CC BY
13
ПРИРОДНО-ОЧАГОВЫЕ ИНФЕКЦИИ И ИНВАЗИИ
4. Pogodina V.V., Bochkova N.G., Karan' L.S. [i dr.]. Monitoring populyacii virusa kleshchevogo ence-falita v evropejskih i aziatskih regionah Rossii: Praktich-eskie aspekty problemy // Biopreparaty. 2004. № 2 (14). S. 7-13.
5. Hasnatinov, M.A. Rol' geneticheskogo raznoobraziya virusa kleshchevogo encefalita i drugih kleshchevyh patogenov v obespechenii ustojchivogo sushchestvovaniya ih epidemiologicheski znachimyh pri-rodnyh ochagov v Vostochnoj Sibiri i Mongolii : dis. ... d-ra biol. nauk: 03.02.02: zashchishch. 26.12.19 / Hasnatinov Maksim Anatol'evich. Irkutsk, 2019. 255 s.
6. Chambers T. J., Hahn C. S., Galler R., Rice C.M. Flavivirus genome organization, expression and replication // Ann. Rev. Microbiol. 1990. Vol. 44. P. 649-688.
7. Kovalev S.Yu., Chernykh D.A., Kokorev V.S., Snitkovskaya T.E., Romanenko V.V. Origin and distribution of the tick-borne encephalitis virus strains of Siberian Subtype in Middle Urals, the North-west Russia and Baltic countries // Jornal of General Virology. 2009. Vol. 90. P. 2884-2892.
Вялых Иван Владимирович - кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник - заведующий лабораторией трансмиссивных вирусных инфекций и клещевого энцефалита; Мищенко Владимир Алексеевич -научный сотрудник лаборатории трансмиссивных вирусных инфекций и клещевого энцефалита, ЕНИИВИ ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, г. Екатеринбург.
4.Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Карань Л.С. [и др.]. Мониторинг популяции вируса клещевого энцефалита в европейских и азиатских регионах России: Практические аспекты проблемы // Биопрепараты. 2004. № 2 (14). С. 7-13.
5.Хаснатинов, М.А. Роль генетического разнообразия вируса клещевого энцефалита и других клещевых патогенов в обеспечении устойчивого существования их эпидемиологически значимых природных очагов в Восточной Сибири и Монголии : дис. ... д-ра биол. наук: 03.02.02: защищ. 26.12.19 / Хас-натинов Максим Анатольевич. Иркутск, 2019. 255 с.
6.Chambers T. J., Hahn C. S., Galler R., Rice C. M. Flavivirus genome organization, expression and replication // Ann. Rev. Microbiol. 1990. Vol. 44. P. 649-688.
7.Kovalev S.Yu., Chernykh D.A., Kokorev V.S., Snitkovskaya T.E., Romanenko V.V. Origin and distribution of the tick-borne encephalitis virus strains of Siberian Subtype in Middle Urals, the North-west Russia and Baltic countries // Jornal of General Virology. 2009. Vol. 90. P. 2884-2892.
УДК 616.98:578.824.11
Гаврилова Ю.К., Генералов С.В., Кириллова Т.Ю., Киреев М.Н., Спицын А.Н.
ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, г. Саратов, Россия
ПОЛУЧЕНИЕ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ КОНЪЮГАТОВ АНТИТЕЛ
К РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНУ ВИРУСА БЕШЕНСТВА И ОЦЕНКА ИХ СВОЙСТВ
В ходе исследования были сконструированы конъюгаты антител к рибонуклеопротеину вируса бешенства с флуорохромами ФИТЦ и Alexa Fluor 532, установлены рабочие концентрации и подтверждена возможность их применения при изучении инфицированных вирусом бешенства клеточных культур методом прямой флуоресценции наряду с коммерчески доступным конъюгатом антирабического иммуноглобулина с меткой ФИТЦ. Полученные результаты свидетельствовали о возможности применения спектрофотометрического анализа для контроля получаемых флуоресцирующих конъюгатов.
Ключевые слова: флуоресцирующий конъюгат, обнаружение вируса бешенства, спектрофотометрия.
Gavrilova Yu.K., Generalov S.V., Kirillova T.Yu., Kireev M.N., Spitsyn A.N. Russian Research Anti-Plague Institute Microbe, Saratov, Russia
© ГавриловаЮ.К., Генералов С.В. , Кириллова Т.Ю., КиреевМ.Н., Спицын А.Н., 2021
OBTAINING FLUORESCENT ANTIBODY CONJUGATES TO RABIES VIRUS RIBONUCLEOPROTEIN AND ASSESSMENT OF THEIR PROPERTIES
In the course of the study, conjugates of antibodies to the ribonucleoprotein of the rabies virus with the FITC and Alexa Fluor 532 fluorochromes were designed, the working concentrations were determined, and the possibility of their use in the study of rabies virus-infected cell cultures by direct fluorescence method along with the commercially available conjugate of antirabies immunoglobulin with the FITC label was confirmed. The results confirmed the possibility of using spectrophotometry analysis to control the obtained fluorescent conjugates.
Keywords: fluorescent conjugate, rabies virus detection, spectrophotometry.
Разработка и совершенствование методов контроля гетерологичного антирабическо-го иммуноглобулина является одним из направлений развития комплекса мер по оказанию антирабической помощи населению Российской Федерации [4]. Ранее для определения специфической активности антирабических сывороток и иммуноглобулина предложен метод, основанный на обнаружении вируса бешенства на клеточной культуре с использованием конъюгата антирабического иммуноглобулина с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) [2]. Одним из условий повышения эффективности указанного метода является использование флуорохромных конъюгатов антител к структурным компонентам вируса бешенства [6, 10], в частности, к рибонуклеопротеину. Использование флуоресцирующих диагностических конъюгатов на основе антител к рибонуклео-протеину вируса бешенства позволяет обеспечить высокую чувствительность при исследовании на клеточных культурах [3, 9] вследствие накопления рибонуклеопротеина в цитоплазме инфицированной клетки до начала сборки ви-рионов [7].
Ранее подобраны условия получения сывороток, содержащих антитела к рибонук-леопротеину [1]. Целью настоящего исследования явилось конструирование конъюгатов антител к рибонуклеопротеину вируса бешенства с флуоресцирующими красителями. В качестве флуоресцентных меток для конъ-югатов использовали ФИТЦ, традиционно применяемый при изготовлении диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов, и Alexa Fluor 532 (Thermo Fisher), обладающий более высокой фотостабильностью по сравнению с ФИТЦ. ФИТЦ-конъюгат готовили по стандартной методике [8]. Получение конъюгата антител к рибонуклеопротеину вируса бешенства с Alexa Fluor 532 осу-
ществляли согласно инструкции фирмы-изготовителя.
Для контроля конъюгирования антител с флуорохромами предварительно исследовали спектрофотометрические характеристики антител, красителей и готовых конъюгатов [5]. Спектрофотометрический анализ и регистрацию спектральных характеристик конъюгатов антител с флуорохромами осуществляли с использованием спектрометра HR4000 (Ocean Optics, США).
В ходе исследования установлено, что максимальное оптическое поглощение водных растворов ФИТЦ и Alexa Fluor 532 находилось в области 495 и 522 нм соответственно. Пиковые значения спектров поглощения для растворов антител находились в диапазоне от 380 до 460 нм с постепенным снижением в длинноволновой области. При смешивании растворов флуорохромов с немеченными антителами получали результирующий спектр поглощения, равный сумме спектров поглощения смешиваемых компонентов, что указывало на отсутствие образования связей между ними в момент смешивания и отсутствие иных поглощающих компонентов в смеси. После конъюгации белка с флуорохромом спектральные характеристики выглядели иначе. Во-первых, конъюгаты имели два выраженных пика поглощения, соответствующих белку и связанному красителю. При этом пик, характерный для белковых веществ, находился в области поглощения 380-460 нм, но при конъюгации с ФИТЦ смещался в коротковолновую область, а при конъюгации с Alexa Fluor 532 - в длинноволновую область спектра на 20-30 нм. Значение максимума второго пика поглощения, соответствующего флуоресцентной метке, оставалось на прежнем уровне. Изменение оптической характеристики, выраженное в смещении максимума поглощения белкового ком-
ПРИРОДНО-ОЧАГОВЫЕ ИНФЕКЦИИ И ИНВАЗИИ
понента, связано с образованием нового соединения и свидетельствовало о конъюгации белка с флуорохромом.
Предел чувствительности полученных флуоресцирующих конъюгатов оценивали в сравнении с коммерческим ФИТЦ-конъю-гатом антирабического иммуноглобулина, используемым для диагностики бешенства у животных (ФГБУ «ВНИИЗЖ», Россия). Для оценки флуоресценции использовали четырехбалльную систему, которая описана в инструкции по применению указанного конъ-югата. В каждую лунку микропланшета, за исключением зоны отрицательного контроля, вносили равное количество питательной среды, вирусосодержащей суспензии и клеточной культуры, после чего планшет инкубировали в течение 3 сут в условиях С02-инкубатора (5 % CO2, 37 °C). По истечении срока инкубации осуществляли окрашивание клеточной культуры экспериментальными и коммерческим флуоресцирующими конъюгатами в течение 1 ч при 37 °C. Экспериментальные конъюгаты с ФИТЦ готовили в серийных двукратных разведениях от 1:10 до 1:160, конъюгаты с Alexa Fluor 532 - в серийных пятикратных разведениях от 1:10 до 1:1250. Коммерческий ФИТЦ-конъюгат готовили в разведении 1:40, рекомендованном инструкцией по применению.
При визуальной оценке эффективности применения экспериментального ФИТЦ-конъюгата установлено оптимальное рабочее разведение, соответствующее значению 1:80. При этом свечение инфицированных клеток
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Гаврилова Ю.К., Генералов С.В., Киреев М.Н., Шарапова Н.А., Абрамова Е.Г., Савицкая Л.В., Овчинникова М.В., Кириллова Т.Ю., Семакова А.П. Разработка схемы получения антител к рибонуклео-протеину аттенуированного вируса бешенства // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2019. № 5. С. 3-8.
2. Гаврилова Ю.К., Генералов С.В., Абрамова Е.Г., Савицкая Л.В., Галкина М.В., Кочкин А.В. Экспресс-анализ активности антирабических сывороток и иммуноглобулина в клеточных культурах методом иммунофлуоресценции // Биотехнология. 2018. Т. 34, № 4. С. 83-88.
3. Грибенча С.В., Козлов А.Ю., Костина Л.В., Елаков А.Л., Лосич М.А., Цибезов В.В., Забережный А.Д., Алипер Т.И. Получение моноклональных антител к нуклеопротеину вируса бешенства // Вопросы вирусологии. 2013. Т. 58, № 5. С. 38-43.
оценивали не менее, чем на 3 балла, также, как и при окрашивании коммерческим конъюгатом в разведении 1:40. При увеличении степени разведения раствора конъюгата свечение инфицированных клеток становилось менее заметным, а результаты оценивали на 1 или 2 балла.
При визуальной оценке результата использования конъюгата антител с Alexa Fluor 532 специфическое свечение образцов, содержащих вирус бешенства, с интенсивностью не менее, чем на 3 балла, отмечено при его разведении не более, чем 1:250. При увеличении степени разведения раствора конъюгата окрашивание образцов проходило с меньшей эффективностью.
В результате исследования показана возможность получения и использования при исследовании образцов инфицированных вирусом бешенства клеточных культур методом прямой флуоресценции экспериментальных конъюгатов антител к рибонуклеопротеину вируса бешенства с флуорохромами ФИТЦ и Alexa Fluor 532. Рабочие концентрации указанных конъюгатов соответствуют значениям 1:80 и 1:250, что превосходит значение рабочей концентрации коммерческого флуоресцирующего конъюгата антирабического иммуноглобулина с ФИТЦ.
Проведенные исследования подтвердили возможность применения спектрофотомет-рии, позволяющей на основе анализа спектров дифференцировать конъюгаты от несвязав-шихся флуорохромов и антител, для контроля получаемых флуоресцирующих конъюгатов.
REFERENCES
1. Gavrilova YU.K., Generalov S.V., Kireev M.N., SHarapova N.A., Abramova E.G., Savickaya L.V., Ovchinnikova M.V., Kirillova T.YU., Semakova A.P. Razrabotka skhemy polucheniya antitel k r ibonukleo-proteinu attenuirovannogo virusa beshenstva // ZHur-nal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2019. № 5. S. 3-8.
2. Gavrilova YU.K., Generalov S.V., Abramova E.G., Savickaya L.V., Galkina M.V., Kochkin A.V. Eks-press-analiz aktivnosti antirabicheskih syvorotok i immunoglobulina v kletochnyh kul'turah metodom immunofluorescencii // Biotekhnologiya. 2018. T. 34, № 4. S. 83-88.
3. Gribencha S.V., Kozlov A.YU., Kostina L.V., Elakov A.L., Losich M.A., Cibezov V.V., Zaberezhnyj A.D., Aliper T.I. Poluchenie monoklonal'nyh antitel k nukleoproteinu virusa beshenstva // Voprosy viru-sologii. 2013. T. 58, № 5. S. 38-43.
4. Мовсесянц А.А., Бутырский А.Ю., Бондарев В.П., Олефир Ю.В., Постнова Е.Л., Мухачева А.В. К вопросу о применении гетерологичного антирабиче-ского иммуноглобулина для специфической профилактики бешенства у людей // Эпидемиология и вак-цинопрофилактика. 2015. Т. 84, № 5. С. 85-89.
5. Спицын А.Н., Уткин Д.В., Киреев М.Н., Овчинникова М.В., Кузнецов О.С., Ерохин П.С., Кочубей В.И. Спектрофотометрическая характеристика конъюгатов иммуноглобулинов для диагностики возбудителей особо опасных инфекций // Оптика и спектроскопия. 2020. Т. 128, № 3. С. 430-434.
6. Caporale G.M.M., Silva A. de C.R., Peixoto Z.M.P., Chaves L.B., Carrieri M.L., Vassao R.C. First production of fluorescent anti-ribonucleoproteins conjugate for diagnostic of rabies in Brazil // J. of clinical laboratory analysis. 2009. Vol. 23. P. 7-13.
7. Fooks A.R. Jackson A.C. Rabies scientific basis of the disease and its management. Elsevier Science, 2020. 4 th ed. 750 p.
8. Meslin, F.X. Laboratory techniques in rabies / edited by F.X. Meslin, M.M. Kaplan, H. Koprowski. 4 th ed. Geneva : WHO, 1996. 469 p.
9. Silva G.H., Silva J.H.S., Iamamoto K., Arruda T.S., Katz I.S.S., Fernandes E.R., Guedes F., Rodrigues da Silva A.C., Silva S.R. Performance evaluation of the polyclonal anti-rabies virus ribonucleoprotein IgG antibodies produced in-house for use in direct fluorescent antibody test // J. Virol. Methods. 2020. Vol. 280. P. 113879.
10. Um J., Chun B.C., Lee Y.S. Hwang K.J., Yang D.K., Park J.S., Kim S.Y. Development and evaluation of an anti-rabies virus phosphoprotein-specific monoclonal antibody for detection of rabies neutralizing antibodies using RFFIT // PLoS Negl. Trop. Dis. 2017. Vol. 11, № 12. P. e0006084.
4. Movsesyanc A.A., Butyrskij A.YU., Bondarev V.P., Olefir YU.V., Postnova E.L., Muhacheva A.V. K voprosu o primenenii geterologichnogo antirabiche-skogo immunoglobulina dlya specificheskoj profi-laktiki beshenstva u lyudej // Epidemiologiya i vakcinoprofilaktika. 2015. T. 84, № 5. S. 85-89.
5. Spicyn A.N., Utkin D.V., Kireev M.N., Ovchinnikova M.V., Kuznecov O.S., Erohin P.S., Kochubej V.I. Spektrofotometricheskaya harakteristika kon"yugatov immunoglobulinov dlya diagnostiki voz-buditelej osobo opasnyh infekcij // Optika i spektroskopiya. 2020. T. 128, № 3. S. 430-434.
6. Caporale G.M.M., Silva A. de C.R., Peixoto Z.M.P., Chaves L.B., Carrieri M.L., Vassao R.C. First production of fluorescent anti-ribonucleoproteins conjugate for diagnostic of rabies in Brazil // J. of clinical laboratory analysis. 2009. Vol. 23. P. 7-13.
7. Fooks A.R. Jackson A.C. Rabies scientific basis of the disease and its management. Elsevier Science, 2020. 4 th ed. 750 p.
8. Meslin, F.X. Laboratory techniques in rabies / edited by F.X. Meslin, M.M. Kaplan, H. Koprowski. 4 th ed. Geneva : WHO, 1996. 469 p.
9. Silva G.H., Silva J.H.S., Iamamoto K., Arruda T.S., Katz I.S.S., Fernandes E.R., Guedes F., Rodrigues da Silva A.C., Silva S.R. Performance evaluation of the polyclonal anti-rabies virus ribonucleoprotein IgG antibodies produced in-house for use in direct fluorescent antibody test // J. Virol. Methods. 2020. Vol. 280. P. 113879.
10. Um J., Chun B.C., Lee Y.S. Hwang K.J., Yang D.K., Park J.S., Kim S.Y. Development and evaluation of an anti-rabies virus phosphoprotein-specific mon-oclonal antibody for detection of rabies neutralizing anti-bodies using RFFIT // PLoS Negl. Trop. Dis. 2017. Vol. 11, № 12. P. e0006084.
Гаврилова Юлия Кирилловна - научный сотрудник лаборатории профилактических иммуноглобулинов; Генералов Сергей Вячеславович - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории профилактических иммуноглобулинов; Кириллова Татьяна Юрьевна - научный сотрудник лаборатории диагностических препаратов; Киреев Михаил Николаевич - кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории холерных вакцин; Спицын Алексей Николаевич - младший научный сотрудник отдела диагностики инфекционных болезней; ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотреб-надзора, г. Саратов.
