23источника этого признака в селекции. Поскольку качество плодов манчжурского персика, его гибридов с крупноплодными сортами персика обыкновенного, гибридов с участием персика Давида низкое и очень низкое, а отдаленные гибриды диплоидных видов сливы с персиком из-за редукции пестика вообще не плодоносят и в селекции пригодны только как отцовские сорта, перспективы их использования в селекции персика на зимостойкость представляются нам весьма незначительными. Выигрыш в зимостойкости, который они могут дать, слишком несущественен в сравнении с неизбежными потерями в качестве плодов.
Литература
1. Агроклиматический справочник по Воронежской области. Л., 1958. 165 с.
2. Адамчик К.А. Опыт выращивания персика в Приморском крае // Садоводство. М., 1978. № 12. С. 22.
3. Мичурин И.В. Принципы и методы работы // Сочинения. М. 1948. Т.1. С. 482-578.
4. Чендлер У. Плодовый сад. М. 1960. 621 с.
5. Шайтан И.М., Чуприна Л.М., Анпилова В.А. Биологические особенности и выращивание персика, абрикоса и алычи. Киев. 1989. 254 с.
6. Gu М. Investigation of the origin and history Huichun peach // Acta Horticulturae Sinica. 1983. № 10. P. 9-12.
УДК 631.52:634
Полиплоидия яблони с использованием биотехнологических методов
Ташматова Л.В., к.с.-х.н Мацнева О.В., н.с Шахов В.В., м.н.с.
ФГБНУ ВНИИ селекции плодовых культур, Орёл, Россия, tashmatova@yniispk.ru Аннотация
В процессе работы проводилось изучение клонального микроразмножения сортов яблони и колхицинированных побегов яблони. Для повышения выхода жизнеспособных эксплантов яблони меристемы лучше вводить в культуру in vitro в период начала роста (конец март -апрель) в силу меньшего окисления питательной среды фенолами и активизации ростовых процессов в почке. В качестве основной питательной среды на этом этапе введения рекомендуется использовать питательную среду QL. Для увеличения степени пролиферации яблони проводили культивирование микропобегов на питательные среды Фардзиновой и QL с добавлением БАП 2,0 мг/л. Изучали процесс колхицинирования меристем яблони в культуре in vitro. Использование среды QL при колхицинировании позволило увеличить время воздействия амитотиком до 12 суток
Ключевые слова: яблоня, триплоиды, полиплоидизация, меристемы, питательная среда
Apple polyploidization with using biotechnological methods
Tashmatova L.V., cand. agr. sci. Matzneva O.V., research worker
Shakhov V.V., junior research worker_
Russian Research Institute of Fruit Crop Breeding (VNIISPK), Orel, Russia, tashmatova@yniispk.ru
Abstract
Clonal micro propagation of apple cultivars and colchicined apple shoots has been studied. To increase the output of viable apple explants it is better to introduce meristems in vitro during the beginning of the growth (late March - April) due to lower oxidation of culture medium with phenols and intensification of growth processes in a bud. At this stage of introduction it is recommended to use QL culture medium as a basic culture medium. To increase the degree of apple proliferation, micro shoots have been cultivated on nutrient media Fardzinova and QL with BAP 2.0 mg/l addition. The process of colchicinebuy of apple meristems in vitro has been studied. The use of QL culture medium at colchicinebuy allowed to increase the time of amitotic exposure up to 12 days. Key words: apple, triploids, polyploidization, meristems, culture medium
Методы культура изолированных тканей и органов оказывает большую помощь селекционерам в создании и размножении новых форм культурных растений. Среди этих методов значительное место можно отвести экспериментальной полиплоидии в условиях in vitro с применением клонального микроразмножения. Этот метод можно считать перспективным, так он успешно используется для получения полиплоидов овощных, косточковых и декоративных культур (Марьяхина, 1986, Мочалова, 2014). В небольшом объеме ведутся и для семечковых культур (Папихин, 2008).
Как было отмечено ранее, важной задачей является получение полиплоидных форм конкретных сортов или форм с уже имеющимися у них полезными качествами, но в естественных условиях это осуществить довольно сложно, так как воздействовать амитотиком на растение нужно в определенную фазу развития. Эту проблему можно решить, применяя биотехнологические методы.
Среди полиплоидов яблони в промышленном отношении наибольшее значение имеют триплоиды, т.к. они отличаются большей самоплодностью, чем диплоиды, менее выраженной периодичностью плодоношения, более крупными плодами, удобной для сбора плодов кроной, более высокой устойчивость к болезням, вредителям и неблагоприятным условиям среды.
Триплоидные формы получают в результате скрещивания 2n х 3n или 2n х 4n (Туз А.С., Лозинский А.Я., 1970). Одним из способов получения тетраплоидов является индуцирование полиплоидов с использованием полиплоидизирующих химических соединений, таких как колхицин или аценафтан. Сами по себе они не представляют особого промышленного значения, хотя и известны тетраплоидные сорта как Мелба, Уэлси, Голден Делишес, Спартан, Делишес, Папировка. Основная ценность тетраплоидов заключается в том, что они являются донорами нередуцированных диплоидных гамет.
Методологическая база перевода сортов яблони на тетраплоидный уровень в условиях in vitro еще до конца не отработана, поэтому целью наших исследований является разработка этой базы и получение гомогенных тетраплоидов сортов яблони.
Материалы и методика
Объектами исследований являются иммунные сорта яблони - Веньяминовское, Кандиль Орловский, Солнышко, Афродита, Орловское полесье, устойчивые к парше - Ветеран, Орлик, Орловское полосатое, Память воину.
I этап - получение растительного материала (почек) для колхицинирования.
Введение в культуру in vitro проводили в три периода - начало роста (март - апрель), активный рост - июнь, затухание роста - конец августа - сентябрь. Пассирование меристем проводили на питательных средах МС и QL с добавлением БАП 0,5мг\л и 10мг/л аскорбиновой кислоты.
II этап - получение тетраплоидных форм яблони.
Колхицинирование меристем проведено в условиях in vitro с учетом ранее накопленного опыта работы (Джафарова, 2007, 2015). В качестве полиплоидизирующего вещества использован колхицин, который вводился в состав питательной среды Кворина-Лепуавра, в концентрации 0,01% и 0,02%. Время обработки 24, 48, 72, 216, 288 часов. Для получения укорененных колхицинированных растений использовали прием микропрививки на семенные подвои с учетом рекомендаций Л.В. Ташматовой, В.А. Высоцкого, В.Е. Джафаровой (2015).
Результаты и их обсуждение
Процесс получения тетраплоидов яблони состоит из трех этапов: 1. Клональное микроразмножение сортов яблони с целью получения апикальных и латеральных меристем из почек и верхушек растущих побегов; 2. Колхицинирование меристем; 3. Клональное микроразмножение побегов, полученных из колхицинированных меристем.
На приживаемость эксплантов в культуре in vitro оказывают большое влияние окисление среды фенольными соединениями и состав питательной среды. Для снижения отрицательного воздействия фенолов мы испытывали три срока введения в культуру. Сто процентное окисление среды наблюдали у эксплантов, введенных в период активного роста у всех сортов. В результате этого снижался уровень приживаемости эксплантов. У эксплантов, введенных в период начала роста, окисление в среднем составило - 73,0%, в период окончания роста - 57,4. 100% окисление было только у Имруса, Кандиля орловского и Памяти воину. При дальнейшем развитии меристем, введенных осенью, наблюдали рост примордиальных листочков, а меристема в рост не трогалась, что вероятно связано с физиологическим состоянием покоя материнского растения. У таких сортов как Кандиль орловский и Имрус очень мелкие почки и их было трудно освободить от кроющих чешуй. В результате этого стерилизующий раствор не проникал в почку, и как следствие этого получили 100% контаминацию эксплантов.
На этапе введения в культуру большое значение имеет состав питательной среды.
На питательной среде QL жизнеспособность эксплантов была выше, чем на среде Мурасиге-Скуга. У сортов Ветеран и Болотовское на последней среде наблюдали 100% некроз тканей. У сорта Орловское полосатое приживаемость эксплантов не отличалась на обеих средах (таблица 1).
Таблица 1 - Влияние состава питательных сред на приживаемость эксплантов на этапе введения.
Питательные среды
Сорта Мурасиге-Скуга, % ОЦ %
Ветеран 0 37,5
Кандиль орловский 42,0 60,0
Болотовское 0 26,3
Орлик 40,0 47,1
Орловское полосатое 44,5 44,8
С целью повышения выхода меристем были испытаны среды Кворина-Лепуавра и Фардзиновой рекомендованной для груши с добавлением БАП 2,0 мг/л. Последняя оказалась наиболее подходящей для получения дополнительных побегов и почек, пригодных для колхицинирования (таблица 2).
Таблица 2 - Коэффициент размножения эксплантов яблони
Сорта Питательная среда
Кворина-Лепуавра Фардзиновой
Имрус 2,0±0,3 2,6±1,0
Болотовское 1,95±0,1 3,05±0,6
Ветеран 1,4±0,1 2,35±0,9
Использование питательной среды ОЬ в качестве основной среды для колхицинирования позволило увеличить время воздействия колхицином до 288 часов, что позволяет повысить эффективность воздействия колхицином.
Полученные данные так же позволяют говорить о возможности дальнейшего увеличения времени воздействии амитотиком на почки. Полученные результаты показали, что у сортов Имрус и Болотовское чем больше концентрация колхицина и время экспозиции, тем меньше процент прижившихся почек. Однако тот факт, что часть меристем все же прижилась, дает основание применять данные варианты колхицинирования. С 2017 года в процесс колхицинирования включен сорт Ветеран. При концентрации амитотика 0,02% и времени его воздействия 120 часов получили достаточно высокий процент жизнеспособных почек - 90% (таблица 3).
Таблица 3 - Колхицинирование меристем яблони на питательной среде О1_
Сорт Концентрация колхицина, % Временная экспозиция, час Число обработанных меристем, шт. Число прижившихся меристем, шт. % прижившихся меристем
Колхицин в среде
Имрус 0,01 120 54 52 96,3
Имрус 0,02 24 22 10 45,4
Имрус 0,02 72 16 11 62,5
Имрус 0,02 120 39 13 33,3
Имрус 0,02 216 (9 суток) 10 4 40
Имрус 0,02 288 (12 суток) 10 2 20
Болотовское 0,01 120 60 55 91,7
Болотовское 0,01 288 29 4 13,8
Болотовское 0,02 24 40 25 62,5
Болотовское 0,02 48 35 12 34,3
Болотовское 0,02 72 100 33 33
Болотовское 0,02 120 39 13 33,3
Ветеран 0,02 120 20 18 90
Всего 474 252 53,4
Согласно ранее отработанной схеме получения тетраплоидов яблони, колхицинированные почки высаживали на новую среду без колхицина, но содержащую БАП в концентрации 0,5 мг/л. Срок пассирования 4 недели. За это время почки увеличиваются в размерах или вырастают в короткие побеги. В дальнейшем эти побеги высаживали на среду ОЬ с добавлением БАП 1,0 мг/л.
Культивирование микропобегов, полученных из колхицинированных почек показало, что колхицин не оказывает существенного влияние на их пролиферацию. Коэффициент размножения увеличивается с каждым последующим пассажем (таблица 4). В конгломератах наряду нормально развитыми побегами встречались фасциированные побеги.
Таблица 4 - Коэффициент размножения колхицинированных побегов яблони на питательной среде QL с добавлением БАП 1,0 мг/л_
Сорт Коэффициент размножения в зависимости от пассажа
1 2 3 4
Колхицин 0,02%, 24 часа
Болотовская 1,5±0,2 3,1 ±0,5 5,3±0,9 5,7±0,7
Имрус 1,4±0,1 3,3±0,1 4,6±0,6 6,5±0,8
Колхицин 0,02%, 48 часа
Болотовская 1,4±0,2 2,7±0,2 5,0±0,3 5,8±0,8
Колхицин 0,02%, 72 часа
Болотовское 1,4±0,1 3,3±0,1 5,0±0,4 9,2±0,9
Имрус 1,0±0,1 1,3±0,1 1,2±0,1 1,2±0,1
Колхицин 0,02%, 120 часов
Болотовское 1,5±0,2 2,7±0,2 - -
Имрус 1,6±0,1 2,3±0,1 4,4±0,3 -
Ветеран 1,2±0,1 1,4±0,1 2,1 ±0,2 -
Колхицин 0,02%, 216 часов (9 суток)
Имрус 1, 1 ±0,1 2,2±0,3 3,1 ±0,2 -
Колхицин 0,02%, 288 часов (12 суток)
Имрус 1,3±0,1 3,4±0,3 5,1 ±0,4 -
Колхицин 0,01%, 120 часов
Болотовское 2,7±0,3 1,8±0,1 2,4±0,2 2,2±0,1
Имрус 2,1 ±0,3 2,25±0,2 1,9±0,2 2,1 ±0,2
К третьему - четвертому пассажу были получены микропобеги пригодные для укоренения.
В процессе клонального микроразмножения колхицинированных побегов яблони была выявлена их низкая укореняемость. Поэтому нами был использован прием микропрививки. В качестве подвоя использовали сеянцы яблони, выращенные в условиях in vitvo. Привоем служили микропобеги из культуры in vitro. Способ прививки - в расщеп.
На семенные подвои было привито колхицинированных микрочеренков сорта Болотовское - 42 шт., прижилось - 38 шт., Имрус - 61 шт., прижилось 53 шт. Для определения плоидности полученные растения будут переданы на цитологический анализ в лабораторию цитоэмбриологии.
Выводы
Индуцирование тетраплоидов сортов яблони как доноров диплоидных нередуцированных гамет с применением биотехнологических методов является весьма перспективным в плане ускорения селекционного процесса создания триплоидных сортов яблони.
Литература
1. Марьяхина И.Я., Полумордвинова И.В., Кокорева В.А., Луконина Е.И. Биотехнология получения фертильных форм межвидовых гибридов лука на основе полиплоидизации in vitro. Состояние и перспективы развития с.-х. биотехнологии. Москва,1986. С. 86-91.
2. Мочалова О.В. , Плаксина Т.В., Гусев Д.А., Бояндина Т.Е. Методические подходы к реконструкции генома вишни степной на гексаплоидном уровне // Вестник алтайской науки, 2014. №1 (19). С. 192-197.
3. Папихин Р.В., Муратова С.А., Лучникова С.В. Влияние колхицина и аценафтена на меристематические ткани плодовых и ягодных культур в условиях in vitro // Проблемы агроэкологии и адаптивность сортов в современном садоводстве России: материалы Всеросс. науч-метод. конф. (1-4 июля 2008г., Орел). Орел: ВНИИСПК, 2008. С213-217 .
4.Туз А.С., Лозинский А.Я. Полиплоидные яблони и груши. Генетика, 1970. Т.6. №9. С. 41-50.
5. Джафарова, В.Е. Особенности микроклонального развития сортов яблони с геном Vf в связи с вопросами полиплоидии. Селекция и сортоизучение садовых культур. Орел, ВНИИСПК, 2007. С. 80-85.
6. Джафарова В.Е. Оценка микроразмножения и индуцирования полиплоидных меристем и форм яблони (Malus domestica Borkh) / Современное садоводство [Электронный ресурс], 2015, № 1. Режим доступа: http: // journal. vniispk.ru/pdf / 2015/1/13.pdf.
7. Ташматова, Л.В., Высоцкий В.А., Джафарова В.Е. Клональное микроразмножение и депонирование груши in vitro. Методические рекомендации. Орел: ВНИИСПК, 2015. 18 с.
