CC BY
6Список литературы
1. Чхенкели В.А. Курс лекций по ветеринарной микробиологии и иммунологии: учебное пособие/ В.А. Чхенкели, А.Ю. Мартынова. - Иркутск: ИрГСХА, 2011. - С.94
2. Щерба В.В. Лечебно-профилактические препараты многофункционального назначения на основе комплекса соединений лекарственных грибов / В.В. Щерба, Л.В. Пленина Л.В., Гвоздкова Т.С., Бабицкая В.Г. // Успехи медицинской микологии. - 2007. - Т 9. - С. 204-206.
3. Лечение пастереллеза - (Электронный ресурс) -knowledge.allbest.ru/agriculture/2c0a65625a3bd78a 5c53b88521216c37_0.html (Дата обращения -08.05.2015).
4. Пастереллез. Ветеринарная служба - (Электронный ресурс)-
gvet.by/index.php/images/vsp/34%20pererabotka%2 0ptica%20i%20iaico.pdf(AaTa обращения -08.05.2015).
5. Пастереллез крупного рогатого скота - (Электронный ресурс) - vetvo.ru/pasterellez-krupnogo-roga-togo -skota.html (дата обращения - 08.05.2015).
6. Пастереллез крупного рогатого скота - (Электронный ресурс)-www.scienceforum.ru/2014/774/5936 -(дата обращения 08.05.2015).
7. Пастереллез. Научная библиотека - (Электронный ресурс) -www.fmx.ru/selskoe lesnoe xozyajstvo i/ pasterellez.html - (дата обращения 08.05.2015).
8. AgroBelarus. Пастереллез крупного рогатого скота -(Электронный ресурс) - agrobelarus.ru /content/ pasterellez-krupnogo-rogatogo-skota (дата обращения - 08.05.2015).
ПОЛУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРИОННЫЙ БЕЛОК - ИНФЕКЦИОННЫЙ АГЕНТ ГУБКООБРАЗНОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИИ КОРОВ
Надточей Григорий Андреевич
кандидат биологических наук, заведующий лабораторией, ФГБНУ Всероссийский институт экспериментальной
ветеринарии им. Я.Р. Коваленко, г. Москва Антипин Алексей Анатольевич
научный сотрудник, ФГБНУ Всероссийский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко,
г. Москва
OBTAINING OF BIOLOGICAL MATERIAL CONTAINING THE INFECTION AGENT OF BOVINE SPONGIFORM ENCEPHALOPATHY PRION PROTEIN
Nadtochey Grigory Andreevich, Candidate of Science, laboratory head of All-Russian Ja. R. Kovalenko Institute of Experimental Veterinary Science, Moscow
Antipin Alexey Anatolevich, Research scientist of All-Russian Ja. R. Kovalenko Institute of Experimental, Veterinary Science, Moscow
АННОТАЦИЯ
Для получения биологического материала исследованы образцы тканей коров с экспериментальной губкооб-разной энцефалопатией методами патогистологии, ИФА, иммуноблотинга и электронной микроскопии. Получены препараты, содержащие прионный белок - инфекционный агент губкообразной энцефалопатии коров. ABSTRACT
To obtain biological material were investigated tissue samples of cows with experimental bovine spongiform encephalopathy by pathohistology, ELISA, immunoblot- ting and electron microscopy methods. Infection agent of bovine spongiform encephalopathy prion protein containing preparations were obtained.
Ключевые слова: губкообразная энцефалопатия коров. Keywords: prion; bovine spongiform encephalopathy.
Прионы - особый класс инфекционных агентов, вызывающих неизлечимые заболевания центральной нервной системы человека и животных. Они отличаются от других патогенов (вирусов, бактерий и др.) тем, что у них отсутствует какой-либо геном, состоящий из ДНК или РНК, а их инфекционные свойства связаны с белком. Уникальная особенность прионных заболеваний заключается в том, что они могут возникать не только в результате заражения. Известны их спорадические и наследственные формы, причем вне зависимости от происхождения заболевания оно может быть передано далее инфекционным путем. Патогенные прионы отличаются высокой устойчивостью к обычным методам обеззараживания [1].
Среди выявляемых инфекционных прионных заболеваний во многих странах мира наибольшую значимость
приобрела губкообразная энцефалопатия коров (так называемое "бешенство коров") в связи с доказанной возможностью передачи этого заболевания людям и ее эпидемической опасностью [2]. В настоящее время нет полного знания о всех формах структур прионного инфекционного агента, вызывающего губкообразную энцефалопатию коров. В связи с этим для изучения патогенеза и совершенствования диагностических систем для этого заболевания необходимы биологические материалы, полученные в результате экспериментального заражения животных.
Целью исследования было получение биологического материала, содержащего прионный белок - инфекционный агент губкообразной энцефалопатии коров.
Материалы и методы. Объектами исследования были пробы тканей ЦНС коров экспериментально зараженных губкообразной энцефалопатией. Контроль наличия в патологическом материале прионов возбудителей губкообразной энцефалопатии проводили методами ИФА (Kit for Detection TESEE,BioRad) и иммуноблотинга. Наличие специфических патологических изменений в тканях ЦНС определяли гистологическим методом с окрашиванием срезов гематоксилином и эозином. Прионный белок выделялся по методу Prusiner S.B. et al. [3]. Морфологические структуры, образуемые им, изучали электронной микроскопией методом негативного контрастирования на электронном микроскопе JEOL-100CX.
Результаты. Телята были заражены гомогенатом головного мозга больной губкообразной энцефалопатии коровы, полученного из Англии. Животные имели типичную клиническую картину заболевания через 16-28 месяцев после заражения. Для подтверждения диагноза пробы тканей головного мозга коров с экспериментальной губкообразной энцефалопатией, фиксированные нейтральным формалином, были заключены в парафин стандартным гистологическим методом. Приготовленные срезы каждой пробы окрашивали гемотоксилинэозином. Морфологический анализ проб показал наличие в тканях вакуолизации нейронов с билатеральной симметрией и других изменений, характерных для губкообразной энцефалопатии (Рис.1).
Фо
Рисунок 1. Срез продолговатого мозга больной губкообразной энцефалопатией коровы №8645.
Вакуолизация нейронов. Х 150.
Отделы головного мозга разделяли и хранили при - 800 С до использования.
Наличие в них прионов возбудителей губкообразной энцефалопатии определяли методами ИФА (Рис.2).
Стрип 1 Стрип 2
Лунки Материал /оптическая плотность Материал/оптическая плотность
А К-/0,042 ПМ+/1,108
В К-/0,047 ПМ+/1,112
С К+/0,518 К-/0,037
D К+/0,511 К-/0,041
Е МО+/0,567
F МО+/0,583
G СМ ПО+/0,228
Н СМ ПО+/0,275
Рисунок 2. Результаты ИФА на наличие ВоРгР в пробах различных отделов ЦНС больной губкообразной энцефалопатией коровы №8645. К- -отрицательный контроль; К+ -положительный контроль; МО - - мозжечок; СМ ПО + - спинной
мозг, поясничный отдел; ПМ+ -продолговатый мозг.
Прионный белок выделяли методом центрифугирования в градиенте 60%25% (вес/объем) сахарозы при 40000 об/мин в роторе SW 41 Ti в течение 180 минут (Prusiner S.B. et al.). Градиент делили на 3 фракции. Методом Лоури определяли количество белка, содержащегося в верхней, средней и нижней фракциях градиента сахарозы. В качестве стандарта использовали альбумин сыворотки крови коров. Пробы фракций градиента, содержащие примерно
100 нг белка разводили в электрофоретическом буфере для проб, содержащем 2% додецилсульфата натрия и 5% И-меркаптоэтанола и прогревали при 1000С в течение 2 минут. Пробы подвергали электрофорезу в непре-
рывной буферной системе по Лэммли (1970) в 15% по-лиакриламидном геле (микросистема BioRad). В качестве маркеров использовали набор маркеров с низкомолекулярной массой фирмы Фармация. По окончании электрофореза гели окрашивали Кумасси, бриллиантовым синим R или серебром по методу Бюрк Р.Р. соавт. (1983). Основная полоса выявлялась в зоне около 30 кД, слабые полосы контаминации окрашивались в зонах, соответствующих примерно 12 и 40 кД.
Пробы средней и нижней фракций подвергли электрофорезу в 15% ПААГ, как указано выше, и перенесли влажным методом на PVDF мембраны с помощью ячейки мини-трансблот фирмы БиоРад. Иммуноокрашивание
провели моноклональными антителами из набора Био-Рад для выявления прионного белка. Далее дорожку с исследуемым белком обработали мечеными антителами к мышиному иммуноглобулину. Дорожку с маркерами молекулярной массы обработали мечеными кроличьими ан-
тителами к маркерам (БСА, химотрипсину и мономеру ци-тохрома С). В дорожке нижней фракции полоса белка с молмассой 40 кД не выявлена и представляет собой неспецифический белок. В средней полосе градиента специфично окрасились три полосы (Рис. 3).
Рисунок 3. Результаты определения чистоты прионного белка, содержащегося в средней и нижней фракциях сахарозного градиента методом иммуноблота. Дорожка 1 - Проба нижней фракции сахарозного градиента;
- специфическая иммунореакция выявлена с белками 14 и 30 кД. Белок 40 кД не дал специфического иммуно-
окрашивания. Дорожка 2 и 4 Пробы ткани
- продолговатого мозга здоровой коровы, обработанной аналогично опытному материалу. Специфическая иммунореакция не выявлены. Дорожка 3 - Проба средней фракции сахарозного градиента. Специфическая
иммунореакция
- выявлена с белками молекулярной массой 14, 30 и примерно 45-50 кД, в зоне 40 кД иммунореакция не выяв-
лена.Дорожка 5 - Маркеры молекулярной массы: - БСА, И- химотрипсин и мономер цитохрома С.
Морфологическую структуру белков фракций, полученных методом градиентного ультрацентрифугирования, изучали электронной микроскопией методом негативного контрастирования. в электронном микроскопе
JEOL100CX. В обеих фракциях выявлены многочисленные фибриллы диаметром 10-20 нм длинной от 165 до 215 нм. (Рис. 4 и Рис. 5)
Рисунок 4. Электронная фотография пробы нижней фракции сахарозного градиента. Группа свободно лежащих фибрилл. Х 60000.
Рисунок 5. Электронная фотография пробы средней фракции сахарозного градиента. Скопление фибрилл в виде грозди. Х 45000.
Выводы. Получены препараты, содержащие прион-ный белок - инфекционный агент губкообразной энцефалопатии коров, пригодные для изучения патогенеза и совершенствования диагностических систем выявления прионных инфекций.
Литература
1. Надточей Г.А., Гулюкин М.И. (2012). Прионные инфекции: степень риска для животноводства и населения России. Жизнь без опасностей №2, 40-45. 2. Lasmezas C.I., Fournier J.G., Nouvel V., Boe H., Marce
D., Laumory F., Kopp N., Hauw J.J., Ironside J., Bruce M., Dormont D. and Deslys J.P. (2001). Adaptation of the bovine spongiform encephalopathy agent to primates and comparison with Creutzfeld-Jakob
disease: implications for human health. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 98, 4142-4147. 2. Prusiner S.B. et al. (1993). Immunologic and molecular biologic studies prion proteins in bovine spongiform encephalopathy. J.infect. Dis. 167, 602-613.
НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ДИАГНОСТИКЕ СУБКЛИНИЧЕСКИХ ФОРМ МАСТИТА У КОРОВ
Танбаева Гульнур Айюпбековна
Докторант Казахский Национальный Аграрный Университет, г.Алматы, Казахстан
Мырзабеков Жаксылык Бигулович Профессор Казахский Национальный Аграрный Университет, г.Алматы, Казахстан
Тагаев Орынбай Оразбекович Доцент Казахский Национальный Аграрный Университет, г.Алматы, Казахстан
Токаева Мереке Оруспаевна Профессор Казахский Национальный Аграрный Университет, г.Алматы, Казахстан
Барахов Бахыт Бейсенбаевич
Ст. преподаватель Казахский Национальный Аграрный Университет, г.Алматы, Казахстан
INNOVATIVE APPROACHES TO THE DIAGNOSIS OF SUBCLINICAL FORMS OF MASTITIS IN COWS Tanbayeva Gulnur, phD doctoral of Kazakh National Agrarian University, Almaty, Kazakhstan Myrzabekov Zhaksylyk, professor of Kazakh National Agrarian University, Almaty, Kazakhstan Tagayev Orynbay, Assistant professor of Kostanai State University named after A.Baitursynov, Kostanai, Kazakhstan Tokayeva Mereke, professor of Kazakh National Agrarian University, Almaty, Kazakhstan Barakhov Bakhyt, Assistant professor of Kazakh National Agrarian University, Almaty, Kazakhstan АННОТАЦИЯ
В статье приведены результаты сравнительных исследовании раннего диагностирования субклинических форм мастита у коров в условиях двух хозяйств с разными системами доения. ABSTACT
The article gives the results of the comparative researches of early diagnosis of subclinical forms of mastitis in cows under the conditions of the facilities with different milking systems.
Ключевые слова: диагностика, субклиническая форма мастита, электропроводность, соматические клетки, электронная система контроля.
Keywords: diagnosis, subclinical form of mastitis, electroconductivity, somatic cells, electronic control system.
Среди всех незаразных заболеваний коров воспаление молочной железы является наиболее распространенной патологией и наносит ежегодно значительные экономические убытки хозяйствам и владельцам молочного скота.
В молоке коров, больных маститом, происходят значительные физико-химические изменения, в результате чего оно становится малоценным продуктом питания и теряет свои технологические свойства при промышленной переработке. Кроме этого, воспаление молочной железы ведет к гипогалактии и, в некоторых случаях, к полной атрофии пораженной четверти вымени. При поражении субклиническим маститом одной доли вымени от каждой больной коровы недополучают в среднем до 1015% молока за лактацию [1,с.12].
Применяемые для диагностики маститов препараты несмотря на свою доступность и простоту в использовании имеют некоторые недостатки.
Основным критерием, при изыскании реактива для диагностики субклинической формы мастита, являлось принцип ускорения выпадения в осадок неустойчивых белков молока (коллоидной фазы) и взвешенных в ней клеток (суспензионный) [2,с.32].
В поисках решения этой цели в качестве основного компонента реактива для диагностики мастита использовали поверхностно - активные вещества и индикаторы, позволяющие фиксировать изменения рН смеси молока.
При мастите и других болезнях коров содержание солей в молоке изменяется, следовательно, и электропроводность его также должна колебаться. Это и дало повод использовать указанный показатель для диагностики мастита [3,с.6]. А поскольку в общей массе поголовья воспалением у коров чаще всего поражается одна четверть вымени, реже две и еще реже большее их число. Сравнивая показатели электропроводности молока, полученного из каждой четверти вымени в отдельности, можно дифференцировать мастит от других болезней (в последнем случае электропроводность почти одинаково изменяется во всех четвертях вымени) и выявить пораженные этой болезнью четверти [4,с.1309].
Исходя из вышеизложенного, целью нашей работы было разработать отечественный тест диагностикум для определения субклинических форм мастита у коров и с помощью электронной системы контроля, которая позволяет измерять электропроводность или количество соматических клеток молока диагностировать раннию стадию
