CC BY
172
УДК 616.98:612.015.1:616.153.454 DOI: 10.22141/2224-0551.15.4.2020.208478
Абатуров А.Е. ©
ГУ «Днепропетровская медицинская академия МЗ Украины», г. Днепр, Украина
Полисахаридразрушающие ферменты как агенты, диспергирующие бактериальные биопленки
For citation: Zdorov'e Rebenka. 2020;15(4):271-278. doi: 10.22141/2224-0551.15.4.2020.208478
Резюме. Развитие бактериальных биопленок зависит от секреции и сохранения внеклеточных полисахаридов, или экзополисахаридов, которые являются основными компонентами внеклеточного полисахаридно-го вещества биопленок. Экзополисахариды внеклеточного полисахаридного вещества обеспечивают структурную стабильность биопленки, адгезию и агрегацию микроорганизмов, физическую и химическую защиту бактерий от действия противомикробных препаратов и эффекторов иммунной системы макроорганизма. Бактериальные клетки, расположенные в биопленке, защищены от антибактериальных эндо- и экзофакторов внеклеточным полимерным матриксом. Для инициирования диспергирования биопленок микроорганизмы наряду с другими ферментами используют специфические гликозидгидролазы, которые разрушают полисахариды бактериальных биопленок. Гликозидгидролазы реализуют свое действие через гидролиз гликозидных связей: амилазы расщепляют а-1,4-; целлюлазы — в-1,4-; в-галактозидазы — в-1,3-гликозидные связи. Основными гликозидгидролазами, которые обладают антибиопленочным действием, являются: а-лизоцим, амилазы, дисперсин B, целлюлазы, гиалуронидаза, а- и в-маннозидазы, альгинат-лиазы. Данные ферменты вызывают разрушение полисахаридных полимеров, способствуя высвобождению бактерий. Бактерии, которые лишились защиты полисахаридного каркаса, подвергаются воздействию антибактериальных агентов. С учетом того, что деградация экзополисахаридов биопленок гликозидгидролазами приводит к выраженному диспергированию бактерий, данный антибиопленочный метод лечения может представлять собой универсальный подход к терапии инфекций, протекающих с формированием биопленок. Медикаментозные методы диспергирования биопленок при помощи полисахаридразрушающих ферментов, без сомнения, расширят арсенал антибиопленочной терапии хронических и рецидивирующих бактериальных инфекций, особенно вызванных антибиотикорезистентными бактериями.
Ключевые слова: бактериальные биопленки; диспергирование; полисахаридразрушающие ферменты
Введение
Формирование и диспергирование биопленок зависит от секретируемых бактериями внеклеточных полисахаридов, или экзополисахаридов, как основных компонентов внеклеточного полисахаридного вещества (extracellular polysaccharide substance — EPS) биопленок. Экзополисахариды EPS обеспечивают структурную стабильность биопленки, адгезию и агрегацию микроорганизмов, физическую и химическую защиту бактерий от действия противо-микробных препаратов и эффекторов иммунной системы макроорганизма [12]. Микроорганизмы
используют специфические гликозидгидролазы (glycoside hydrolase — GH) для инициирования событий диспергирования. Например, дисперсин B представляет собой в-гексозаминидазу, которая продуцируется грамотрицательной бактерией Aggregatibacter actinomycetemcomitans [24]. Деградация экзополисахаридов EPS рекомбинантными гликозидгидролазами приводит к выраженному диспергированию бактерий, в связи с чем данный подход к разрушению биопленок может представлять собой универсальный метод лечения в клинических условиях инфекций, протекающих с формированием биопленок. Среди
© 2020. The Authors. This is an open access article under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License, CC BY, which allows others to freely distribute the published article, with the obligatory reference to the authors of original works and original publication in this journal.
Для корреспонденции: Абатуров Александр Евгеньевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой педиатрии 1 и медицинской генетики, ГУ «Днепропетровская медицинская академия МЗ Украины», ул. Вернадского, 9, г. Днепр, 49044, Украина; e-mail: alexabaturov@i.ua
For correspondence: Oleksandr Abaturov, MD, PhD, Professor, Head of the Department of pediatrics 1 and medical genetics, State Institution "Dnipropetrovsk Medical Academy of the Ministry of Health of Ukraine', Vernadsky st., 9, Dnipro, 49044, Ukraine; e-mail: alexabaturov@i.ua Full list of author information is available at the end of the article.
полисахаридных гидролизующих ферментов наиболее изученными являются: лизоцим, альгинатные ли-зазы, дисперсин B и амилазы [28].
Основные бактериальные гликозидгидролазы
Основные бактериальные GH, которые обладают способностью деградировать экзополисахариды EPS бактериальной биопленки, представлены в табл. 1.
Гликозидгидролазы представляют собой энзимы, которые гидролизируют гликозидные связи. Сведения о GH аккумулированы в базе данных Cabohydrate-Active enZyme (CAZy http://www.cazy.org/).
Углеводно-активные ферменты, которые разлагают или модифицируют полисахариды, связываются с субстратом при помощи углеводсвязывающего сайта, расположенного вне области активного сайта. Угле-водсвязывающие сайты располагаются на углеводсвя-зывающих модулях (carbohydrate-binding modules — CBM) или на сайтах связывания с поверхностью (surface-binding sites — SBS) (рис. 1).
Целлюлозосвязывающий домен (Cellulose-binding domain — CBD) был первоначально определен как некаталитический полисахаридраспознающий модуль GH. Этот модуль связывает лиганд, такой как целлюлоза и другие углеводы. В настоящее время существует 81 определенное семейство CBM, обладающих аффинитетом к различным лигандам (http://www.cazy.org/ Carbohydrate-Binding-Modules.html) (табл. 2) [3, 7].
Различные GH разрушают определенные гликозидные связи: а-амилазы расщепляют а-1,4-; целлю-лазы — в-1,4-; Р-галактозидазы — Р-1,3-гликозидные связи (рис. 2) [11].
Альфа-амилазы
Ферменты а-амилазы (EC 3.2.1.1), как и дис-персин В (DspB), разрушают биопленки, сформированные бактериями Staphylococcus aureus, EPS которых содержит полисахаридный межклеточный адгезин (polysaccharide intercellular adhesin — PIA)/ полимерный N-ацетилглюкозамин PNAG. Различные а-амилазы, происходящие из разных таксономических источников, могут значительно отличаться друг от друга по предпочтению субстрата [15]. Кроме того, молекулы а-амилаз содержат по меньшей мере две разные аминокислотные последовательности, использующие два разных каталитических механизма, которые эволюционировали для достижения одинаковой а-амилолитической специфичности. В связи с этим амилазы были классифицированы на четыре семейства GH: GH13, GH57, GH119, GH126 [16]. В качестве примера представлено филогенетическое дерево семейства гликозидгидролаз GH13 (рис. 3).
Антибиопленочная активность а-амилазы зависит от ее происхождения. Наиболее высокая антибиопле-ночная активность отмечается у а-амилазы бактерий Bacillus subtilis. В то время как ферменты, полученные из человеческой слюны и сладкого картофеля, не влияют на сформированные патологические биопленки [15, 29, 33].
Представляет интерес то, что а-амилаза преимущественно разрушает биопленки, сформированные чувствительными к метициллину бактериями Staphylococcus aureus (meticillin-susceptible Staphylococcus aureus — MSSA). Продемонстрировано, что чувствительность к метициллину сопряжена с фенотипом бактериальной биопленки. Так, EPS биопленки
Таблица 1. Гликозидазы, участвующие в диспергировании бактериальной биопленки [12]
Фермент Краткая характеристика
a-амилазы (a-amylase) GH, гидролизирующая 1,4-гликозидные связи, участвует в диспергировании зрелых биопленок, образованных бактериями Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa
Дисперсин B (dispersin B) GH бактерий Aggregatibacter actinomycetemcomitans, субстратом которой является поли^(1,6)-^ацетил^-глюкозамин (Poly-ß(1,6)-N-acetyl-D-glucosamine — PNAG). Данный фермент эффективен против биопленок, формируемых бактериями Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Acinetobacter baumannii, Actinobacillus pleuropneumoniae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Burkholderia spp., Yersinia pestis и Pseudomonas aeruginosa
Целлюлазы (cellulase) GH, гидролизирующая ß(1,4)-гликозидную связь. Разрушает биопленки бактерий Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa
Гиалуронидаза (Hyaluronidase) Фермент, который расщепляет гиалуроновую кислоту и способствует деградации биопленок бактерий Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius
a-маннозидазы (a-mannosidase) Кислотная гидролаза, разрушающая биопленки бактерий Pseudomonas aeruginosa
ß-маннозидазы (ß-mannosidase) GH, отщепляющая ß(1,4)-связанные концевые маннозные остатки и разрушающая биопленки бактерий Pseudomonas aeruginosa
Альгинат-лиазы (alginate lyase — algL) GH, которая разрушает экзополисахариды, альгинаты биопленок бактерий Pseudomonas aeruginosa
PelAh GH, разрушающая полисахариды бактерий Pseudomonas aeruginosa
PslGH GH, разрушающая полисахариды бактерий Pseudomonas aeruginosa
метициллин-резистентных бактерий Staphylococcus aureus (meticillin-resistant Staphylococcus aureus — MRSA) содержит аутолизин Atl, eDNA и протеины, связывающие фибронектин, FnBPA и FnBPB (фенотип Atl/FnBP). В то время как EPS биопленки пре-
Рисунок 1. Строение и взаимодействие гликозидгидролаз с целлюлозой (на примере целлюлазы, продуцируемой Trichoderma reesei — TrCel7A) [14] Примечания: A. Доменное строение целлюлазы TrCel7A — углеводсвя-зывающий модуль и каталитический домен, которые соединены линкером. Б. Схема аминокислотной последовательности TrCel7A с расположением сайтов гликозилирования, помеченных красным цветом.
имущественно содержит PIA/PNAG (фенотип PIA/ PNAG) [23].
Установлено, что а-амилаза разлагает биопленку с фенотипом PIA/PNAG, образованную бактериями Staphylococcus aureus, на 79 % в течение 5 минут и на _ 89 % в течение 30 минут инкубации. Влияние амилазы в концентрации 10, 20 и 100 мг/мл приводит к уменьшению объема биопленки Staphylococcus aureus на 72, 89 и 90 % соответственно [8, 17].
Согласно результатам исследования антибиопленочной активности четырех ферментных соединений, проведенного in vitro с использованием модели биопленки бактерий Staphylococcus aureus, которая имитирует раневидные состояния, лизостафин уменьшает биомассу биопленки на 76 %, а а-амилаза, бромелайн и па-паин — на 97, 98 и 98 % соответственно. Сканирующая электронная микроскопия подтвердила, что диспергирующие ферментные агенты отделяют матрицу экзополисахарида биопленки от поверхности, на которой сформировалась биопленка [31].
ДисперсинB
Дисперсин B продуцируется грамотрицательными коккоба-циллами Actinobacillus actinomy-
Таблица 2. Классификация CBM, основанная на специфичности лигандов [3]
Лиганды Семейство СВМ
Целлюлоза CBM1, CBM2, CBM3, CBM4, CBM6, CBM8, CBM9, CBM10, CBM16, CBM17, CBM28, CBM30, CBM37, CBM44, CBM46, CBM49, CBM59, CBM63, CBM64, CBM65, CBM73, CBM76, CBM78, CBM80, CBM81
Ксилан CBM2, CBM4, CBM6, CBM9, CBM13, CBM15, CBM22, CBM31, CBM35, CBM36, CBM37, CBM44, CBM54, CBM59, CBM60, CBM64, CBM72
Стенка клеток растений (например, Р-глюканы, порфираны, пектины, маннаны, глюко- и галактуронаны) CBM4, CBM6, CBM11, CBM13, CBM16, CBM22, CBM23, CBM27, CBM28, CBM29, CBM32, CBM35, CBM39, CBM42, CBM43, CBM52, CBM56, CBM59, CBM61, CBM62, CBM67
Хитин CBM1, CBM2, CBM5, CBM6, CBM12, CBM13, CBM14, CBM16, CBM18, CBM19, CBM50, CBM54, CBM55, CBM73
а-глюканы (крахмал/гликоген, мутант) CBM20, CBM21, CBM25, CBM26, CBM34, CBM41, CBM45, CBM48, CBM53, CBM58, CBM68, CBM69, CBM74
Гликаны млекопитающих CBM32, CBM40, CBM47, CBM51, CBM57
Другие Cахара бактериальной клеточной стенки: CBM35, CBM39, CBM50 Фруктаны: CBM38, CBM66 Глюканы из клеточной стенки дрожжей: CBM54
cetemcomitans и представляет собой антибиопленочный фермент, молекула которого содержит домен, гомологичный каталитическому домену в-гексозаминидаз. Фермент DspB относится к семейству гликозидги-дролаз-20 (GH20) и обладает в-гексозаминидазной (EC 3.2.1.52) и лакто-^биозидазной (ЕС 3.2.1.140) активностью. Бактериальный DspB является мономерным ферментом [24, 25]. Дисперсин B гидролизирует PNAG, необходимый для прикрепления EPS биопленки к поверхности [5, 10, 24].
Дисперсин B проявляет антибиопленочную активность по отношению к биопленкам, сформированным не только коккобациллами Actinobacillus actinomy-cetemcomitans, но и бактериями Staphylococcus epidermi-
dis, Staphylococcus aureus, Actinobacilluspleuropneumoniae; Escherichia coli; Yersinia pestis и Pseudomonas fluorescens [18]. Дисперсин B, являясь эффективным ферментом для разрушения биопленок путем гидролиза PNAG биопленок, не обладает противомикробной активностью, в связи с чем высвобождаемые из разрушенной матрицы EPS бактерий могут инициировать рецидив инфекционного процесса. Для преодоления данного недостатка Kuan-Jung Chen, Cheng-Kang Lee [6], слив молекулу DspB с пептидом AgBP2, связывающим на-ночастицы серебра (AgNP), создали конъюгат AgNP-DspB, который не только разрушает биопленку путем гидролиза PNAG за счет действия DspB, но и вызывает гибель высвобожденных из биопленки бактерий за
Рисунок 2. Таргетные гликозидные связи различных гликозидгидролаз [11]
Рисунок 3. Филогенетическое дерево семейства гликозидгидролаз GH13 [16]
счет действия AgNP. Применение конъюгата AgNP-DspB при биопленке, сформированной бактериями Staphylococcus epidermidis, сопровождалось деградацией 69 % биопленки, в то время как использование только DspB приводило к уменьшению массы биопленки на 37 %. Авторы полагают, что конъюгат AgNP-DspB может быть использован при лечении стафилококковых инфекций раневых поверхностей.
Charlene Babra Waryah и соавт. [30] показали, что ДНКаза I и дисперсин B одинаково способствуют повышению антибактериальной эффективности то-брамицина за счет разрушения Staphylococcus aureus-ассоциированной биопленки. Однако комбинация этих двух разрушающих биопленку ферментов менее эффективно способствует повышению антибактериальной эффективности тобрамицина, чем моноприменение данных ферментов. Эти данные указывают на то, что комбинации различных разрушающих биопленку ферментов могут поставить под угрозу антимикробную эффективность антибиотиков и их необходимо тщательно оценивать in vitro, прежде чем использовать для дезинфекции медицинских устройств или в фармацевтических составах для лечения хронических инфекций респираторного тракта.
Целлюлазы
Целлюлоза, полимер Р-1,4-связанных молекул глюкозы, является основным полисахаридным компонентом клеточных стенок растений и наиболее распространенным органическим полимером на Земле. Семейство гликозидгидролаз-74 (GH74) представляет собой исторически важное семейство
эндо-Р-глюканаз, которое первоначально считалось семейством целлюлазы [2]. Около 24 % бактерий продуцируют целлюлазы. Существует два распространенных типа активных сайтов целлюлаз. Гликозидные гидролизы с открытыми (бороздчатые, расщепленные) активными центрами обычно проявляют эндоцеллю-лолитическую активность (эндоцеллюлазы), связываясь в любом месте по длине молекулы целлюлозы и гидролизуя Р-1,4-гликозидную связь, в то время как те целлюлазы, у которых активный сайт имеет тунне-леподобную форму, проявляют экзоцеллюлолитиче-скую активность (целлобиогидролазы), связываясь на концах молекулы целлюлозы и продуцируя олигоса-харидные продукты единичной длины. Как правило, экзоцеллюлазы являются процессивными ферментами, то есть они прикрепляются к целлюлозной цепи до тех пор, пока она полностью не гидролизируется [19, 27].
Целлюлазы расщепляют Р-1,4-гликозидные связи, и конечным продуктом данного гидролиза является целлобиоза, которая представляет собой дисахарид глюкозы, способный репрессировать целлюлолитиче-ский механизм и подавлять активность целлюлазы [4].
Многочисленные целлюлазы относятся к различным классам GH (табл. 3).
Целлюлаза легко гидролизирует Psl бактерий Pseudomonas aeruginosa и устраняет Psl с поверхности клетки. При обработке целлюлазой Psl, по-видимому, отделяется от поверхности бактерий. Установлено, что целлюлаза может высвобождать Psl с поверхности бактериальных клеток, не разрушая основной полимер Psl. По всей вероятности, данный феномен обуслов-
Таблица 3. Эндо- и экзоцеллюлазы [27]
CAZy семейство Складка Тип действия
GH5 (Р/а)8 Эндо
GH5 (P/a)s Экзо
GH6 Аtypicаl р/а barrel Эндо
GH6 Аtypical р/а barrel Экзо
GH7 P-jelly roll Эндо
GH7 P-jelly roll Экзо
GH8 (а/а)6 Эндо
GH9 (а/а)6 Эндо
GH9 (а/а)6 Экзо
GH12 P-jelly roll Эндо
GH23 а8 superhelical Эндо
GH44 (Р/а)8 Эндо
GH45 P6-barrel Эндо
GH48 (а/а)6 Эндо
GH48 (а/а)6 Экзо
GH51 (Р/а)8 Эндо
GH61 P-sandwich with an Ig-like topology. Рда5 Эндо
GH74 7-fold р-propeller Эндо
лен тем, что ß-1,3- или ß-1,4-связанная глюкоза может быть моносахаридом, который связывает Psl с бактериальной поверхностью [22].
Альгинат-лиазы
Альгинат представляет собой линейный анионный полисахарид с высокой молекулярной массой, который состоит из ß-1,4-гликозидно-связанной a-L-гулуроновой (G) и ß-D-маннуроновой (M) кислоты и является характерным компонентом биопленки бактерий Pseudomonas и Azotobacter. Альгинат защищает бактерии от агрессивных факторов окружающей среды и способствует их адгезивной активности. Гены, участвующие в синтезе альгината, транскрибируются при адгезии бактерий к поверхностям, что приводит к развитию биопленки. При определенных условиях бактерии Pseudomonas aeruginosa экспрессирует algL, которая расщепляет альгинатный полимер на короткие олигосахариды, что приводит к подавлению адгезии и отделению бактерий от биологической поверхности. Диспергирование бактерий из биопленки позволяет микроорганизмам колонизировать новые сайты макроорганизма [9, 26].
Альгинат-лиазы делятся на G-специфические (EC4.2.2.11) и M-специфические (EC4.2.2.3) ферменты. Полисахаридные лиазы на основании гомологии аминокислотных последовательностей делятся на несколько семейств. К настоящему времени идентифицировано более 1774 последовательностей альгинат-лиаз, которые образуют 7 ферментативных семейств
[21, 32, 34]. Действие альгинат-лиазы происходит в три этапа: 1) удаление отрицательного заряда карбоксилат-аниона; 2) отведение протона на С5; 3) ß-элиминация 4-O-гликозидной связи (лиазы) (рис. 4) [28].
Альгинат-лиазы отличаются субстратной специфичностью. Установлено, что альгинат-лиаза бактерий Pseudomonas aeruginosa проявляет активность как к поли-М, так и к поли-G альгинату [13].
Продемонстрировано, что альгинат-лиаза в концентрации 20 ед/мл в комбинации с гентамицином (64 мкг/мл) вызывает деградацию биопленки, сформированной Pseudomonas aeruginosa. Инкубация биопленки с альгинат-лиазой и гентамицином в течение 96 часов приводила к полному исчезновению ее структур [1].
Продемонстрировано, что сайт-специфическое монопегилирование генно-инженерной альгинат-ли-азы А1-Ш усиливает антибиопленочную активность. Генно-инженерная альгинат-лиаза А1-Ш способствует элиминации более чем 90 % адгезивных бактерий Pseudomonas aeruginosa из биопленки [20].
Полагают, что альгинат-лиаза обязательно получит клиническое применение для лечения заболеваний, связанных с развитием бактериальных биопленок слизистых оболочек респираторного тракта.
Выводы
Бактериальные клетки, расположенные в биопленке, защищены от антибактериальных эндо- и экзофак-торов внеклеточным полимерным матриксом, основу которого составляют бактериальные полисахаридные соединения, которые синтезируются самими бактериями. Ферменты, которые расщепляют полиса-харидные полимеры, вызывают разрушение бактериальных биопленок, что сопровождается высвобождением бактерий. Лишение защиты полисахаридов EPS способствует эффективному воздействию антибактериальных агентов на бактерии. Медикаментозные методы диспергирования биопленок при помощи полисахаридразруша-ющих ферментов, без сомнения, расширят арсенал антибиопле-ночной терапии хронических и рецидивирующих бактериальных инфекций, особенно вызванных антибиотикорезистент-ными бактериями.
Рисунок 4. Гидролиз альгината при помощи альгинат-лиазы [28] Примечание: альгинат-лиаза катализирует гидролиз альгината, сополимера L-гулуроната (G) и C5-эпимера-D-маннуроната (M) посредством в-элиминации.
Конфликт интересов. Автор заявляет об отсутствии какого-либо конфликта интересов и собственной финансовой заинтересованности при подготовке данной статьи.
References
1. Alkawash MA, Soothill JS, Schiller NL. Alginate lyase enhances antibiotic killing of mucoid Pseudomonas aeruginosa in biofilms. APMIS. 2006;114(2):131-138. doi:10.1111/j.1600-0463.2006.apm_356.x.
2. Arnal G, Stogios PJ, Asohan J, et al. Substrate specificity, regiospecificity, and processivity in glycoside hydrolase family 74. J Biol Chem. 2019;294(36):13233-13247. doi:10.1074/jbc.RA119.009861.
3. Baroroh U, YusufM, Rachman SD, et al. The Importance of Surface-Binding Site towards Starch-Adsorptivity Level in a-Amylase: A Review on Structural Point of View. Enzyme Res. 2017;2017:4086845. doi:10.1155/2017/4086845.
4. Berlemont R, Martiny AC. Phylogenetic distribution of potential cellulases in bacteria. Appl Environ Microbiol. 2013;79(5):1545-1554. doi:10.1128/AEM.03305-12.
5. Chaignon P, Sadovskaya I, Ragunah Ch, Ramasubbu N, Kaplan JB, Jabbouri S. Susceptibility of staphylococcal biofilms to enzymatic treatments depends on their chemical composition. Appl Microbiol Biotechnol. 2007;75(1):125-132. doi:10.1007/s00253-006-0790-y.
6. Chen KJ, Lee CK. Twofold enhanced dispersin B activity by N-terminal fusion to silver-binding peptide for biofilm eradication. Int J Biol Macromol. 2018;118(Pt A):419-426. doi:10.1016/j.ijbiomac.2018.06.066.
7. Cockburn D, Wilkens C, Ruzanski C, et al. Analysis of surface binding sites (SBSs) in carbohydrate active enzymes with focus on glycoside hydrolase families 13 and 77 — a mini-review. Biologia. 2014;69(6):705-712. doi:10.2478/ s11756-014-0373-9.
8. Craigen B, Dashiff A, Kadouri DE. The Use of Commercially Available Alpha-Amylase Compounds to Inhibit and Remove Staphylococcus aureus Biofilms. Open Microbiol J. 2011;5:21-31. doi:10.2174/1874285801105010021.
9. Ertesvag H. Alginate-modifying enzymes: biological roles and biotechnological uses. Front Microbiol. 2015;6:523. doi:10.3389/fmicb.2015.00523.
10. Fekete A, Borbas A, Gyemant G, et al. Synthesis of fi-(1^6)-linked N-acetyl-D-glucosamine oligosaccharide substrates and their hydrolysis by Dispersin B. CarbohydrRes. 2011;346(12):1445-1453. doi:10.1016/j.carres.2011.03.029.
11. Fleming D, Chahin L, Rumbaugh K. Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds. Antimicrob Agents Chemother. 2017;61 (2) :e01998-16. doi:10.1128/AAC.01998-16.
12. Fleming D, Rumbaugh KP. Approaches to Dispersing Medical Biofilms. Microorganisms. 2017;5(2):15. doi:10.3390/microorganisms5020015.
13. Ghadam P, Akhlaghi F, Ali AA. One-step purification and characterization of alginate lyase from a clinical Pseudomonas aeruginosa with destructive activity on bacterial biofilm. Iran J Basic Med Sci. 2017;20(5):467-473. doi:10.22038/IJBMS.2017.8668.
14. Greene ER, Himmel ME, Beckham GT, Tan Z. Gly-cosylation of Cellulases: Engineering Better Enzymes for Biofuels. Adv Carbohydr Chem Biochem. 2015;72:63-112. doi:10.1016/bs.accb.2015.08.001.
15. Hogan S, Zapotoczna M, Stevens NT, Humphreys H, O'Gara JP, O'Neill E. Potential use of targeted enzymatic agents in the treatment of Staphylococcus aureus biofilm-related infections. J Hosp Infect. 2017;96(2):177-182. doi:10.1016/j.jhin.2017.02.008.
16. Janecek S, Gabrisko M. Remarkable evolutionary relatedness among the enzymes and proteins from the a-amylase family. CellMolLife Sci. 2016;73(14):2707-2725. doi:10.1007/s00018-016-2246-6.
17. Kalpana BJ, Aarthy S, Pandian SK. Antibiofilm activity of a-amylase from Bacillus subtilis S8-18 against biofilm forming human bacterial pathogens. Appl Biochem Biotechnol. 2012;167(6):1778-1794. doi:10.1007/s12010-011-9526-2.
18. Kerrigan JE, Ragunath C, Kandra L, et al. Modeling and biochemical analysis of the activity of antibiofilm agent Dispersin B. Acta Biol Hung. 2008;59(4):439-451. doi:10.1556/ABiol.59.2008.4.5.
19. Kurasin M, Väljamäe P. Processivity of cello-biohydrolases is limited by the substrate. J Biol Chem. 2011;286(1):169-177. doi:10.1074/jbc.M110.161059.
20. Lamppa JW, Ackerman ME, Lai JI, Scanlon TC, Gris-wold KE. Genetically engineered alginate lyase-PEG conjugates exhibit enhanced catalytic function and reduced im-munoreactivity. PLoS One. 2011 ;6(2):e17042. doi:10.1371/ journal.pone.0017042.
21. Lombard V, Bernard T, Rancurel C, Brumer H, Coutinho PM, Henrissat B. A hierarchical classification of polysaccharide lyases for glycogenomics. Biochem J. 2010;432(3):437-444. doi:10.1042/BJ20101185.
22. Ma L, Conover M, Lu H, Parsek MR, Bayles K, Woz-niak DJ. Assembly and development of the Pseudomonas ae-ruginosa biofilm matrix. PLoS Pathog. 2009;5(3):e1000354. doi:10.1371/journal.ppat.1000354.
23. Pozzi C, Waters EM, Rudkin JK, et al. Methicillin resistance alters the biofilm phenotype and attenuates virulence in Staphylococcus aureus device-associated infections. PLoS Pathog. 2012;8(4):e1002626. doi:10.1371/journal. ppat.1002626.
24. Ragunath C, DiFranco K, Shanmugam M, et al. Surface display of Aggregatibacter actinomycetemcomi-tans autotransporter Aae and dispersin B hybrid act as an-tibiofilm agents. Mol Oral Microbiol. 2016;31(4):329-339. doi:10.1111/omi.12126.
25. Ramasubbu N, Thomas LM, Ragunath C, Kaplan JB. Structural analysis of dispersin B, a biofilm-releasing glyco-side hydrolase from the periodontopathogen Actinobacillus actinomycetemcomitans. J Mol Biol. 2005;349(3):475-486. doi:10.1016/j.jmb.2005.03.082.
26. Saxena P, Joshi Y, Rawat K, Bisht R. Biofilms: Architecture, Resistance, Quorum Sensing and Control Mechanisms. Indian J Microbiol. 2019;59(1):3-12. doi:10.1007/ s12088-018-0757-6.
27. Sukharnikov LO, Cantwell BJ, Podar M, Zhulin IB. Cellulases: ambiguous nonhomologous enzymes in a ge-nomic perspective. Trends Biotechnol. 2011;29(10):473-479. doi:10.1016/j.tibtech.2011.04.008.
28. Thallinger B, Prasetyo EN, Nyanhongo GS, Guebitz GM. Antimicrobial enzymes: an emerging strategy to fight microbes and microbial biofilms. Biotechnol J. 2013;8(1):97-109. doi:10.1002/biot.201200313.
29. van Dijl JM, Hecker M. Bacillus subtilis: from soil bacterium to super-secreting cell factory. Microb Cell Fact. 2013;12:3. doi:10.1186/1475-2859-12-3.
30. Waryah CB, Wells K, Ulluwishewa D, et al. In Vitro Antimicrobial Efficacy of Tobramycin Against Staphylococcus aureus Biofilms in Combination With or Without DNase I and/or Dispersin B: A Preliminary Investigation. Microb Drug Resist. 2017;23(3):384-390. doi:10.1089/mdr.2016.0100.
31. Watters CM, Burton T, Kirui DK, Millenbaugh NJ. Enzymatic degradation of in vitro Staphylococcus aureus biofilms supplemented with human plasma. Infect Drug Resist. 2016;9:71-78. doi:10.2147/IDR.S103101.
32. Xu F, Wang P, Zhang YZ, Chen XL. Diversity of Three-Dimensional Structures and Catalytic Mechanisms of Algi-
nate Lyases. Appl Environ Microbiol. 2018;84(3):e02040-17. doi:10.1128/AEM.02040-17.
33. Yan S, Wu G. Bottleneck in secretion of a-amylase in Bacillus subtilis. Microb Cell Fact. 2017;16(1):124. doi:10.1186/s12934-017-0738-1.
34. Zhu B, Yin H. Alginate lyase: Review of major sources and classification, properties, structure-function analysis
and applications. Bioengineered. 2015;6(3):125-131. doi:1 0.1080/21655979.2015.1030543.
Получено/Received 22.01.2020 Рецензировано/Revised 24.02.2020 Принято в печать/Accepted 03.03.2020 ■
Information about author
A.E. Abaturov, MD, PhD, Professor, Head of the Department of pediatrics 1 and medical genetics, State Institution "Dnipropetrovsk Medical Academy of the Ministry of Health of Ukraine'; Dnipro, Ukraine; e-mail: alexabaturov@i.ua; ORCID iD: http://orcid.org/0000-0001-6291-5386
Абатуров O.e.
ДУ «Днпропетровська медична академiя МОЗ Украни», м. ДнПро, Украна
Полiсахаридруйнуючi ферменти як агенти
Резюме. Розвиток бактерiальних бiоплiвок залежить вГд секрецй i збереження позаклГтинних полюахаридГв або екзо-псшсахарцадв, що являють собою основш компоненти поза-клиинно! полюахаридно! речовини бiоплiвок. Екзополюаха-риди позаклпинно! полюахаридно! речовини забезпечують структурну стабiльнiсть бюплшки, адгезiю i агрегацт мшро-органiзмiв, фiзичний та хiмiчний захист бактерш вiд дй проти-мжробних препарат Г ефекторiв шунно! системи макроорга-шзму. БактерГальш клпини, розташоваш в бюплГвщ, захищеш вГд антибактерГальних ендо- та екзофакторГв позаклитинним полГмерним матриксом. Для шщшвання диспергування бю-плГвок мшрооргашзми поряд з шшими ферментами викорис-товують специфГчш глжозидддролази, що руйнують полюа-хариди бактерГальних бюплшок. Шкозидпдролази реалГзують свою дгю через гГдролГз глшозидних зв'язюв: амГлази розще-плюють а-1,4-; целюлази — р-1,4-; в-галактозидази — р-1,3-глгкозидний зв'язок. Основними глшозидддролазами, що чи-
, що диспергують бактерiальнi бiоплiвки
нять антибюплГвкову дш, е: а-лГзоцим, амГлази, дисперсин В, целюлази, палурошдаза, а- Г в-манозГдази, альгшат-лГази. Щ ферменти викликають руйнування полюахаридних полГмерГв, сприяючи вивГльненню бактерш. Бактерй, яю втратили захист полюахаридного каркасу, пГддаються впливу антибактерГаль-них агентГв. З огляду на те, що деградацГя екзополюахаридгв бГоплГвок глшозидддролазами призводить до вираженого диспергування бактерГй, даний антибГоплГвковий метод лъ кування може являти собою ушверсальний пГдхГд до терапй шфекцш, що перебГгають Гз формуванням бюплГвок. Меди-каментознГ методи диспергування бюплшок за допомогою полюахариддеградуючих ферментш, без сумшву, розширять арсенал антибюплГвково! терапй хронГчних та рецидивуючих бактерГальних шфекцш, особливо викликаних антибютико-резистентними бактершми.
Ключовi слова: бактерГальнГ бГоплГвки; диспергування; по-лГсахаридруйнуючГ ферменти
A.E. Abaturov
State Institution "Dnipropetrovsk Medical Academy of the Ministry of Health of Ukraine", Dnipro, Ukraine
Polysaccharide-degrading enzymes
Abstract. The development of bacterial biofilms depends on the secretion and preservation of extracellular polysaccharides, or exopolysaccharides, which are the main components of the extracellular polysaccharide substance of the biofilms. Exopolysac-charides of the extracellular polysaccharide substance provide the structural stability of the biofilm, the adhesion and aggregation of microorganisms, the physical and chemical protection of bacteria from the action of antimicrobials and immune system effectors of the macroorganism. Bacterial cells located in the biofilm are protected from antibacterial endo- and exofactors by an extracellular polymeric matrix. To initiate the dispersion of biofilms, microorganisms, along with other enzymes, use specific glycoside hydrolases, which destroy polysaccharides of bacterial biofilms. Glycoside hydrolases realize their action through the hydrolysis of glycosidic bonds: amylases cleave a-1,4-; cellulases — |-1,4-; |-galactosidases — |-1,3-glycosidic bonds. The main glycoside
as agents dispersing bacterial biofilms
hydrolases that have antibiotic action are: a-lysozyme, amylases, dispersin B, cellulases, hyaluronidase, a- and |-mannosidases, alginate lyases. These enzymes cause the destruction of polysac-charide polymers, contributing to the release of bacteria. Bacteria that have lost the protection of the polysaccharide scaffold are exposed to antibacterial agents. Considering that the degradation of exopolysaccharides of biofilms by glycoside hydrolases leads to pronounced dispersion of bacteria, this antibiofilm treatment method can be a universal approach to the treatment of infections occurring with the formation of biofilms. Drug methods of dispersing biofilms using polysaccharide-degrading enzymes will no doubt expand the arsenal of antibiofilm therapy for chronic and recurrent bacterial infections, especially those caused by antibiotic-resistant bacteria.
Keywords: bacterial biofilms; dispersion; polysaccharide-de-grading enzymes
