CC BY
64
УДК 677.463.027
ПОЛУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ ВОЛОКОН, МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОБРАБОТКОЙ КСИБЕТЕНОМ-ЦЕЛ
© А.В. Белова, Т.Н. Юданова , Л.С. Гальбрайх
Московский государственный текстильный университет им. А.Н. Косыгина, ул. Малая Калужская, 1, Москва, 119071 (Россия) e-mail: t.n.yudanova@list.ru
С целью получения биоактивного материала медицинского назначения с улучшенными сорбционными характеристиками исследованы закономерности модификации целлюлозного волокнистого носителя путем ферментативной обработки Ксибетеном-Цел. Установлено, что обработка хлопкового волокна ферментом приводит к структурной и химической модификации целлюлозы. Определены условия получения модифицированного материала с бактерицидным действием.
Ключевые слова: целлюлозные волокна, антимикробная активность, ферментативная обработка, Ксибетен-Цел.
Введение
В последние годы области применения волокон с биологической активностью, особенно антимикробной, значительно расширились. Если ранее биоактивные вещества (БАВ) включались в структуру волокнистых материалов для повышения их биоустойчивости или для использования в качестве медицинских средств (шовные нити, раневые покрытия, одежда для спецконтингента и т.п.), то сейчас биоцидная обработка все шире используется в изготовлении таких изделий народного потребления, как одежда, постельное белье и т.д. [1]. Растущий спрос на такие материалы обусловливает актуальность проблемы поиска новых путей их получения.
В структуре перевязочных средств медицинского назначения, несмотря на ощутимый прогресс в этой области, ватно-марлевые повязки занимают основной объем. Это связано с высокими гигиеническим свойствами целлюлозных волокнистых материалов, с простотой их использования, отсутствием токсичности, низкой стоимостью, возможностью стерилизации различными способами. Разработанные к настоящему времени технологии позволяют создавать нетканые, тканые и другие формы перевязочных средств на основе целлюлозных волокон.
К недостаткам перевязочных средств на основе хлопковых волокон относятся низкая капиллярность и индифферентность к течению раневого процесса. Их гигроскопичность повышают путем смешивания с гид-ратцеллюлозными волокнами или химической обработки, после которой к введенным в макромолекулы матрицы функциональным группам присоединяют биологически активное вещество [2].
Поскольку большинство антимикробных веществ содержат аминогруппы [3], представляет интерес введение в состав полимера карбоксильных или альдегидных групп, которые обеспечат образование лабильных химических связей с матрицей и необходимый уровень биологической активности.
Модификация целлюлозного носителя может быть осуществлена различными способами [4]. Среди перспективных следует рассматривать биокаталитические, которые все шире используются в химии волокон для структурной модификации и введения новых функциональных групп в макромолекулу полимера. Так, для структурной модификации целлюлозы применяют целлюлазы - ферменты, катализирующие реакции гидролитического расщепления р-(1,4)-гликозидной связи полисахаридной цепи. В результате разрыхления высокоупорядоченной структуры полисахарида увеличивается доступность функциональных групп ее макромолекул для участия в различных реакциях [5]. В настоящее время для ферментативной обработки цел-
* Автор, с которым следует вести переписку.
люлозных материалов при их отделке используют в основном Целловиридины [6, 7]. В то же время на рынке появляется много новых ферментных препаратов, механизм и эффективность модифицирующего действия которых практически не исследованы.
Цель исследований - изучение закономерностей ферментативной обработки целлюлозного волокна ферментными препаратами с целлюлазной активностью - Ксибетеном-Цел и Целловиридином Г 20Х и получение на его основе биологически активного материала.
Экспериментальная часть
В качестве объектов исследования использовали целлюлозный волокнистый материал (ЦВМ) - хлопковую марлю, ферментные препараты с целлюлазной активностью - Ксибетен-Цел и Целловиридин Г 20Х (Biovet, Болгария). Содержание белка в препаратах, найденно по методу Лоури [8], составило 35%. Целлюлазную активность определяли при рН 6,5 и температуре 55 °С по отношению к карбоксиметилцеллюлозе (молекулярная масса 50 кДа); изменение вязкости субстрата контролировали вискозиметрическим методом.
Ферментативную обработку материала проводили при модуле 30, температуре 55 °С, рН 5,5 и заданных продолжительности процесса и концентрации фермента. Содержание фермента в реакционной среде выражали в процентах от массы ЦВМ (% масс.).
Обработку антимикробным веществом осуществляли путем импрегнирования с последующей сушкой при 80 °С в течение 5 мин.
Капиллярность (Н) ЦВМ определяли по методу [9]; скорость сорбции (V) - из уравнений, полученных в результате математической обработки кинетических кривых сорбции; влагоудерживающую способность -по модифицированной методике, описанной в ГОСТ 3816-81: образец выдерживали в воде в течение 30 мин при комнатной температуре, затем помещали между несколькими слоями фильтровальной бумаги и однократно прокатывали цилиндром с массой 112,5 г.
Статическую обменную емкость определяли по методу [10], содержание карбонильных групп - по методу [11].
ИК-спектры образцов регистрировали на спектрофотометре Specord M 80 Carl Zeiss Jena.
Обсуждение результатов
Результаты сравнительного исследования свойств ЦВМ после обработки ферментными препаратами Целловиридином Г 20Х и Ксибетеном-Цел (КБ-Ц), представленные в таблице 1, демонстрируют различную эффективность биокатализаторов. Использование в качестве катализатора гидролитического расщепления целлюлозы Ксибетена-Цел позволяет получить материалы с высокой капиллярностью и начальной скоростью сорбции воды до 8,3 мм/мин. Поэтому в дальнейших исследованиях применяли Ксибетен-Цел.
Согласно полученным данным (рис. 1) Ксибетен-Цел обладает невысокой термостабильностью: после инкубации в течение 1 ч при температуре 55 °С теряет 40% первоначальной активности. Константа инактивации фермента при этой температуре равна 1,0 ч-1. Это сказывается на сорбционных характеристиках материала и делает нецелесообразным увеличение продолжительности гидролиза более 1 ч.
Поскольку в условиях проведения исследуемого процесса имеет место гетерогенный катализ, для повышения адсорбции фермента к поверхности субстрата - целлюлозе в реакционную среду вводили неионогенное поверхностно-активное вещество - полиэтиленгликоль (ПЭГ) с различной молекулярной массой. Использование ПЭГ с молекулярной массой 4 кДа позволило повысить капиллярность ЦВМ и скорость сорбции воды (табл. 2). Влагоудерживающая способность волокон после ферментативной обработки увеличилась в 2-2,5 раза по сравнению с исходной и составила 3-3,6 г воды/г материала.
Таблица 1. Кинетические характеристики процесса сорбции воды ЦВМ после ферментативной обработки в
различных условиях
Фермент Содержание фермента в реакционной среде, % масс. от ЦВМ Продолжительность ферментативной обработки, ч
1 2
V, мм/мин Н, мм V, мм/мин Н, мм
ЦВ-Г20Х 10 5,7 51 6,7 60
КБ-Ц 10 8,3 55 4,7 42
КБ-Ц 20 6 54 6,7 54
Рис. 1. Кинетика инактивации Ксибетена-Цел при температуре 55 °С
Продолжительность инкубации, ч
Таблица 2. Кинетические характеристики процесса сорбции воды ЦВМ после ферментативной обработки в присутствии ПЭГ
Содержание фермента в реакционной среде, % масс. от ЦВМ ММ ПЭГ, кДа V, мм/мин Н, мм
10 - 8,3 55
10 4 9,3 85
20 4 9,3 60
10 6 8,3 65
20 6 8,0 60
'Концентрация ПЭГ в растворе 1%.
Более высокая эффективность Ксибетена-Цел по сравнению с Целловиридином Г 20Х может объясняться различным соотношением эндо- и экзоцеллюлаз, входящих в состав используемых комплексных ферментных препаратов. В состав Ксибетена-Цел входят эндоцеллюлазы, гидролиз которыми приводит к резкому снижению степени полимеризации полисахарида и уменьшению степени упорядоченности структуры.
Анализ функционального состава целлюлозных материалов до и после обработки Ксибетеном показал, что статическая обменная емкость материалов увеличилась с 0,09 до 0,45 ммоль/г, содержание карбонильных групп - с 0,07 до 0,75%.
Результаты химического анализа были подтверждены данными ИК-спектроскопии. Поскольку наряду с целлюлазами Ксибетен содержит в незначительном количестве ферменты класса оксидаз, увеличилась интенсивность полос поглощения не только -ОН, но и -СООН и -С=О групп. Таким образом, в реакционной системе кроме реакции гидролиза гликозидной связи протекают биокаталитические процессы окисления с образованием альдегидных и карбоксильных групп. Полученные результаты позволяют утверждать, что обработка Ксибетеном приводит как к структурной, так и к химической модификации ЦВМ.
Модифицированные целлюлозные материалы использовали для присоединения антимикробных веществ: фурагина, хлоргексидина биглюконата, ципрофлоксацина. Поскольку антимикробная активность материала проявляется в результате десорбции из него активного вещества, была изучена кинетика десорбции этих веществ. Как видно из представленных на рисунке 2 данных, фурагин десорбируется практически полностью за 5 мин. С меньшей скоростью, но полностью десорбируется и ципрофлоксацин. Хлоргексидина биг-люконат выделяется в модельную среду с максимальной скоростью также в первые 5 мин. Однако в принятых условиях десорбции 25% от введенного в матрицу вещества остаются прочно связанными (рис. 3). Очевидно, это обусловлено ионными и ковалентными связями между хлоргексидином биглюконатом и модифицированной целлюлозой. Установленные отличия кинетики десорбции антимикробных веществ объясняются разными кислотно-основными свойствами: фурагин обладает слабокислотными свойствами, ци-профлоксацин - слабое основание, хлоргексидин - сильное основание [12].
Согласно данным о кинетике десорбции хлоргексидина биглюконата при повышении температуры с 25 до 37 °С скорость десорбции величивается в 1,2 раза. Количество вещества в модельной среде (Р, мг/г) при температуре 25 °С описывается зависимостью Р = 0,55т, при 37 °С - Р = 0,67т (где т<5 мин). Увеличение объема сорбента (модуль 100) ускоряет десорбцию в 1,24 раза при температуре 37 °С: Р = 0,83т (где т<4 мин).
Анализ кинетики десорбции антимикробных веществ в логарифмических координатах уравнения Фика (1) показывает, что не во всех случаях процесс десорбции подчиняется закону Фика (рис. 4, 5). Исследуемые материалы следует рассматривать как лекарственные формы, выделяющие активное вещество. Механизм этого выделения может быть разным. Согласно [13] о диффузии вещества во внешнюю среду в соответствии с зако-
ном Фика можно говорить, если п<0,5. В том случае, когда носитель является сильно набухающим полимером или существуют взаимодействия между активным веществом и матрицей, п>0,5. Именно последнему случаю и удовлетворяют данные, представленные на рисунках 4 и 5. Это можно объяснить увеличением удельной поверхности целлюлозных волокон после ферментативной обработки, усилением адсорбционных взаимодействий, а также образованием химических связей при использовании хлоргексидина биглюконата.
ln(Qx/Qmax) = n lnx,
(1)
где QT - количество вещества, выделившегося из матрицы в модельную среду, мг/г; Qmax - максимальное количество вещества, выделившегося в модельную среду, мг/г; n - показатель степени, который характеризует природу транспорта вещества в системе; т - продолжительность десорбции, мин.
Результаты кинетики десорбции хлоргексидина биглюконата хорошо коррелировали с данными определения антимикробной активности в отношении Staphylococcus aureus методом инфицированного агара (рис. 6). Так, зона подавления роста микроорганизмов вокруг образца размером 10*10 мм, содержащего 1,5% ХГБГ, составляет 25-27 мм, а после десорбции в описанных условиях - 10 мм, т.е. рост микроорганизмов подавляется только под образцом.
а)
б)
Время, мин
Время, мин
Рис. 2. Кинетика десорбции фурагина (а) и ципрофлоксацина (б) из модифицированных образцов. Условия десорбции: 0,9% №С1, модуль 30; температура: 1 - 25 °С, 2 - 37 °С
о о
О о
1
*OS
ч £
Время, мин
Рис. 3. Кинетика десорбции ХГБГ из модифицированных образцов 0,9%-ным раствором №С1. Температура десорбции, °С : 1 - 25; 2, 3 - 37; модуль: 1, 2 - 30, 3 - 100
Рис. 4. Кинетика десорбции фурагина (а) и ципрофлоксацина (б). Температура десорбции, °С: 1 - 25, 2 - 37
Рис. 5. Кинетика десорбции ХГБГ. Температура десорбции, °С: 1 - 25, 2 - 37
Рис. 6. Подавление роста микроорганизмов
Staphylococcus aureus вокруг образца
Выводы
В результате исследования капиллярности, а также химического строения целлюлозы установлено, что ферментативная обработка Ксибетеном-Цел приводит к структурной и химической модификации целлюлозы. Модифицированный материал обладает сорбирующей способностью, в 2-2,5 раза превышающей исходную. Содержание альдегидных групп увеличивается с 0,07 до 0,75%, а статическая обменная емкость -с 0,09 до 0,45 ммоль/г.
Осуществлен выбор антимикробного вещества, позволяющего получить материал с пролонгированным бактерицидным действием. Установлено, что десорбция антимикробных веществ из модифицированной целлюлозной волокнистой матрицы не подчиняется закону Фика, что обусловлено высокой удельной поверхностью и степенью набухания целлюлозы, а также химическим взаимодействием антимикробного вещества с носителем.
Список литературы
1. Губина С.М., Стокозенко В.Г. Технический текстиль: сферы применения и мировое производство // Снабженец. 2007. №5 (553). С. 111-113.
2. Вирник А. Д., Платэ Н.А., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры. М., 1986. 296 с.
3. Афиногенов Г.Е., Панарин Е.Ф. Антимикробные полимеры. СПб., 1993. 264 с.
4. Вирник А. Д. Антимикробные целлюлозные волокнистые материалы // Итоги науки и техники. Химия и технология высокомолекулярных соединений. М., 1986. Т. 21. С. 35-96.
5. Байклз Н., Сегал Л. Целлюлоза и ее производные. М., 1974. Т. 1. 500 с.
6. Барышева Н.В. Разработка основной ферментативной технологии отварки хлопчатобумажных тканей: авто-реф. дис.... канд. техн. наук. М., 2006. 17 с.
7. Афанасьева В.А., Башилова Т.Г., Шкиперова С.А. Новые отечественные препараты для подготовки льняных полуфабрикатов и тканей из них // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д. И. Менделеева). 2002. Т. XLVI, №2. С. 36-42.
8. Lowry O.H., Rosebrogh N.J., Randal R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.
9. Волков В.А., Данюшин Г.В., Семенова Т.В. Лабораторные работы по коллоидной химии. М., 2000. С. 23-24.
10. Зубкова Н.С., Дружинина Т.В. Методическая разработка к лабораторному практикуму по курсу «Сорбционноактивные волокнистые материалы». М., 2001. С. 19.
11. Гальбрайх Л.С., Вихорева Г.А., Скокова И.Ф. Методические указания к лабораторным работам по курсу «Теоретические основы химии высокомолекулярных соединений». М., 2001. Ч. II. С. 34-35.
12. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Харьков, 1997. Т. 1, 2.
13. Datta A. Characterization of polyethylene glycol hydrogels for biomedical applications. India: B.E.University of Pune, 2007. 107 p.
Поступило в редакцию 14 декабря 2009 г.
