CC BY
211
№ 4 - 2013 г. 03.00.00 биологические науки
УДК 582.284:543.061
ПОЛУЧЕНИЕ ЭКСТРАКТОВ И ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ИЗ FOMES FOMENTARIUS
М. А. Проценко
ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»
(г. Новосибирск)
Получены сухие этанольные экстракты плодовых тел и культивируемого мицелия гриба Fomes fomentarius, оптимизированы условия процесса экстрагирования. Исследован качественный состав сухих спиртовыхэкстрактов. Проведено количественное определение белка, полисахаридов и флавоноидов в сухих этанольных экстрактах плодового тела и мицелия Fomes fomentarius. Характеристика экстрактов дает возможность прогнозировать их биологическую активность.
Ключевые слова: гриб Fomes fomentarius, высшие базидиомицеты, сухой этанольный экстракт, биологически активные вещества, флавоноиды, полисахариды.
Проценко Мария Анатольевна — младший научный сотрудник ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», рабочий телефон: 8 (383) 363-47-44, e-mail: protsenko_ma@vector.nsc.ru
Перспективными в настоящее время считаются лекарственные средства природного происхождения, например, на основе грибов, так как они имеют заметные преимущества перед синтетическими препаратами. К таким преимуществам относятся мягкое воздействие на организм, малая частота наступления побочных эффектов, разнообразие биологически активных веществ (БАВ) и эффектов, возможность применения как для профилактики, так и для лечения заболеваний. Одним из наиболее распространенных дереворазрушающих грибов среди лесных базидиомицетов (от 50 до 76°%) является трутовик настоящий Fomes fomentarius [1]. В исследованиях экстрактов этого базидиомицета выявлено антипролиферативное воздействие in vitro на клетки рака желудка, стимуляция тканевого дыхания, иммуностимулирующий эффект, а также снижение активности ферментов супероксиддисмутазы и каталазы [3, 7, 8].
Цель работы — разработать технологию получения сухого этанольного экстракта из высших базидиомицетов на примере Fomes fomentarius. В связи с этим следует провести оптимизацию условий экстракции по химическому составу.
Материалы и методы. Объектом исследования служили плодовые тела ¥вше8 /отеШапт, собранные в экологически чистых лесных зонах Новосибирской области в Караканском бору в августе 2011 года, а также выделенный в культуру мицелий Fomes /отеШапт штамм Кр-112, депонированный в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Биомассу получали на круговых качалках при 160 об/мин, температуре 26 ± 2 °С, в течение 10-ти суток в жидкой питательной среде. Состав среды: кукурузная мука — 53 г/л; пептон — 3,2 г/л; КН2РО4 — 2,6 г/л; MgSO4 — 0,2 г/л; СаСЬ — 0,1 г/л. Для анализа БАВ, содержащихся в сухих спиртовыхэкстрактах, использовался комплекс физико-химических методов. Количественное содержание белка в образцах определяли методом Бредфорда [6], полисахаридов — модифицированным антроновым методом Дрейвуда [4]. Качественный анализ кумаринов и фенольных соединений проводили с помощью химических реакций; каротиноидов, флавоноидов и тритерпенов — методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Для анализа флавоноидов использовали систему растворителей: этилацетат-безводная муравьиная кислота-вода (20 : 2 : 3); для тритерпенов и каротиноидов — систему бутанол-этанол-аммиак (10 : 4 : 4). Количественное определение содержания флавоноидов в этанольных экстрактах проводили спектрофотометрическим методом при длине волны 380 нм в пересчете на дигидрокверцетин, используя реакцию комплексообразования с алюминия хлоридом [2].
Результаты. Известно, что основными факторами, влияющими на скорость и полноту экстракции БАВ из грибов, являются метод экстракции, тип и концентрация экстрагента, температура, продолжительность экстракции, степень измельчения сырья и др. При выборе оптимальных параметров экстракции за основной критерий принимали процент выхода экстрактивных веществ. Используя многофакторное планирование эксперимента, оптимизировали параметры выделения БАВ. В экспериментах варьировали такие параметры процесса экстракции как температура и время. Концентрация экстрагента (этанол 70 %), отношение сырья к экстрагенту (1 : 50) и кратность экстрагирования (4) оставались постоянными.
Определение оптимального времени экстрагирования БАВ проводили при температуре 60 °С. На основании результатов, представленных в табл. 2, показано, что выход экстрагируемых веществ (ЭВ) максимален при суммарном времени экстракции 64 часа. Но учитывая тот факт, что при увеличении параметра время с 8 до 24 час выход ЭВ увеличивается на 2 %, при увеличении с 24 до 64 час выход ЭВ увеличивается на 14 % и, принимая во внимание энергетические затраты на поддержание температуры процесса 60 °С, оптимальное время экстракции 8 часов.
Важным условием при получении экстрактов является температура экстрагирования, так как она влияет на скорость извлечения веществ. В табл. 2 показан выход ЭВ при температурах 25, 40 и 60 °С в процессе экстракции дробной мацерацией 4-кратно по 6 часов. Показано, что выход экстрактивных веществ при увеличении температуры с 25 до 40 °С увеличивается на 13 %, с 25 до 60 — на 35 %. Кроме того, при увеличении температуры процесса экстракции увеличивается выход флавоноидов от (182 ± 9) мг/г при 25 °С до (304 ± 15) мг/г при 60 °С. Следовательно, оптимальна температура экстракции 60 °С. Следует сказать, что увеличение температуры экстракции 70 % этанолом выше 60 °С считается нетехнологичным, в серии экспериментов нет таких данных.
Известно, что процесс экстрагирования интенсифицируется за счет воздействия сверхвысоких частот (СВЧ) [5]. В эксперименте отжатое сырье между этапами экстракции подвергали СВЧ-излучению мощностью 600 Вт в течение 30 с в расчете на сырье весом 10 г. Показано, что обработка плодовых тел Fomes/отеЫапт СВЧ-излучением приводит
к увеличению выхода ЭВ на 7 % относительно экстракции без таковой обработки. Факт увеличения выхода экстрактивных веществ определит дальнейшую серию экспериментов по оптимизации параметров СВЧ-обработки в процессе экстрагирования.
На основании экспериментальных данных по экстрагированию был проведен многофакторный анализ и рассчитаны коэффициент корреляции и коэффициент вариации (табл. 1).
Таблица 1
Многофакторный анализ технологических параметров экстрагирования БАВ
из плодовых тел Fomesfomentarius
Параметр Коэффициент корреляции Коэффициент вариации, %
Общее время экстракции 0,67 99
Температура экстракции 0,99 32
Поскольку коэффициент корреляции отражает тесноту связи между фактором и функцией, то делается вывод, что температура экстракции является наиболее значимым параметром.
Итак, выявлены оптимальные технологические параметры процесса получения этанольного сухого экстракта: температура 60 °С, соотношение сырья к экстрагенту 1 : 50, время экстракции 8 час, кратность экстрагирования — 4.
Используя выявленные оптимальные параметры экстракции, был получен этанольный экстракт из культивируемого мицелия Fomes /отеШапш штамм Кр-112,выход которого в пересчете на сухой мицелий составил 38 %. Содержание водорастворимого белка в пересчете на сухой экстракт составило (3,7 ± 0,2) мг/г, водорастворимых полисахаридов — (110 ± 3) мг/г, фенольные соединения отсутствуют.
Изучение группового химического состава полученных сухих спиртовых экстрактов из плодового тела гриба подтвердило наличие в данном грибе разнообразных групп БАВ, таких как белки, полисахариды, тритерпены, кумарины, каротиноиды, фенольные соединения. Методом ТСХ, при использовании в качестве стандартных образцов флавоноидов (рутин, лютеолин-7-гликозид и дигидрокверцетин) в спиртовых экстрактах плодовых тел Fomes /отеПапш обнаружены флавоноиды дигидрокверцетин и лютеолин-7-гликозид. УФ-спектры спиртового экстракта в реакции с алюминия хлоридом были сняты на спектрофотометре PD-303UV. Максимум поглощения при дифференциальной спектроскопии выявлен в диапазоне 350-380 нм. В связи с этим количественное определение флавоноидов проводили в пересчете на дигидрокверцетин спектрофотометрическим методом при длине волны 380 нм. Результаты исследования группового состава БАВ в сухих этанольных экстрактах из плодового тела Fomes /отеШапшпредставлены также в табл. 2.
Таблица 2
Влияние технологических параметров на выход ЭВ и характеристики экстрактов
из плодовых тел Fomesfomentarius
Исследуемый параметр Выход ЭВ, % Исследуемый параметр Выход ЭВ, %
Время экстракции общее при температуре 60°С Температура экстракции в течение 6 часов
Время, час Выход, % Сод-е белка, мг/г Сод-е ПС, мг/г Сод-е ФЛ, мг/г Температура, °С Выход, % Сод-е белка, мг/г Сод-е ПС, мг/г Сод-е ФЛ, мг/г
8 5,5 ± 0,1 23 ± 2 152 ± 5 303 ± 13 25 4,2 ± 0,1 7 ± 2 105 ± 5 182 ± 9
24 5,7 ± 0,1 9 ± 1 123 ± 4 304 ± 15 40 4,8 ± 0,1 17 ± 3 107 ± 5 250 ± 11
64 6,5 ± 0,1 47 ± 5 181 ± 12 115 ± 8 60 5,7 ± 0,1 9 ± 1 <123 ± 4 304 ± 15
96 6,4 ± 0,2 42 ± 6 126 ± 6 86 ± 4
Примечание: ПС — полисахариды, ФЛ — флавоноиды
Установлено, что содержание водорастворимых белков в пересчете на сухой экстракт из плодового тела гриба Fomes fomentarius находится в пределах от 5 до 52 мг/г сухого экстракта, водорастворимых полисахаридов — от 100 до 185 мг/г сухого экстракта, спирторастворимых флавоноидов — от 82 до 319 мг/г сухого экстракта. Выявлено, что при увеличении времени экстракции снижается содержание флавоноидов в сухом экстракте.
Выводы. Установлены оптимальные условия получения сухого спиртового экстракта из гриба Fomes fomentarius. Определены основные группы БАВ, содержащиеся в экстрактах грибаFomes fomentarius. Разработанную технологию получения спиртового экстракта предполагается применить для создания лекарственных препаратов из ряда высших базидиомицетов, тестированных на противовирусную активность. При этом характеристика экстрактов на содержание БАВ — один из этапов стандартизации разрабатываемых биологических препаратов природного происхождения.
Список литературы
1. Арефьев С. П. Системный анализ биоты дереворазрушающих грибов : автореф. дис ... д-ра биол, наук / С. П. Арефьев. — Тюмень : ТюмГУ, 2006. — С. 47.
2. Гринкевич Н. И. Химический анализ лекарственных растений / Н. И. Гринкевич, Л. Н. Сафронич. — М. : Высшая школа, 1983. — 176 с.
3. Кожемякина Н. В. Иммунобиологическая активность мицелия Fomes fomentarius (L. : FR.) Fr. и выделенных из него углеводных фракций / Н. В. Кожемякина, Е. П. Ананьева, С. В. Гурина // Проблемы мед. микологии. — 2010. — Т. 12, № 1.
— С. 27-30.
4. Оленников Д. Н. Модификация антронового метода количественного определения углеводов и его применение для анализа растительного сырья, содержащего полисахариды / Д. Н. Оленников, Л. М. Танхаева // Бюл. сиб. медицины. — 2006.
— Прил. 2. — С. 118-119.
5. Пенджиев Э. Д. Энергоэффективный способ СВЧ-экстракции БАВ из растительного сырья / Э. Д. Пенджиев // Материалы V Всероссийской научной конф. «Химия и технология растительных веществ». — Уфа, 2008. — С. 230.
6. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / М. М. Bradford // Anal. Biochem. — 1976. — Vol. 72. — P. 248-254.
7. Jeong-Sook L. Effects of Fomes fomentarius supplementation on antioxidant enzyme activities, blood glucose, and lipid profile in streptozotocin-induced diabetic rats / L. Jeong-Sook // Nutrition Research . — 2005. — Vol. 25, N 2 — P. 187-195.
8. Optimization for the production of exopolysaccharide from Fomes fomentarius in submerged culture and its antitumor effect in vitro / Wei Chena , Zhao Zhao, Shi-Fei Chen a , Li Yong-Quan // Bioresource Technology . — 2008. — Vol. 99, N 8 . — P. 3187-3194.
RECEIVING EXTRACTS AND CHARACTERISTIC OF BIOLOGICALLY ACTIVE INTERCONNECTS FROM FOMES FOMENTARIUS
M. A. Protsenko
FBSE SSC of Virology & bioengineering « Vector» (Koltsovo, Novosibirsk region)
Dry ethanolic extracts of fruits bodies and cultivated mycelium of Fomes fomentarius are received, conditions of extraction process are optimized. The qualitative composition of dry spirituous extracts is investigated. Quantitative definition of protein, polysaccharides and flavonoids in dry ethanolic extracts of fruit body and Fomes fomentarius mycelium is carried out. The characteristic of extracts gives the chance to prognosticate their biological activity.
Keywords: fungus Fomes fomentarius, the highest basidiomycetes, dry ethanolic extract, biologically active agents, flavonoids, polysaccharides.
About authors:
Protsenko Maria Anatolyevna — junior research associate at FBSE State Scientific Center of Virology & bioengineering «Vector», office phone: 8 (383) 363-47-44, e-mail: protsenko_ma@vector.nsc.ru
List of the Literature:
1. Arefyev S. P. Systemic analysis of biota of wooddestructive fungi: autoref. dis ...doc. of biol. sciences / S. P. Arefyev. — Tyumen: TumSU, 2006. — P. 47.
2. Grinkevich N. I. Chemical analysis of herbs / N. I. Grinkevich, L. N. Safronich. — M: The higher school, 1983. — 176 P.
3. Kozhemyakina N. V. Immunobiological activity of mycelium of Fomes fomentarius (L.: FR. ) Fr. and the carbohydrate fractions allocated from it / N. V. Kozhemyakina,
E. P. Ananyeva, S. V. Gurina // Problems of medical mycology. — 2010. — V. 12, № 1.
— P. 27-30.
4. Olennikov D. N. Modification of anthrone method of quantitative definition of carbohydrates and its application for the analysis of the vegetable raw materials containing Polysaccharides / N. D. Olennikov, L. M. Tankhayev // Bulletin sib. medicine.
— 2006 . — Enc. 2. — P. 118-119.
5. Pendzhiyev E. D. Power effective way of microwave extraction of SHF from vegetable raw materials / E. D. Pendzhiyev // Materials of V All-Russian scientific conf. «Chemistry and technology of vegetable substances». — Ufa, 2008. — P. 230.
6. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M. M. Bradford // Anal. Biochem. — 1976. — Vol. 72. — P. 248-254.
7. Jeong-Sook L. Effects of Fomes fomentarius supplementation on antioxidant enzyme activities, blood glucose, and lipid profile in streptozotocin-induced diabetic rats / L. Jeong-Sook // Nutrition Research. — 2005. — Vol. 25, N 2 — P. 187-195.
8. Optimization for the production of exopolysaccharide from Fomes fomentarius in submerged culture and its antitumor effect in vitro / Wei Chena, Zhao Zhao, Shi-Fei Chena, Li Yong-Quan // Bioresource Technology. — 2008. — Vol. 99, N 8. — P. 31873194.
