CC BY
36
20. Мозговой С.И. и др. Российский пересмотр международной классификации хронического гастрита: оценка нового диагностического подхода методами каппа-статистики // Омский научный вестник. 2010. № 1. C. 84-88. [Mozgovoi S.I. et al. Russian Revision of the International Classification of Chronic Gastritis: Assessment of the New Diagnostic Approach by Kappa Statistics. Omskii nauchnyi vestnik. 2010; 1: 84-88. (In Russ.)]
21. Haseltine E.L., Penney M.S., George S., Kieffer T.L. Successful treatment with telaprevir-based regimens for
chronic hepatitis C results in significant improvements to serum markers of liver fibrosis. J. Viral Hepat. 2015; 22: 701-707. DOI: 10.1111/jvh.12382.
22. Martin J., Khatri G., Gopal P., Singal A.G. Accuracy of ultrasound and noninvasive markers of fibrosis to identify patients with cirrhosis. Dig. Dis. Sci. 2015; 60: 1841-1847. DOI: 10.1007/s10620-015-3531-1.
УДК 616.98:579.841.93 DOI 10.24412/2220-2021-7880-3-77-81
ПОЛУЧЕНИЕ ГИБРИДОМ, ПРОДУЦИРУЮЩИХ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К СТАФИЛОКОККОВЫМ ЭНТЕРОТОКСИНАМ А И В
КуклинаГ.В., Ипатов С.С., ЕремкинА.В., Подволоцкий А.Н., Горшков А.С.
Филиал ФГБУ «48-й Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации, Киров, Россия (610000, г. Киров, Октябрьский проспект, д. 119), е-mail: 23527@mil.ru
Целью работы являлось получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к стафилококковым энтеротоксинам А и В. В работе использованы: энтеротоксигенные штаммы Staphylococcus aureus ATCC 13565 и ATCC 14458; препараты стафилококковых энтеротоксинов А и В; мыши линии BALB/c; клетки миеломной опухоли SP2/0-Ag14 (АТСС®CRL-1581TM). Слияние спленоцитов иммунных мышей и клеток миеломной опухоли проводили по методике G.Kohler и C.Milstein в модификации De St. Fazekas и D. Scheidegger. Гибридные клеточные линии, продуцирующие специфические моноклональные антитела, клонировали методом лимитирующих разведений. Ростовые и секреторные свойства гибридом изучались при культивировании in vitro и in vivo. Исследование специфической активности иммунных сывороток, культуральных и асцитических жидкостей гибридом, а также оценку диагностических свойств моноклональных антител проводили методом иммуноферментного анализа. В результате исследований получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к стафилококковым энтеротоксинам А и В. Исследованы диагностические свойства моноклональных антител. Установлено, что различные комбинации моноклональных антител, используемых для иммобилиза -ции на твердой фазе и для синтеза иммунопероксидазных конъюгатов, позволяют в сэндвич-иммуно-ферментном анализе специфически выявлять стафилококковые энтеротоксины в концентрации 0,5 нг/ мл и более.
Ключевые слова: стафилококковые энтеротоксины, моноклональные антитела, иммуноферментный анализ.
OBTAINING HYBRIDOMAS PRODUCING MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXINS A AND B
Kuklina G. V., Ipatov S.S., Eremkin A. V., Podvolotsky A.N., Gorshkov A.S.
Affiliated Branch of the Federal State Budgetary Iinstitution «48th Central Research Institute» of the Ministry of Defense of the Russian Federation (610000, Kirov, Oktyabrsky Ave., 119), е-mail: 23527@mil.ru
The objective of the study was to obtain hybridomas producing specific monoclonal antibodies against staphylococcal enterotoxins A and B. Enterotoxigenic strains of Staphylococcus aureus ATCC 13565 and ATCC 14458, staphylococcal enterotoxins A and B, BALB/c mice and SP2/0-Ag14 (ATCC®CRL-1581™) myeloma cells were used in the research. Splenocytes of immune mice and myeloma cells were fused according to G. Kohler and C. Milstein method modified by De St. Fazekas and D.Scheidegger. Hybrid cell lines producing specific monoclonal antibodies were cloned by limited dilution method. Growth and secretory characteristics of hybridomas were studied during the in vitro and in vivo cultivation. Specific activity of immune sera, cultural and ascitic fluids and assessment of diagnostic properties of monoclonal antibodies were studied by ELISA. Hybridomas producing monoclonal antibodies against staphylococcal enterotoxins A and B were obtained as a result of the study. Diagnostic properties of monoclonal antibodies were studied. Different combinations of monoclonal antibodies used as capture and enzyme-labeled antibody are able to detect 0,5 ng/ml of staphylococcal enterotoxins in «sandwich»-ELISA.
Keywords: staphylococcal enterotoxins, monoclonal antibodies, enzyme linked immunosorbent assay.
Введение являются одной из самых распространенных причин
Стафилококковые энтеротоксины (SE) входят пищевых отравлений в мире. Продуцентами являют -в семейство, включающее более 20 экзотоксинов, и ся энтеротоксигенные штаммы Staphylococcus aureus
(S. aureus). Патогенные стафилококки продуцируют 6 типов энтеротоксинов: А, В, С, D, E, F. SEF также известен как токсин синдрома токсического шока. Отравления стафилококковыми энтеротоксинами чаще всего ассоциированы с потреблением контами-нированных патогенами пищевых продуктов [1, 2]. Случаи стафилококковых отравлений носят спорадический характер и, как правило, связаны с пунктами общественного питания, на которых нарушаются санитарные нормы хранения и приготовления пищевых продуктов, а также не осуществляется надлежащий контроль за состоянием здоровья рабочего персонала [3, 4]. Стафилококковые энтеротоксины токсичны для человека даже в незначительных количествах. Они способны вызывать рвоту, симптом гастроэнтеритов при однократном поступлении в дозе 0,004 мкг/кг, доза 0,02 мкг/кг может оказаться летальной [1, 2].
По своей природе стафилококковые энтероток-сины являются простыми пептидами с молекулярной массой от 24 до 30 кДа [5]. Все они термостабильны (выдерживают кипячение в течение 30 минут), устойчивы к воздействию пищеварительных ферментов и сохраняют свои свойства в диапазоне рН от 4,5 до 10 [1].
При изучении стафилококковых пищевых отравлений для специфического выявления энтероток-сина и его продуцентов широко используют иммунологические методы [6, 7-9]. Современные подходы к разработке иммунологических средств идентификации патогенов базируются на использовании моноклональных антител заданной специфичности. В зарубежных литературных источниках приводят -ся работы по получению гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к стафилококковым энте-ротоксинам [8, 10, 11]. В России на данный момент перечень проводимых работ в этом направлении крайне ограничен.
Учитывая вышеизложенное, а также тот факт, что среди стафилококковых энтеротоксинов наиболее значимыми являются энтеротоксины А и В, на долю которых приходится более 80% пищевых отравлений, целью наших исследований стало получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к стафилококковым энтеротоксинам А и В, и оценка их диагностических свойств.
Материал и методы
В работе использовали микробные культуры из Государственной коллекции микроорганизмов филиала ФГБУ «48-й ЦНИИ» Минобороны России (г. Киров). Работы с микроорганизмами проводились в соответствии с Санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». Микробные культуры S. aureus штаммов ATCC 13565 и ATCC 14458 выращивали на мясопептонном б льоне с 6,5 % натрия хлорида при 37 oC в течение 20 часов. Накопление энтеротоксинов в среде контролировали иммуно-ферментным методом с использованием тест-системы RIDASCREEN® SET A, B, C, D, E (R-B^harrn AG). Для получения препаратов стафилококковых энтеро-токсинов А и В использовали рекомбинантные штаммы Escherichia coli. Микробные клетки выращивали на жидкой питательной среде LB с добавлением изопропил-бета-Э-тиогалактопиранозида при 37 oC в течение 24 часов, а затем осаждали центрифугировани-
ем. Экстракцию токсинов из клеток проводили раствором сульфата полимиксина B в концентрации 2 мг/мл в течение одного часа при 37 oC. Клеточные лизаты осветляли центрифугированием. Концентрирование токсинов велось в центрифужных ультрафильтрах Amicon Ultra-15, 10 кОа (Millipore). Очистку токсинов выполняли методом гель-фильтрации с использованием системы ActaPrime Plus (GE Healthcare) на колонке 16/90 с сефакрилом S-200 HR (1 мл/мин., 0,05 М трис-HCl буфер с 0,15 М NaCl, pH 7,2). Электрофоре-тический анализ белков проводили в 10%-ном полиа-криламидном геле по методу Лэммли [12]. Общую количественную оценку белка осуществляли по методу Лоури [13].
В опытах по гибридизации использовали мышей линии BALB/c обоего пола массой 18-20 г, полученных из питомника «Пущино» (Московская обл.). Работы с лабораторными животными проводили в соответствии с международными этическими нормами, законодательством Российской Федерации и нормативными документами учреждения.
Определение титров специфических антител в сыворотках крови иммунных животных, а также в культуральных и асцитических жидкостях выполнялось методом непрямого твердофазного иммуно-ферментного анализа (ИФА) [14]. Для этого в лунках планшетов Nunc Maxisorp (ThermoScientific) сорбировали препараты стафилококковых энтеротоксинов в концентрации 10 мкг/мл и после блокировки мест неспецифического связывания 1%-ным раствором BSA (Sigma-Aldrich) инкубировали с последовательными двукратными разведениями исследуемого материала. После отмывки несвязавшихся компонентов в лунки добавляли антивидовой конъюгат к иммуноглобулинам G мыши (Sigma-Aldrich) в разведении 1:100. Образовавшиеся иммунные комплексы визуализировали при помощи смеси субстрата с хромогеном (ортофе-нилендиамин (Sigma-Aldrich)). Учет результатов проводили инструментальной фотометрией реакционной смеси при длине волны 492 нм. Результат анализа считали положительным в том случае, если оптическая плотность (ОП) реакционной смеси исследуемого материала в два раза превышала величину ОП отрицательного контрольного образца.
Выделение иммуноглобулинов из асцитиче-ских жидкостей осуществлялось путем осаждения насыщенным раствором сульфата аммония (Thermo) в объемном соотношении 1:1 при 22 °С в течение 30 мин. Преципитаты осаждали центрифугированием и диализовали против 0,1 М фосфатного буферного раствора (ФБР) с рН 7,5. Окончательную очистку антител проводили методом ионообменной хроматографии с использованием системы «ActaPrime Plus» на колонке «HiPrep DEAE FF 16/10» (3 мл/мин, посадочный буферный раствор - 0,05 М ФБР с pH 7,5, градиентная элюция - повышением концентрации ФБР от 0,1 до 0,5 М). Изотип иммуноглобулинов определяли с помощью набора IsoQuick (Sigma-Aldrich) по прилагаемой фирмой-изготовителем инструкции.
Исследование диагностических свойств моно-клональных антител (МКАТ) при выявлении стафилококковых энтеротоксинов А и В осуществляли в сэндвич-варианте твердофазного ИФА [14]. Для этого были синтезированы конъюгаты МКАТ с пероксида-зой хрена (Sigma-Aldrich) по методике, предложенной P. Nakane [15]. Рабочее разведение конъюгатов определяли методом шахматного титрования [14]. При
проведении анализа выполняли двукратное титрование препаратов стафилококковых энтеротоксинов в лунках планшета с предварительно сорбированными МКАТ в концентрации 20 мкг/мл. После отмывки несвязавшихся компонентов в лунки добавляли синтезированные конъюгаты в рабочем разведении. Образовавшиеся иммунные комплексы визуализировали при помощи смеси субстрата с хромогеном (ортофе-нилендиамин). Результаты учитывали с помощью инструментальной фотометрии реакционной смеси при длине волны 492 нм. Результаты анализа принимали к учету в том случае, если ОП реакционной смеси в лунках с исследуемыми пробами в два раза превышала величину порогового значения ОП конъюгата в условиях отсутствия аналита в пробе.
Проверку специфичности МКАТ осуществляли определением перекрестной реактивности со стандартными энтеротоксинами А, В, Cí, С2, D, Е (Serva) в концентрации 1 мкг/мл и токсином синдрома токсического шока TSST (получен в филиале ФГБУ «48-й ЦНИИ» Минобороны России (г. Киров)) в концентрации 10 мкг/мл. Исследование проводили иммуно-ферментным методом (сэндвич-вариант).
Результаты и их обсуждение
Гель-фильтрация на сефакриле, примененная для очистки стафилококковых энтеротоксинов, позволила выделить гомогенные препараты энтероток-синов, освобожденные от балластных компонентов на 95% по отношению к исходным культуральным материалам. На электрофореграмме визуализировались искомые энтеротоксины с молекулярной массой 24-29 кДа (рис. 1). Очищенные препараты энтероток-синов А и В характеризовались содержанием белка 4,5 мг/мл и 3,1 мг/мл. Препараты энтеротоксинов были использованы в качестве антигенов для иммунизации животных и в качестве контрольных препаратов при исследовании диагностических свойств моноклональных антител.
Дорожка 1. Маркеры молекулярных масс. Дорожка 2. Образец SEA после гель-фильтрации. Дорожка 3. Исходный культуральный материал SEA.
Дорожка 4. Образец SEB после гель-фильтрации. Дорожка 5. Исходный культуральный материал SEB.
Рис. 1. Электрофореграмма препаратов стафилококковых энтеротоксинов. Окраска Кумасси R-250
Иммунизацию отобранной группы животных препаратами SEA и SEB проводили в два цикла с интервалом 21 сутки. Каждый цикл включал трехкратное подкожное введение антигенного препарата с гелем гидроксида алюминия в дозах 10, 20 и 40 мкг на животное с интервалом между инъекциями 5 суток. При анализе иммунного ответа мышей минимальная активность антител к энтеротоксинам в ИФА соответствовала титру 1:32 000, максимальная - 1:128 000. Животных с наибольшим уровнем сероконверсии использовали в качестве источника иммунных спленоцитов в опытах по гибридизации. За четыре дня до проведения гибридизации отобранным животным проводили бустерную иммунизацию путем внутрибрюшинного введения энтеротоксина в дозе 40 мкг в 0,9%-ном растворе натрия хлорида.
В ходе исследований по получению гибридом, продуцирующих МКАТ к антигенам SEA и SEB, было выполнено четыре эксперимента по гибридизации спленоцитов иммунных мышей и клеток миеломной опухоли SP2/0-Ag14. Для проведения слияния была использована методика, предложенная G. Kohler и C. Milstein [16] в модификации De St. Fazekas и D. Scheidegger [17] с использованием 50%-ного раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1450. Продукты слияния культивировали в среде RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) с 20%-ной фетальной телячьей сыворотки (Thermo Scientifiс) в 96-луночных культуральных планшетах с фидерным слоем перитонеальных макрофагов мышей линии Balb/с. Культивирование осуществляли в увлажненном СО2-инкубаторе при 37 °С и 5%-ном содержании СО2. С целью селекции гибридных клеток в среду добавляли однократный раствор гипоксантина-ами-ноптерина-тимидина (Sigma-Aldrich). После 10 суток культивирования селекционную среду заменяли на более щадящую с 2 мМ гипоксантина и 2 мМ ти-мидина (Sigma-Aldrich), а после 20 суток культуры поддерживали на среде RPMI-1640 с 10% фетальной телячьей сыворотки без селекционных добавок. Ежедневно проводили визуальный контроль морфофунк-ционального состояния клеток с использованием инвертированного микроскопа. С момента появления колоний гибридных клеток на 10-14-е сутки выполняли их исследование на синтез специфических антител. Популяции гибридных клеток, культуральные жидкости которых по результатам трех тестирований обеспечили стабильно высокий аналитический сигнал в ИФА, были использованы в опытах по клонированию. Клонирование культур гибридных клеток проводили методом лимитирующих разведений из расчета одна клетка на лунку. Клонирование повторяли не менее двух раз, отбирая на каждой стадии клоны с наибольшей пролиферативной активностью и устойчивым синтезом специфических антител.
В результате гибридизаций, селекций и последующих клонирований отобрано 8 гибридом: 326G2C1, 328F8F5, 329A11F6, 329D9B3 - гибридомы, продуцирующие МКАТ к SEA; 332H5E5, 333G5A4, 357A8C1, 357E10E9 - гибридомы, продуцирующие МКАТ к SEB. Гибридные клетки были размножены in vitro, криоконсервированы и заложены на хранение в сосуд Дьюара с жидким азотом.
Для изучения ростовых свойств гибридные клетки засевали в культуральные флаконы Т25 (ТРР) в концентрации 200 тыс. клеток в 1 мл. Культивирование осуществляли в среде RPMI-1640 с 10% феталь-
ной телячьей сыворотки в течение четырех суток. При одинаковой посевной концентрации наибольшее число жизнеспособных клеток на четвертые сутки культивирования отмечено у гибридом 329А11Р6. 329Б9Б3. 333в5А4. 357А8С1, 357Е10Е9, для которых этот показатель составил 1 млн клеток в 1 мл и более. В то время как у гибридом 326в2С1. 328Р8Б5. 332Н5Е5 их количество не превышало 800 тыс. клеток в 1 мл.
Для исследования секреторных свойств гибридом использовали их культуральные и асцитические жидкости. Культуральные жидкости получали от гибридных культур в логарифмической фазе роста, когда уровень продукции антител максимальный. Для получения асцитических жидкостей в брюшную полость мышей линии ВАЬВ/с вводили гибридные клетки в дозе 2 млн. Отбор перитонеального экссудата производили на 15-20-е сутки в соответствии со скоростью развития каждой отдельной асцитной опухоли. При исследовании методом ИФА титры МКАТ в культуральных жидкостях гибридом находились в диапазоне от 1:625 до 1:5000. Важным моментом являются высокие титры антител в асцитических жидкостях (от 1:625 000 до 1:5 000 000). что позволит использовать их для масштабного получения МКАТ.
Все гибридомы характеризовались 100%-ной прививаемостью клеток при внутрибрюшинном введении мышам-реципиентам. По результатам изотипирова-ния все гибридомы продуцировали иммуноглобулины субкласса G1.
Исследование диагностических свойств МКАТ к стафилококковым энтеротоксинам проводили в сэндвич-ИФА с использованием различных комбинаций доступных антител, когда одно из них им-мобилизировали на твердой фазе, а другое метили детектирующим агентом. По результатам данного эксперимента определено, что минимальная выявляемая концентрация SEA для различных комбинаций МКАТ составила от 0,5 до 128 нг/мл, минимальная выявляемая концентрация SEB - от 0,5 до 64 нг/мл. Следует отметить, что результат анализа был отрицательным («-») при использовании комбинаций одноименных антител из-за их конкуренции за один и тот же участок связывания (эпитоп) антигена. При исследовании энтеротоксигенной активности S. aureus титр культуральной жидкости штамма ATCC 13565 находился в диапазоне от 1:5000 до 1:160 000, титр культуральной жидкости штамма ATCC 14458 - от 1:40 000 до 1:320 000 (табл. 1, 2).).
Таблица 1
Диагностические свойства моноклональных антител к стафилококковому энтеротоксину А
в иммуноферментном анализе
МКАТ, иммобилизированные на твердой фазе МКАТ, конъюгированные с пероксидазой хрена Минимальная выявляемая концентрация SEA, нг/мл (медиана, n=5) Титр культуральной жидкости S. aureus ATCC 13565 (медиана, n=5)
326G2C1 326G2C1 - -
328F8F5 1,0 1:80000
329A11F6 128,0 1:5000
329D9B3 1,0 1:80000
328F8F5 326G2C1 2,0 1:80000
329A11F6 0,5 1:160000
328F8F5 - -
329D9B3 1,0 1:160000
329A11F6 326G2C1 128,0 1:5000
328F8F5 0,5 1:160000
329A11F6 - -
329D9B3 1,0 1:80000
329D9B3 326G2C1 2,0 1:80000
328F8F5 1,0 1:160000
329A11F6 2,0 1:80000
329D9B3 - -
Таблица 2
Диагностические свойства моноклональных антител к стафилококковому энтеротоксину В
в иммуноферментном анализе
МКАТ, иммобилизированные на твердой фазе МКАТ, конъюгированные с пероксидазой хрена Минимальная выявляемая концентрация SEB, нг/мл (медиана, n=5) Титр культуральной жидкости S. aureus ATCC 14458 (медиана, n=5)
332H5E5 332H5E5 - -
333G5A4 4,0 1:160000
357A8C1 64,0 1:40000
357E10E9 4,0 1:160000
332H5E5 16,0 1:80000
333G5A4 333G5A4 - -
357A8C1 1,0 1:320000
357E10E9 1,0 1:320000
332H5E5 64,0 1:40000
357A8C1 333G5A4 1,0 1:320000
357A8C1 - -
357E10E9 0,5 1:320000
332H5E5 8,0 1:80000
357E10E9 333G5A4 1,0 1:320000
357A8C1 0,5 1:320000
357E10E9 - -
Изучение специфичности МКАТ показало отсутствие кросс-реактивности МКАТ при исследовании стандартных стафилококковых энтеротоксинов А, В, С, С2, D, Е и TSST. Исключение составляют МКАТ к стафилококковому энтеротоксину А, которые взаимодействуют с энтеротоксином Е, что вполне возможно ввиду высокой гомологии SEA и SEE [10].
Выводы
1. Получены гибридомы, продуцирующие специфические моноклональные антитела к стафилококковым энтеротоксинам А и В.
2. Применение моноклональных антител в им-муноферментном анализе позволяет проводить выявление стафилококковых энтеротоксинов А и В в концентрации 0,5 нг/мл и более, а также идентификацию энтеротоксигенных штаммов S. aureus.
3. Гибридомы-продуценты можно использовать как стабильный источник получения моноклональ-ных антител при производстве иммунодиагностичес-ких препаратов.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии явного или потенциального конфликта интересов, связанного с публикацией статьи.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Литература/References
1. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. СПб.: Спец. лит., 2012. 5-е изд. 760 с. [Korotyaev A.I., Babichev S.A.. Medit-sinskaya mikrobiologiya, immunologiya i virusologiya. St. Petersburg: Spets. lit; 2012. 5-th ed. 760 p. (In Russ.)]
2. Gill D.M. Bacterial Toxins: a Table of Lethal Amounts. Microbiol. Rev. 1982; 46: 86-94.
3. Ercoli L., Gallina S., Nia Y. Investigation of a Staphy-lococcal Food Poisoning Outbreak from a Chantilly Cream Dessert, in Umbria (Italy). Foodborne Pathogens and Disease. 2017; 14 (7). DOI: 10.1089/FPD.2016.2267.
4. Mossong J., Decruyenaere F., Moris G. Investigation of a staphylococcal food poisoning outbreak combining case-control, traditional typing and whole genome sequencing methods, Luxembourg, June 2014. Euro Surveill. 2015; 20 (45). pii=30059. DOI: http://dx.doi.org/10.2807/1560-7917. ES.2015.20.45.30059.
5. Atanassova V., Meindl A., Ring C. Prevalence of Staphylococcus aureus and Staphylococcal Enterotoxins in Raw Pork and Uncooked Smoked Ham a Comparison of Classical Culturing Detection and RFLP-PCR. Int. J. Food Micro-biol. 2001;68:105-113.
6. МУК 4.2.2429-08. Методические указания «Метод определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых
продуктах». М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008 [Guidelines 4.2.2429-08. «Metod opredeleniya stafilokokkovykh enterotoksinov v pishchevykh produktakh». M.: Federal'nyi tsentr gigieny i epidemiologii Rospotrebnadzora; 2008. (In Russ.)]
7. МУК 4.2.2879-11. Методические указания «Методы определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах. Дополнения и изменения 1 к МУК 4.2.2429-08». М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011 [Guidelines 4.2.2879-11. «Metody opredeleniya stafilokokkovykh enterotoksinov v pishchevykh produktakh. Dopolneniya i izmeneniya 1 k MUK 4.2.2429-08». M.: Federal'nyi tsentr gigieny i epidemiologii Rospotrebnadzora; 2011. (In Russ.)]
8. Kuang H., Wang W., Xu L. Monoclonal Antibody-Based Sandwich ELISA for Detection of Staphylococcal Enterotoxin A. International Journal of Environmental Research and Public Health. 2013; 10: 1598-1608.
9. Ozanich R.M., Bartholomew R.A., BrucknerLea C.J., Hess B.M., Arce J.S., Cardamone H.C. Biodetection Technologies for First Responders: 2015 Edition. Washington 99352: Pacific Northwest National Laboratory Richland. 2015.
10. Liang B., Zhang Y., Liu A. Production of Monoclonal Antibody by Simultaneous Immunization of Staphylococcal Enterotoxin A and B // Appl. Biochem. Biotechnol. 2011; 164: 831-840.
11. Varshney A.K., Wang X., Cook E. Generation. Characterization and Epitope Mapping of Neutralizing and Protective Monoclonal Antibodies against Staphylococcal Enterotoxin B-induced Lethal Shock. The Journal of Biological Chemistry. 2011; 286 (11): 9737-9747.
12. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins durimg the assembly of the head of bacteriophage T. 4. Nature. 1970. 227 (5259): 680-685.
13. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 93 (1): 265-275.
14. Антитела. Методы. Пер. с англ. / Под ред. Д. Кэт-ти. М.: Мир, 1991. 287 с., ил. [Ketty D., editor. Antitela. Metody. Transl. from Engl. Moscow: Mir; 1991. 287 p. (In Russ.)]
15. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22 (12): 1084-1091.
16. Kohler G., Milstein C. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975; 256 (5517): 495-49.
17. Fazekas De St., Groth S., Scheidegger D. Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics. J. Immunol. Meth. 1980; 35: 1-21.
