.Ю., Веркина Л.М., Куриленко МЛ. [и др.]. Сероэпидемиологические исследования и анализ некоторых эпидемиологических предпосылок к циркуляции вируса клещевого энцефалита на терри-
тории Ростовской области // Мед. вест. юга Рос. - 2014.
- № 1. - С. 39-42.
16. Атлас распространения возбудителей природ-но-очаговых вирусных инфекций на территории Российской Федерации / Львов Д.К. [и др.]. - М.: Изд-во НПЦ ТМГ МЗ РФ, 2001. - 192 с.
17. Наумов Р.Л., Гутова В.П., Чунихин С.П. Ик-содовые клещи и возбудитель клещевого энцефалита. Сообщение 1. Взаимоотношение вируса с клещами рода Ixodes // Мед. паразитол. и паразитар. бол-ни.
- 1980. - № 2. - С. 17-23.
18. Каленчук В.У., Ходько Л.П. Влияние различных температур на репродукцию вируса клещевого энцефалита в иксодовых клещах // Мед. паразитол. и паразитар. бол-ни. - 1980. - № 2. - С. 23-25.
дворцова инна Владимировна - канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории эпидемиологии; Москвитина Эльза Афанасьевна - доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией эпидемиологии; Пичурина наталья Львовна - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории эпидемиологии; орехов игорь Владимирович - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории эпидемиологии; Забашта Марина Викторовна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории эпидемиологии; Феронов дмитрий анатольевич - младший научный сотрудник лаборатории эпидемиологии ООИ;
Забашта алексей Владимирович - лаборант лаборатории эпидемиологии ООИ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора.
© Коллектив авторов, 2014 Статья поступила в редакцию 16 сентября 2014 г.
УДК 616.993-097.1
ПОЛУЧЕНИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕНОВ КЛЕЩЕВЫХ а- ПРОТЕОБАКТЕРИЙ.
Л.В. Кумпан1,2, Н.В. Рудаков1-2, И.Е Самойленко2, А.П. Красиков, Н.В. Абрамова1-2, Т.А. Решетникова2, Е.В. Матущенко1,2 ТБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» 644043, г. Омск, ул. Ленина, 12 2ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» 644080, г. Омск, просп. Мира, 7
В работе представлены результаты получения и экспериментальное изучение антигенов клещевых а- протеобактерий (риккетсий и анаплазм). Эксперимент был проведен на перевиваемых культурах клеток Vero и Hep-2, с использованием штаммов риккетсий«5/98-Караганда » генотип R.sp. RpA 4 и «23/95-Еланда» генотип R. sp. DnS 28. В работе так же так же были использованы гиперим-мунизированные кролики штаммом анаплазм (A.sp.Omsk). С помощью культуры клеток, получены культуральные антигены для РНИФ позволяющие выявлять антитела у серонегативных клещевых больных. С использованием культур клеток Vero выделен и изучен первый в России штамм анаплазм (Anaplasma sp.Omsk). Установлена возможность накопления биомассы анаплазм и получен цельно-растворимый антиген для проведения диагностических исследований.
Ключевые слова: штаммы риккетсий«5/98-Караганда» генотип R.sp. RpA 4 и «23/95-Еланда» генотип R. sp. DnS 28, культура клеток Vero, Hep-2,штамм анаплазм Anaplasma.sp. Omsk гиперимму-низированные кролики
PRODUCTION AND EXPERIMENTAL STUDY OF TICK-BORNE a-PROTEOBACTERIA ANTIGENS. Kumpan L.V.1,2, Rudakov N.V.1,2, Samojlenko I.E.2, Krassikov AP., Abramov N.V.1,2, Reshetnicov T.A.2,
Matuschenko E.V.1,2 *SBEI HE "Omsk State Medical Academy" 2Omsk Research Institute of natural focal infections
In the article the results of producing and the experimental study of tick-borne a- proteobacteria antigens (rickettsiae and Anaplasma) are presented. The experiment was conducted on a continuous culture of Vero and Hep-2 cells, using strains of Rickettsia "5/98-Karaganda" genotype R.sp. RpA 4 and «23/95-Elanda" genotype R. sp. DnS 28. In our research we also used rabbits which were hyperimmunized with the strain of Anaplasma (A.sp. Omsk). Using the cell culture we derived antigens which enable us to detect the antibodies in reaction of indirect immunofluorescence among seronegative patients with tickborne encephalitis. Using cultures of Vero cells the first Russian strain of Anaplasma (Anaplasma sp. Omsk) was isolated and studied. We found a possibility of accumulating Anaplasma biomass for obtaining soluble antigen for diagnostic studies.
Keywords: Rickettsia strains "5/98-Karaganda" genotype R.sp. RpA 4 and «23/95-Elanda" genotype R. sp. DnS 28, Vero cell culture, Hep-2 cell culture, Anaplasma strain Anaplasma.sp. Omsk, hyper immunized rabbits.
Введение
Серологические методы до сих пор остаются основными для лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых клещевыми а-протеобак-териями. При этом одной из наиболее значимых методов является реакция непрямой иммуно-флюоресценции (РНИФ).
Постановка серологических реакций требует наличия набора специфических антигенов и антисывороток. Применительно к риккетсиям и анаплазмам это связано с необходимостью массового накопления определенных штаммов микроорганизмов, наиболее универсальной моделью для этого являются культуры клеток. Полученные антигены могут эффективно использоваться для лабораторной диагностики в различных серологических реакциях, поскольку коммерческие антигены из риккетсий и анаплазм в России в настоящее время не выпускают.
Методика приготовления водорастворимого антигена
С целью получения антигенов нами был накоплены инфицированные риккетсиями и анаплазмами культуры клеток Vero и Hep-2. Зараженные клетки накапливали в течение 8 пассажей. Перед приготовлением антигена зараженные культуры клеток подвергали центрифугированию при 5000 оборотах в минут течении 15 минут, далее убирали супернатант, а из полученной взвеси делали мазки, которые окрашивали по Романовскому - Гимза. После микроскопического контроля во взвесь зараженных клеток добавляли физиологический раствор и 0,5 % фенол.
После тщательного встряхивания в шейкере пробирки с зараженной клеточной взвесью помещали в рефрижератор на 3-4 дня для осаждения посторонних белковых примесей.
После выдерживания в рефрижераторе клеточную взвесь подвергали многократной эфирной обработке по Craigie (1945). Полученные антигены испытывали в перекрестной РСК на специфичность и чувствительность. После испытания антиген разливали в ампулы по 1,0 мл и лиофильно высушивали. Высушенный антиген хранили при температуре -20 ОС.
Получение цельнорастворимого рикке-тсиозного антигена и его изучение.
Для получения цельнорастворимого антигена необходимо было накопить биомассу рик-кетсий в культуре клеток Vero и Нер-2. В данной работе были использованы 2 штамма риккетсий:
1. Штамм «5/98-Караганда» генотип R.sp. RpA 4
2. Штамм «23/95-Еланда» генотип R. sp. DnS 28
Культивирование риккетсий генотипов R. sp.
RpA 4 и R. sp. DnS28 штаммы «5/98-Караганда» и «23/95-Еланда», проводилось на протяжении 11 пассажей (срок наблюдения). На протяжении 11 пассажей у генотипов R.sp. RpA 4 и R. sp. DnS28 отмечали незначительные дегенеративные изменения в обеих клеточных культурах. Наши наблюдения подтверждают наблюдения Пауто-ва и Игумнова (1968), что риккетсии оказывают цитопатическое действие на клетки, хотя оно выражено менее четко, чем при культивировании вирусов.
При обработке данных однофакторным дисперсионным анализом максимальное накопление риккетсий в культуре клеток Vero у генотипа генотип R. sp. DnS28 штамм «23/95-Еланда», наблюдали на 7-8 пассаже, а в культуре клеток Нер-2 на3-4 пассаже.
У генотипа R. sp. RpA 4 штамм «5/98-Кара-ганда», максимальное накопление в культуре клеток Vero и Hep-2 наблюдали на 9-10 пассаже. Как показал, однофакторный дисперсионный
анализ значительных различий по уровню накопления риккетсий в культуре клеток Vero и Hep-2 не наблюдалось (F<F05).
Из накопленной биомассы риккетсий генотипов R.sp. RpA 4 и R.sp. DnS 28 R. raoultii готовили цельнорастворимый риккетсиальный антиген, полученный в соответствии с рекомендациями Здро-довского П.Ф., Голиневич Е.М. (1972). Исходным материалом для приготовления цельнораствори-мых антигенов являлась зараженная клеточная взвесь. Полученные серии антигенов были исследованы в перекрестном РСК с коммерческими сыворотками R. sibirica и R. prowazekii, перекрестной антигенной реактивности не отмечено. Далее антиген проверен в перекрестной РСК с сыворотками больных. Сыворотки были получены из эпидемического очага клещевого риккетсиоза в Алтайском крае и не эндемичного района по клещевому рик-кетсиозу Новосибирской области. Результаты исследования сывороток представлены в табл. 1.
Таблица 1
результаты исследования сывороток крови клещевых больных в рСК с антигенами риккетсий новых генотипов
Административная территория Количество обследованных Полож иссле кительные результаты дований с антигенами
R. sibirica R.sp. RpA 4 (R.raoultii) R.sp. DnS 28 (R.raoultii)
абс. абс. % абс. %
Новосибирская область (с. Усть-Тарка) 174 0 12 6,8±1,9 12 6,8±1,9
Алтайский край 21 0 9 42,8±10,8 9 42,8±10,8
При исследовании 174 сывороток от больных с клещевыми инфекциями из Усть-Таркского района Новосибирской области и 21 сыворотки от больных из Алтайского края в РСК с антигеном R. sibirica получен отрицательный результат. Выявлено 12 (6,8 %±1,9) больных из Усть-Таркского района и 9 (42,8 %±10,8) больных из Алтайского края, сыворотки крови которых положительно реагировали в РСК с антигенами риккетсий генотипов, относящихся к новому виду R. raoultii. С антигенами R. sp. RpA 4 и R.sp. DnS 28 сыворотки больных реагировали одинаково, вероятно поскольку эти генотипы риккетсий имеют близкую к 100 % гомологию и относятся к одному виду R. raoultii.
Получение анаплазмозного антигена и его экспериментальное изучение
Задачей опыта было получить диагностическую анаплазмозную им-мунную сыворотку и изучить её специфичность и активность в РНИФ.
Для гипериммунизации использовали 8-су-точную культуру полевого штамма A. sp. Omsk, полученную на культуре клеток Vero. Для выделения анаплазм из клеток использовали способ попеременного замораживания (при -20 0С
- 30 мин) и размораживания при комнатной температуре. После оттаивания клеточную взвесь центрифугировали при 3000 g в течение 15 мин. Для дальнейшей работы использовали суперна-тант, который центрифугировали при 6000 g в течение часа. Полученный осадок трижды отмывали стерильным физиологическим раствором, центрифугируя в том же режиме, и доводили до концентрации 1,7x109 микробных тел в 1 мл по ОСМ ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Гипериммунизацию проводили на 3 кроликах породы шиншилла весом 2,5-3 кг по схеме, указанной в табл. 2.
Таблица 2
Схема гипериммунизации кроликов культурами анаплазм
Время введения, сут. 1 4 7 10 14 18 22 30
Доза антигена, млрд. м.т. 0,85 1,7 1,7 1,7 3,4 3,4 3,4 Полное обескровливание
Антиген для гипериммунизации готовили из штамма A.sp.Omsk. и использовали после инактивации в водяной бане при 70 0С в течение 30 мин в концентрации 1 млрд микробных тел. Титры антител учитывали на 7, 14, 22 и 30 сутки после введения A. sp. Omsk .
Из полученной гипериммунной сыворотки готовили ряд последова-тельных двукратных разведений на физиологическом растворе, начиная с 1:5. Разведения делали микродозатором в пластиковых планшетах.
Реакцию непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) ставили по сле-дующей методике. На чистые тщательно обезжиренные предметные стекла наносили параллельно друг другу несколько капель антигена. Антиген вы-сушивали и фиксировали над пламенем спиртовки. Затем на каждую каплю антигена наносили равную по объёму каплю сыворотки из каждого разведения, начиная с последнего. Одновременно ставили контроль:
1. Антиген + сыворотка положительная;
2. Антиген + сыворотка отрицательная;
3. Антиген + физиологический раствор.
Стёкла выдерживали во влажной камере
при 37-38 0С, в течение 50-60 мин для образования комплекса антиген - антитело. После чего их промывали дистиллированной водой от не связавшихся антител, подсушивали и наносили в красящем титре (подобранном опытным путём) ослиный антикроличий глобулин, меченный ФИТЦ (флуоресцеин изотиоционатом натрия), изготовленный НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Затем стёкла помещали на 15-20 мин во влажную камеру при температуре 37-38 0С. По истечении этого времени мазки промывали дистиллированной водой, просушивали и просматривали в лю-минесцент-ном микроскопе.
Интенсивность свечения оценивали в крестах: очень яркая люминес-ценция по периферии микробной клетки, чётко контрастирующая с телом клетки - ++++; яркая люминесцирующая периферия клетки - +++; слабое свечение периферии клетки - ++ или +; при отрицательной реакции люми-несценция клеток отсутствует. За положительный результат принимали яркое специфическое свечение контуров микробов в виде ободков с оценкой в 3 и 4 креста; сомнительные результаты оценивали в 2 креста при наличии слабого свечения контуров клеток.
Полученная при гипериммунизации антисыворотка была изучена на специфичность и активность в РНИФ. В ходе этого изучения выяснили, что антисыворотка, полученная на кроликах, была строго специфична к антигену, против которого она получена. Анаплазмозная сыворотка, полученная путем гипериммунизации кроликов анаплазмами, выделенными от больной коровы, в разведении 1:5 давала перекрестную реакцию с микоплазмами, бруцеллами, хламидиями, а в разведениях 1:20, 1:40 и 1:320 была строго специфична к анаплазмам (табл. 3).
Таблица 3
Специфичность и активность анаплазмозных: антигена и кроличьей сыворотки в рниФ
Антигены АНАПЛАЗМОЗНАЯ СЫВОРОТКА
1/5 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320
A. Omsk + + + + + + +
Мико-плазмы + - - - - - -
Бруцеллы + - - - - - -
Хламидии + - - - - - -
Антиген СЫВОРОТКИ 1/10
ана-плаз-мозная мико-плаз-мозная бруцеллезная хлами-диоз-ная ИРТ листе- . риоз-ная лептос-пироз-ная
A. Omsk + - - - - - -
При этом высокий уровень антител регистрировали на 22-30 сутки после начала гипериммунизации, до 1 : 320±153,2 (рис. 1).
время после иммунизации, сутки
Рис. 1. Динамика синтеза антител у кроликов, иммунизированных культурой анаплазм
Сыворотка, полученная нами при гипериммунизации кроликов, обладает строгой специфичностью к гомологичному возбудителю в титрах до 1:320. Полученная сыворотка может использоваться в РНИФ индикации и идентификации возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота, изучения его антигенных свойств и родства, патогенеза болезни.
Полученные результаты свидетельствуют об актуальности дальнейшей разработки диагностических препаратов на основе риккетсий группы КПЛ. Полученные антигены использованы для создания диагностических тест-систем на основе ИФА и РНИФ. Анаплазмозный антиген может применяться для РНИФ и других серологических методах диагностики для выявления антител.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Здродовский П.Ф. Учение о риккетсиях и риккет-сиозах / П.Ф. Здро-довский, Е.М. Голиневич. - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1972. - 496 с.
2. Паутов В.Н. Биология риккетсий / В.Н. Паутов, А.И. Игумнов. - М., 1968. - С. 27.
3. Graigie J. Application and control of ethyl-ether-walter interface effect to separation of rickettsia from yolk sac/ J. Graigie // Canad. Res., E. 1945, 8, 23, 104-114.
4. Шпынов С.Н., Рудаков Н.В., Танкибаев М.А. и др. Новые данные о распространении риккетсий RpA4 и R. aeschlimannii в Северной Азии //
Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2002. - Т. 2, №4. -С. 136-138.
5. Samoylenko I.E., Rudakov N.V., Shpynov S.N. [et al.]. Study of biological characteristics of spotted fever group rickettsial genotypes RpA4, DnS14 and DnS28 // Ann. NY Acad. Sci. - 2003. - Vol.990. - P. 612-616.
6. Rickettsia raoultii sp.nov.,a spotted fever group rickettsia associated with Dermacentor ticks in Europe and Russia / O. Mediannikov, K. Matsumoto, I. Samoylenko [et al.] // Int .J. Syst. Evol. Microbiol. - 2008. - № 58. - P. 1635-1639.
ответственный автор: Кумпан Людмила Валерьевна - канд. мед. наук, доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Омской государственной медицинской академии; старший научный сотрудник Омского НИИ природно-очаговых инфекций. [email protected]
рудаков николай Викторович - д-р мед. наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии с курсом иммунологии Омской государственной медицинской академии; директор Омского НИИ природно-очаговых инфекций. Самойленко ирина Евгеньевна - канд. мед. наук, ведущий научный со-трудник Омского НИИ природно-очаговых инфекций.
решетникова татьяна александровна - канд. мед. наук, старший научный сотрудник Омского НИИ природно-очаговых инфекций.
Красиков александр Пантелеевич - профессор кафедры ветеринарной микробиологии, инфекционных и инвазивных болезней Омского государственного аграрного университета.
абрамова наталия Валерьевна - канд. мед. наук, ассистент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Омской государственной медицинской академии; старший научный сотрудник Омского НИИ природно-очаговых инфекций. Матущенко Елена Валерьевна - канд. мед. наук, доцент кафедры микро-биологии, вирусологии и иммунологии Омской государственной медицин-ской академии; врач лаборатории центра СПИД Омского НИИ природно-очаговых инфекций.
© Коллектив авторов, 2014 Статья поступила в редакцию 23 сентября 2014 г.
УДК 576.895.421
ДИНАМИКА ЧИСЛЕННОСТИ ТАЁЖНОГО КЛЕЩА (IXODES PERSULCATUS, SCHULZE, 1930)
М.Т. Макенов, В.В. Якименко, М.Г. Малькова ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора Россия, 644080, г. Омск, просп. Мира, 7
В работе представлены результаты анализа многолетней динамики численность всех фаз развития таёжного клеща. Для исследования были использованы материалы многолетних учётов численности имаго иксодовых клещей и мелких млекопитающих на стационаре Омского НИИ природно-очаговых инфекций в северной лесостепи Омской области (Тюкалинский район). В работе рассмотрен период с 1977 по 2002 гг. Для анализа временных рядов использовали метод сингулярного спектрального анализа - SSA. Мы выявили устойчивый рост обилия всех фаз жизненного цикла в период с конца 1970-х до середины 1990-х. Анализ циклических компонент во временных рядах показал наличие выраженных колебаний с периодом 7 и 14 лет для личинок, 5-6 лет для нимф и 6-7 лет для имаго таёжного клеща.
Ключевые слова: таежный клещ, динамика численности.
DYNAMICS OF TAIGA TICKS (IXODESPERSULCATUS, SCHULZE, 1930)IN THE NORTHERN
FOREST-STEPPE OF THE OMSK REGION MakenovM.T., Yakimenko V.V., MalkovaM.G.
Omsk Research Institute of Natural Focal Infections
The article contains the results of the analysis the taiga ticks' long-term dynamics.In this study, we used data from the Omsk Research Institute of natural focal infections for the period 1977-2002.Data include abundance of imago ticks and small mammals at the research station in the northern forest-steppe of the Omsk region (Tyukalinsky district).For time series analysis, we used the method of singular spectrum analysis - SSA.
We found a steady increase in the abundance of all phases of the ticks' life cycle in the period from the late 1970s until the mid-1990s. Seasonal decomposition showed the periodic variation with a period of 7 and 14 years for the larvae, 5-6 years for nymphs and 6-7 years for imago taiga tick.
Keywords: taiga ticks, ixodes, long-term dynamics, time series, SSA.
Таёжный клещ (Ixodes persulcatus, Schulze, 1930) вот уже более 70 лет является объектом пристального внимания, зоологов, паразитоло-
гов и эпидемиологов как один из основных компонентов природных очагов целого ряда инфекций. Подобный интерес учёных способствовал
