CC BY
51
Саратовский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского Саратовское отделение Русского энтомологического общества Саратовское отделение Российского паразитологического общества
ЭНТОМОЛОГИЧЕСКИЕ И ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПОВОЛЖЬЕ
Сборник научных трудов Выпуск 14
Под редакцией доктора биологических наук В. В. Аникина
Саратов 2017
УДК 595.7 + 576.89 ББК 28.083я43 + 28.691.89я43 Э67
Энтомологические и иаразитологические исследования в Повол-
Э67 жье : сб. науч. тр. / под ред. В. В. Аникина.- Саратов, 2017. - Вып. 14. - 100 с. : ил.
В сборнике представлены материалы по вопросам энтомологии и паразитологии исследователей из Волгограда, Саратова, Самары, Ульяновска, Пензы, Саранска, Борка, Санкт-Петербурга, Нижнего Новгорода, Уральска.
Для научных работников, аспирантов, студентов-биологов и экологов.
Главный редактор:
д-р биол. наук, проф. В. В. Аникин
Заместитель главного редактора:
д-р биол. наук, проф. Н. В. Попов
Ответственный секретарь:
канд. биол. наук, доц. О. В. Синичкина
Редакционная коллегия:
д-р биол. наук, проф. В. В. Золотухин (Ульяновск), канд. биол. наук А. С. Сажнев (Борок), канд. биол. наук Т. А. Трофимова (Самара), д-р биол. наук, проф. Г. В. Шляхтин (Саратов)
УДК 595.7 + 576.89 ББК 28.083я43 + 28.691.89я43
ISSN 1608-9073
© Саратовский государственный
университет, 2017 © Саратовское отделение РЭО, 2017
Полуконова Н. В., Дёмин А. Г., Шайкевич Е. В., Мюге Н. С. Сравнение Chironomus usenicus и Ch. curabilis с видами группы plumosus (Diptera) по гену митохондриальной днк COI и рисунку дисков политеннык хромосом // Генетика. 2009. Т. 45, №8. С. 1-7.
Черновский А. А. Определитель личинок комаров семейства Tendipetidae. М., Л.: АН СССР, 1949. 182 с.
HillisD. M. Inferring complex phylogenies // Nature. 1996. Vol. 383. P. 130-131.
Swofford D. L., Olsen G. J., Waddell P. J., Hillis D. M. Phylogenetic Inference / In Molecular Systematics. Sunderland: Sinauer Associates, 1996. P. 407- 514.
Walker I. R., Mathewes R W. Chironomidae Diptera and postglacial climate change at Marion Lake, British Colombia, Canada // Quaternary Research. 1987. Vol. 27. P. 89-102.
THE STENOCHIRONOMUS POSITION IN THE CHIRONOMIDAE (NEMATOCERA, DIPTERA) FAMILY ON DENDROGRAMMS OF RELATED RELATIONSHIPS
ON NUCLEAR (18S AND CAD) AND MITOCHONDRIAL GENES (COI, COII)
12 1 N. V. Polukonova , A. G. Demin , D. S. Ostroverkhova
1 Saratov State Medical University, 2St. Petersburg State University
In the article analised the phylogramm built on the basis of DNA sequences of the genus Stenochironomus and subfamilies Chiromidae. It is noted the separation of the branches of this genus from Chironominae and Ortholcadiinae. The possibility of allocation of Stenochironomus in a separate subfamily in the family Chironomidae are discussed.
Key words: Diptera, Chironomidae, phylogeny, nuclear genes, 18S, CAD, mitochondrial genes, COI, COII
УДК 576.316.352.2
ПОЛИТЕННЫЕ ХРОМОСОМЫ ХИРОНОМИД (DIPTERA, CHIROMIDAE) КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ВЛИЯНИЯ НА ДИСКОВУЮ СТРУКТУРУ ИНТЕРФАЗНЫХ ХРОМОСОМ ПРЕДОБРАБОТОК, ПРИМЕНЯЕМЫХ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ G- И ПОКРАСКИ МЕТАФАЗНЫХ ХРОМОСОМ
Л. Е. Сигарева, Н. А. Дурнова, А. А. Оглезнева
Саратовский государственный медицинский университет
Проанализировано влияние на дисковую структуру политенных хромосом хирономид предобработок, необходимых для получения О- и С-дифференциальной окраски метафазных хромосом растений и животных. Результаты анализа полученных данных позволили заключить, что политенные хромосомы двукрылых насекомых (Б1р1ега, Chironomidae) могут служить удобной моделью, как для выяснения механизмов дифференциальной окраски, так и для выяснения роли гетерохроматина в эволюционном процессе генома.
Ключевые слова: хирономиды, политенные хромосомы, О- и С-окраска, гете-рохроматин.
Введение
С разработкой методов дифференциальной окраски метафазных хромосом появилась возможность идентифицировать каждую хромосому в карио-типе, а также выявлять структурные перестройки и районы гетерохроматина в хромосомах. С самого момента открытия явления избирательной окраски хромосом и до настоящего времени не ослабевает интерес к изучению природы и механизмов дифференциальной окраски. Одним из подходов к пониманию природы хромосомной сегментации является выявление связи между дифференциальной деконденсацией участков метафазных хромосом, возникающей в процессе их предварительной обработки, и структурнофункцио-нальными особенностями организации интерфазных и метафазных хромосом. Важным условием неравномерного окрашивания метафазных хромосом является предварительная обработка хромосомных препаратов различными химическими реагентами (трипсин, мочевая кислота для получения О-окраски, сильная щелочь при С-окраске) и растворами солей при определенных рН и температурах, модифицирующими хромосомную структуру.
Целью нашего исследования является анализ данных по влиянию на дисковую структуру политенных хромосом хирономид предобработок, необходимых для получения дифференциальной О- и С-окраски метафазных хромосом животных и растений.
Материал и методы
В работе использованы политенные хромосомы личинок 4-го возраста видов рода СЫгопотш: СИ. рЫтоът и СИ. 1Иытт1, собранных в прудах в окрестностях г. Саратова. Препараты для дифференциальной окраски политен-ных хромосом из слюнных желез нефиксированных личинок хирономид готовили по разработанному нами способу (Сигарева, 1987).
Для выяснения влияния на рисунок дисков политенных хромосом предобработок, применяемых при О-окраске, нами была использована методика окраски метафазных хромосом по С. И. Раджабли и Е. П. Крюковой (1973). Препараты обрабатывали 0.25%-0.025% растворами трипсина при комнатной температуре в течение 3-10 секунд, затем проводили тепловую инкубацию (57-60оС) в стандартном солевом растворе (рН 6.8-7.0). Для окраски по-литенных хромосом по С-методу использовали методику Д. Бедо (Беёо, 1975), включающую обработку препаратов насыщенным раствором гидрата окиси бария с последующей инкубацией в стандартном солевом растворе. Окрашивали препараты азур-эозином по Романовскому (краситель Гимзы), который связывается с ДНК хромосом.
Исследования
Дифференциальная окраска по О-технике наиболее часто используется при исследовании линейной неоднородности метафазных хромосом, так как на основе выявляющегося при этом рисунка дисков, становится возможной идентификация всех хромосом в наборе. Как известно, специфическая дис-
15
ковая структура политенных хромосом представляет собой естественную цитологическую карту с высокой разрешающей способностью, которая превосходит возможности комплексного применения всех методов дифференциальных окрасок метафазных хромосом (Ильинская, 1980).
Проведенная нами предобработка политенных хромосом СЫгопошш рШтозш в течение нескольких секунд растворами с разной концентрацией трипсина приводила к изменению их морфологии и дисковой структуры по сравнению с контролем (рис. 1а).
Рис. 1. Морфология политенных хромосом Chironomus plumo-sus (на примере III (EF) хромосомы): а - окраска без предварительной обработки, 6 - обработка препаратов 0,25% раствором трипсина в течение 5 сек, в - обработка 0,1 % раствором трипсина в течение 10 сек, г - обработка 0,05% раствором трипсина в течение 10 сек; центромера указана стрелкой). (Фото авторов)
Так, обработка препаратов 0.25% раствором трипсина в течение 5 секунд вызвала образование вокруг хромосом окрашивающегося «ореола» из хромосомных фибрилл, а также изменению характерного для политенных хромосом рисунка дисков (см. рис. 16). По длине хромосомы исчезли тонкие диски и чередовались окрашенные и слабо окрашенные участки. Окрашенные участки хромосом соответствовали блокам близкорасположенных друг к другу крупных дисков, хорошо выделяющихся на контрольных препаратах, окрашенных без предварительной обработки трипсином (см. рис. 1а, 6). Из литературы известны ряд подобных фактов изменения структуры метафазных хромосом в результате различных обработок. Например, установлено (Marion et al., 1982), что гистоны перевариваются под действием протео-
литического фермента, а отдельные глобулярные фрагменты хроматина де-конденсируются, по-видимому, это и приводит к образованию вокруг хромосом структур типа «ламповых щеток» или «ореола». Районы политенных хромосом, включающие пуффы и тонкие диски, более чувствительны к действию трипсина, чем крупные и плотно упакованные диски.
Воздействие 0.1% раствором трипсина привело к полному исчезновению дисковой структуры по длине хромосом, при этом чётко окрашивался только центромерный диск (см. рис. 1 в). Подобная картина наблюдается и при С-окраске политенных хромосом данного вида (Белянина, Сигарева, 1978), когда краситель воспринимают лишь участки гетерохроматина. Обработка препаратов 0.05% раствором трипсина в течение 10 секунд вызвала сильное набухание хромосом, каждая из которых представляла собой белковый остов, состоящий из отдельных вздутых, без дисковой структуры сегментов, разделенных перетяжками (см. рис. 1г), окрашивающийся материал сохранялся только в отдельных сегментах, области центромеры и теломер. Отсутствие окраски и дисковой структуры можно объяснить произошедшей экстракцией большой части гистонов и ДНК, которая связывается с красителем Гимзы, а не с белками или другими компонентами хромосомы.
Полученные нами данные также указывают на существование зависимости реакции между отдельными участками интерфазных хромосом от различий в степени их конденсации. При этом О-окраска появляется в результате различной деконденсации хромосомных участков в процессе предварительной обработки, а О-диски соответствуют более упакованным участкам интерфазной хромосомы и могут быть центрами конденсации хромосом в митотическом цикле.
Наиболее информативной дифференциальной окраской политенных хромосом является окраска на гетерохроматин. Сведения о содержании и распределении структурного гетерохроматина в политенных хромосомах разных видов хирономид являются существенным дополнением к кариоти-пической характеристике данной группы двукрылых насекомых (Дурнова, Сигарева, 2011; Дурнова, Сигарева, Оглезнева, 2014; Битоуа, Sigareva, БтюИкша, 2015).
Для выяснения влияния протеолитического фермента на районы гетеро-хроматина использовали политенные хромосомы СИ. 1Иптт1. В отличие от большинства видов рода СЫгопотт в политенных хромосомах СИ. 1Иптт1 нами обнаружено большое количество дисков, окрашивающихся С-окраской на гетерохроматин. Так, в каждой из длинных хромосом выявлялось одновременно по нескольку С-полос в прицентромерной области хромосомы (Сигарева, 1981) с увеличенным диаметром по сравнению с остальной частью хромосомы. Например, в хромосоме I - это группа дисков (рис. 2а) в отделах С и В (деление на отделы по: Кикнадзе, 1978). После обработки препаратов трипсином сохранили способность окрашиваться только диск в отделе В3 (рис. 26) и группа из нескольких тонких дисков, сливающихся в один толстый блок, в отделе В2. Три четких С-диска в отделе С не окраши-
вались, что свидетельствует о разной реакции С-дисков на действие трипсина. Обработка хромосом 0.025% раствором в течение 10 сек. привела к их сильному набуханию, при этом сохранил способность частично окрашиваться только диск в отделе
Рис.2. Морфология политенных хромосом СЫгопотш 1Иитт1 на примере хромосомы I (АВ): а - С-окраска, 6 - обработка препаратов 0,025% раствором трипсина в течение 5 сек, в - обработка 0.025 % раствором трипсина в течение 10 сек. (Фото авторов)
Заключение
Полученные результаты позволяют предположить, что наиболее устойчивыми к действию предобработок, применяемых при О- и С-технике окраски хромосом, являются районы гетерохроматина, гистоны которых менее доступны действию агентов, нарушающих структуру хромосом за счет их большей спирализации.
Наши данные подтверждают предположения о том, что плотность упаковки хроматина является, по крайней мере, одним из факторов, обусловливающих дифференциальное окрашивание метафазных хромосом. Наиболее устойчивыми к действию предобработок, применяемых при О- и С- техниках окраски хромосом, являются районы гетерохроматина, гистоны которых менее доступны действию агентов, нарушающих структуру хромосом. Поли-тенные хромосомы хирономид, являясь интерфазными, представляют собой информативную модель для изучения вопросов, имеющих отношение как к общей проблеме структурно-функциональной организации хромосом, так и
для решения частных вопросов, касающихся цитогенетики, кариосистемати-ки и эволюции данной группы двукрылых насекомых.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Белянина С. И., Сигарева Л. Е. Дифференциальная окраска хромосом хирономид. I. С-диски политенных хромосом Chironomus plumosus // Цитология. 1978. Т. 20 №6. С. 707-709.
Дурнова Н. А., Сигарева Л. Е. Гомеология рисунка дисков политенных хромосом и центромерных районов Glyptotendipes paripes Edwards, 1929 и G. glaucus Meigen, 1818 (Diptera, Chironomidae) // Цитология. 2011. Т. 53. №2. С. 175-183.
Дурнова Н. А., Сигарева Л. Е., Оглезнева А. А. Межхромосомные ассоциации в интерфазных ядрах перифитонных хирономид (Diptera, Chironomidae) // Тр. Русского энто-мол. общества. С.-Петербург. 2014. Т. 82, вып. 2. С 27-39.
Ильинская Н. Б. Функциональная организация политенных хромосом и вопросы ка-риосистематики / В кн.: Новые данные по кариосистематике двукрылых насекомых. Под ред. Л. А. Чубаревой. Л.: 1980. С. 14-22.
Кикнадзе И. И. Сравнительная характеристика пуффинга в хромосомах слюнных желез Chironomus thummi в личиночном развитии и при метаморфозе. 2. Пуффинг в хромосомах I, II, III // Цитология. 1978. Т. 20, №5. С. 514-521.
Раджабли С. И., Крюкова Е. П. Сравнительный анализ дифференциальной окраски хромосом двух видов хомячков: даурского и китайского // Цитология. 1973. T 12. С. 1527-1531.
Сигарева Л. Е. Дифференциальная окраска хромосом хирономид. II. С-диски политенных хромосом трёх видов хирономусов // Цитология. 1981. Т. 23, №3. С. 270-274.
Сигарева Л. Е. Способ приготовления препаратов политенных хромосом для дифференциальной окраски // Авторское свидетельство на изобретение № 1320694. 1987.
Bedo D. G. C-banding in polytene chromosomes of Simulium ornatipes and S. melatum (Diptera: Simuliidae) // Chromosoma. 1975. Vol. 51, №3. P. 291-300.
Durnova N., Sigareva L., Sinichkina O. Chromosome analysis of Endochironomus albi-pennis Meigen, 1830 and morphologically similar Endochironomus sp. (Diptera, Chironomidae) from water bodies of the Volga region, Russia // Comp. Cytogen. 2015. Т. 9, №4. P. 579-593.
Marion C., Pallotta L., Roux B. Effect of digestion with trypsin on chromatin structure // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1982. Vol. 108. P. 1551-1558.
THE POLYTENE CHROMOSOMES OF CHIRONOMIDAE (DIPTERA, CHIRONOMIDAE) AS THE MODEL FOR STUDY THE INFLUENCE ON THE DISK
STRUCTURE OF INTERPHASE CHROMOSOMES PREOPERATOR, USED
TO OBTAIN THE G - AND C-STAINING METAPHASE CHROMOSOMES
L. E. Sygareva, N. A. Durnova, A. A. Oglezneva
Saratov State Medical University
The work analyses influence of pretreatment reguired for obtaining differential G- and C-banding of metaphase chromosomes of plants and animals on disc structure of chironomidae polytene chromosomes (Diptera, Chironomidae). The analysis of the obtained data drives to a conclusion that polyten chromosomes of (Diptera, Chironomidae) may act as an more convenient object for defining mechanisms of differential banding as well as clarification of the heterochromatin role in the evolution process.
Key words: Chironomidae, polytene chromosomes, G- и C-banding, hetero-chromatin.
