CC BY
8УДК 575.174.015.3:616.72-002-053.2
Н.В. Савина1, А.А. Яцкив1, Н.В. Никитченко1, Т.Д. Кужир1, Е.В. Сечко2, А.В. Чичко2, А.В. Сукало2, Р.И. Гончарова1
ПОЛИМОРФИЗМ РЯДА ГЕНОВ ИММУННОГО И ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА КАК ФАКТОР ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ЮВЕНИЛЬНОМУ ИДИОПАТИЧЕСКОМУ АРТРИТУ
1Институт генетики и цитологии НАН Беларуси Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 2УО «Белорусский государственный медицинский университет» Республика Беларусь, 220116, г. Минск, пр-т Дзержинского, 83
В статье представлены результаты сравнения группы пациентов с установленным диагнозом ювенильного идиопатического артрита (ЮИА) и детей без патологии суставов по клиническим и демографическим признакам, а также по распределению частот генотипов/аллелей пяти полиморфных локусов, контролирующих иммунный и воспалительный ответ. Установлено, что среди пациентов с ЮИА превалируют девочки (70%), а среди подтипов заболевания — олигоартрит (66%). Показано, что полиморфизм генов TRAF1/C5 и STAT4 вносит определенный вклад в предрасположенность к заболеванию в белорусской популяции. Частота генотипа GG локуса rs3761847 (TRAF1/C5) существенно повышена в общей выборке пациентов с ЮИА по сравнению с контролем. Кроме того, минорный аллель G увеличивает вероятность развития тяжелого подтипа заболевания — системного артрита. Полиморфизм гена STAT4 (rs7574865) оказывает противоположные эффекты на развитие различных подтипов заболевания, при этом минорный аллель Т защищает от олигоартрита, но повышает риск развития серонегативного полиартрита. Данные указывают на специфические молекулярные механизмы патогенеза различных подтипов заболевания.
Ключевые слова: ювенильный идиопатический артрит, иммунный и воспалительный ответы, генетический полиморфизм.
Введение
Ювенильный идиопатический артрит (ЮИА) наиболее распространен среди детских ревматических болезней, возникает в возрасте до 16 лет с частотой 16-113 случаев на 100 тыс. детского населения в разных странах [1]. В нашей республике заболеваемость ЮИА составляет около 30 случаев на 100 тыс. детей. Тяжелое течение, ранняя инвалидизация пациентов, вызванная быстро развивающейся деформацией суставов и ограничением двигательных функций, необходимость длительного экономически затратного лечения и реабилитации усиливают социальную значимость болезни и повышают актуальность исследований, способствующих профилактике и эффективному лечению ЮИА.
Этиология ЮИА до сих пор не ясна [2, 3], хотя очевидно, что болезнь связана с нару-
шением иммунного ответа на внешние воздействия, при котором системы врожденного и приобретенного иммунитета начинают работать против собственного организма. Эффективность лечения зависит от того, насколько своевременно и правильно поставлен диагноз. В то же время имеющиеся клинико-лабора-торные методы диагностики недостаточно специфичны и информативны для раннего выявления этой патологии; они не позволяют зарегистрировать изменения, происходящие на досимптоматических стадиях болезни.
В последнее время доказана превалирующая роль генетических факторов в этиологии и патогенезе ЮИА [3-5]. Однако у пациентов с ЮИА отсутствуют мажорные мутации, всецело определяющие риск возникновения и течение болезни, поэтому ведется поиск ассоциаций патологического процесса с по-
лиморфными вариантами генов, контролирующих воспалительный и иммунный ответы. Доказательство диагностической либо клинической значимости таких ассоциаций в случае ЮИА сталкивается с большими трудностями из-за ограниченных выборок пациентов. Только благодаря использованию объединенной европейской когорты, включающей более 2800 человек, стало возможным уточнение генетической природы ЮИА в полногеномных исследованиях [3]. На современном этапе выявление приоритетных генетических вариантов риска возникновения и развития ЮИА является главной задачей молекулярной генетики в детской ревматологии, в том числе и в Республике Беларусь, для чего требуется расширение исследуемых когорт пациентов и накопление биологического материала.
Нами начато изучение генетических основ ЮИА в белорусской популяции. Проанализированы образцы ДНК от пациентов с ЮИА, воспалительными поражениями суставов другой этиологии и контрольной группы по полиморфизму ряда генов: Т^а, РТРШ2, МШ, СТ1А4, STAT4, TRAF1/C5, входящих в известный перечень генов-кандидатов, повышающих риск развития ЮИА в европейских популяциях [2, 3]. Несмотря на ограниченность выборки, выявлены некоторые ассоциации и закономерности влияния полиморфизма ряда проанализированных локусов на развитие ЮИА и другой суставной патологии [6]. В данной статье представлены результаты генотипирования расширенной выборки пациентов с ЮИА в сравнении с контрольной группой детей и подростков, не имеющих патологии суставов, по локусам Ы№ (ге755622 и ^5844572), С^А4 (^5742909), STAT4 (ге7574865), TRAF1/C5 (ге3761847).
Материалы и методы
Группы обследования включали пациентов 2-й городской детской клинической больницы г. Минска с клинически установленным диагнозом «ювенильный идиопатический артрит» (ЮИА — 118) и детей без острых воспалительных заболеваний и суставной патологии (контроль — 167).
Объект исследования — геномная ДНК, выделенная из образцов периферической цельной крови стандартным фенол-хлороформным методом [7].
Выбор генов для анализа обусловлен функциями их продуктов (табл. 1); среди них ци-токины и сигнальные трансдукторы. Функции выбранных полиморфных вариантов в основном связаны с изменением экспрессии соответствующих белков.
Полиморфные варианты MIF (rs755622), CTLA4 (rs5742909), STAT4 (rs7574865) и TRAF1/ C5 (rs3761847) определялись с помощью ПЦР-ПДРФ метода согласно протоколам, разработанным в лаборатории на основе опубликованных рекомендаций [8-11]. Условия амплификации, использованные праймеры и рестрицирующие эндонуклеазы указаны в табл. 2.
Изменчивость микросателлитного локуса MIF -794 (rs5844572), содержащего тетрапов-торы САТТ5 изучена методом фрагментно-го анализа на генетическом анализаторе ABI Prism 3500 (AppliedBiosystems, США). Определение размеров выявленных аллелей по локусу MIF -794 проводили с помощью программы GeneMapper 4.1 (Applied Biosystems, США), результаты фрагментного анализа верифицировались секвенированием гомозигот для подтверждения соответствия между наблюдаемыми размерами меченых фрагментов и количеством составляющих их повторов. Полученная в результате секвенирования нуклеотидная последовательность анализировалась с использованием общедоступного пакета программ BLAST [13].
Статистический анализ данных проводился с использованием пакета стандартных программ Excel 2000 и Statistica 7. Различия в частотах генотипов (аллелей) и других альтернативных показателей в группе пациентов по сравнению с контролем, а также между различными категориями пациентов определяли по критерию х2 или с помощью точного теста Фишера, различия по количественным признакам при нормальном распределении определяли по критерию t-Стьюдента. Отклонение от равновесия Харди-Вайнберга анализировали с помощью критерия согласия Пирсона (х2). Различия считались статистически значимыми при p < 0,05. Вычисляли показатель отношения шансов OR (odds ratio) с 95% доверительным интервалом CI (confidence intervals) [24], свидетельствующий о вероятности развития заболевания при наличии тех или иных генетических вариантов, контролирующих воспалительный и иммунный ответы.
Таблица 1
Характеристика изучаемых полиморфных вариантов генов иммунного ответа
Ген Локализация Продукт Функция Полиморфизм, идентификационный номер SNP в базе данных NCBI (rs)
Провоспалительный цитокин и конститутивный SNP -173*G/C rs755622 в промоторной области гена; повышает экспрессию белка, однако это может иметь локальный характер и зависеть от типа клеток (Alourfi et al., 2005) [15]
MIF 22q11.2 Фактор подавления миграции макрофагов элемент иммунитета хозяина; участвует в регуляции иммунной и воспалительной реакций организма (Renner, 2005) [14] Тетраповторы -794 CATT5-8 rs5844572 в промоторной области гена; модулируют активность MIF (Baugh et al., 2002) [16], увеличивая количество циркулирующего белка и усиливая воспалительный ответ (Adamali et al., 2012) [17]
CTLA4 2q33.2 Протеин 4, ассоциированный с ци-тотоксическими Т-лимфоцитами Относится к суперсемейству иммуноглобулинов, участвует в нисходящей регуляции иммунного ответа, передает подавляющий сигнал Т-лимфоцитам SNP -318C/T (rs5742909) в промоторной области гена; повышает экспрессию CTLA4 мРНК и белка на поверхности Т-лимфоцитов (Wang et al., 2002) [18]
STAT4 2q32.2-2q32.3 ДНК-связываю-щий белок — сигнальный транс-дуктор и активатор транскрипции 4 Является посредником в реакции лимфоцитов на интерлейки-ны и экспрессируется в активированных моноцитах, макрофагах и дендритных клетках при воспалении (Watford et al, 2004; Kaplan, 2005) [19, 20] SNP STAT4 rs7574865 (G/T). Функция неизвестна; по-видимому, может влиять на экспрессию и фосфорилирование STAT4 (D^browska-Zamojcin et al., 2016) [21]
TRAF1/ C5 9q33-34 TRAF1 — фактор 1, ассоциированный с рецептором фактора некроза опухоли С5 — компонент комплемента Передает сигнал от рецепторов TNFR к компонентам различных сигнальных путей, в т. ч. MAPK8/ JNK и NF-kB; Отвечает за уничтожение чужеродных клеток (Gasque, 2004) [22] SNP TRAF1/C5 rs3761847 (A/G) локализован между генами, ассоциирован с измененным уровнем мРНК (Bek et al., 2017) [23]
Таблица 2
Условия генотипирования изученных SNPs
Ген Праймеры Условия ПЦР Рестриктаза Продукты рестрикции (п. о.)
Ы№ -173*О/С ГБ755622 (Р) 5'- ЛСТ-ЛЛО-ЛЛЛ-ОЛС-ССО-ЛОО-С -3' 40 циклов: 94° С — 30 с 58° С — 30 с 71° С — 60 с Л1и I ОО (дикий тип): 268 ОС (гетерозигота): 268+205+98+63 СС: 205+98+63
(Я) 5'- ООО-ОСЛ-СОТ-ТОО-ТОТ-ТТЛ-С -3'
СТ1Л4 -318С/Т ГБ5742909 (Р) 5'- ЛОТСТССЛСТТЛОТТ ЛТССЛОЛТССТ -3' 35 циклов: 94° С — 30 с 63° С — 40 с 72° С — 60 с Тги1 I СС (дикий тип): 120 СТ (гетерозигота): 120+94 ТТ: 94
(Я) 5'- ЛЛЛЛОЛСЛЛССТ СЛЛОСЛСТСЛ -3'
БТЛТ4 ГБ7574865 (в/Т) (Р) 5'- ОСЛЛЛТСТТТОТ ЛЛЛЛЛОТСЛЛ -3' 35 циклов: 94° С — 30 с 56° С — 40 с 72° С — 60 с Тги1 I ОО (дикий тип): 156 ОТ (гетерозигота): 93+63+156 ТТ: 63+93
(Я) 5' - ТТЛТООЛЛЛЛТТ ЛСЛТОЛОТОТО -3'
ТЯЛЕ1/С5 гб3761847 (Л/О) (Р) 5'- ССТЛССТОТТСССТС СТТСС -3' 35 циклов: 94° С — 30 с 60° С — 30 с 72° С — 60 с МБР I ЛЛ (дикий тип): 262 ЛО (гетерозигота): 262+175+87 ОО: 175+87
(Я) 5'- ОООЛТОЛТОЛТО ОСЛЛТЛСС -3'
Таблица 3
Демографическая характеристика групп обследования
Исследуемые параметры Группа ЮИА (118) Контроль(167)
Соотношение по полу (девочки/мальчики), % 69,5/30,5 41,9/58,1
Средний возраст, лет (т ± SD)* Вся выборка 8,36 ± 4,99 14,02 ± 2,63
Девочки 7,56 ± 4,49 13,84 ± 2,9
Мальчики 10,16 ± 5,64 14,15 ± 2,42
Максимальный/минимальный возраст (лет) 17/1 17/6
Примечание. * — т ± SD (среднее значение плюс стандартное отклонение)
Результаты и обсуждение
Демографическая и клиническая характеристика групп обследования
На выборке из 285 пациентов проанализированы демографические и клинические признаки, а также распределение частот генотипов/ аллелей по выбранным полиморфным локусам. Демографическая характеристика групп обследования, а именно пациентов с клинически установленным диагнозом ЮИА и пациентов без воспалительных заболеваний и патологии суставов (контроль), представлена в табл. 3.
Из таблицы видно, что группы обследования различаются между собой по полу и среднему возрасту. В контрольной группе незначительно преобладают мальчики (41,9%/58,1%), тогда как в группе ЮИА доминируют девочки (69,5%/30,5%); последнее согласуется с общеизвестной статистикой [25]. Средний возраст пациентов с ЮИА ниже, чем у детей без суставной патологии (р < 0,001). То же касается и медианы возраста, которая вдвое выше в контрольной группе по сравнению с группой ЮИА (15 и 7 лет соответственно).
Клиническая характеристика контрольной группы в соответствии с причиной обращения в клинику представлена в табл. 4.
Основную часть контрольной группы составляют пациенты с вегетативными дисфункциями (почти 81%). У мальчиков, кроме этого диагноза, наиболее распространенная причина обращения — варикоцеле (7,8%).
Вегетативная дисфункция — довольно распространенное патологическое состояние, характерное для любого возраста; наиболее часто диагностируется у школьников [26]; в нашем исследовании в равной степени встречалась у девочек (48,4%) и мальчиков (51,2%). Частота распространения варикоцеле у подростков достигает 16%; выявление этой пато-
логии, как правило, приурочено к пубертатному периоду [27]. Дети с патологией сердца (врожденными и приобретенными пороками и другой симптоматикой) составили 6,0%. Среди всех указанных причин обращения в клинику отсутствовали заболевания с аутоиммунным компонентом и острые либо хронические воспаления.
Пациенты с ЮИА классифицированы по подтипам заболевания в соответствии с критериями ГЬАВ. [28]. В табл. 5 дана количественная характеристика этой группы обследования, а в табл. 6 приведены результаты анализа наиболее часто встречающихся подтипов ЮИА по демографическим признакам и дебюту заболевания.
Причина обращения в клинику Мальчики Девочки Всего %
Артериальная гипертензия 1 0 1 0,6
Нарушение ритма сердца 0 1 1 0,6
Киста правого/левого яичка 1 0 1 0,6
Лабильная АГ 0 1 1 0,6
Варикоцеле 13 0 13 7,8
Брадикардия 1 0 1 0,6
Врожденный порок сердца, дефект межпредсердной перегородки 1 1 2 1,2
Коронарно-легочная фистула 1 0 1 0,6
Врожденный кардит 1 0 1 0,6
Пролапс митрального клапана 1 ст. 2 2 4 2,4
Недостаточность трикуспидального клапана 1 0 1 0,6
МАРС: ДХЛЖ (дополнительная хорда левого желудочка) 3 0 3 1,8
ВД, субклинический гипотиреоз 0 1 1 0,6
ВД (вегетативная дисфункция) 62 59 121 72,4
Нейроциркуляторная дистония 6 0 6 3,6
Вегетососудистая дистония 3 5 8 4,8
Субфебрилитет неуточненный 1 0 1 0,6
Включено в группу 97 70 167 100
Примечание. МАРС — малые аномалии развития сердца
Таблица 4
Клиническая характеристика группы госпитального контроля
Таблица 5
Характеристика пациентов группы ЮИА в соответствии с классификацией ILAR
Подтипы ЮИА Количество человек (%)
Суставная форма, из них: 105 (89)
полиартрит серопозитивный (РФ+) 2 (2)
полиартрит серонегативный (РФ-) 19 (16)
олигоартрит 78 (66)
псориатический артрит 1 (1)
артрит, связанный с энтезитом 5 (4)
недифференцированный артрит 0 (0)
Системное заболевание 13 (11)
В табл. 6 охарактеризованы наиболее часто встречающиеся подтипы ЮИА по демографическим признакам и дебюту заболевания.
Олигоартикулярный (Oligoarthritis) вариант ювенильного артрита составляет до 60% всех случаев заболевания (в нашем исследовании — 66,1%). В зависимости от клинических проявлений он делится на: постоянный, или персистирующий (а) и распространенный, или прогрессирующий (б) [25, 28, 29]. Согласно критериям Американской коллегии ревматологов, олигоартрит подразделяется на три группы в зависимости от дебюта заболевания. Подтип с ранним началом составляет примерно 50% случаев; встречается преимущественно у девочек (до 85%), развивается в возрасте от 1 года до 5 лет. В нашем исследовании доля этого подтипа составила 65%; в 84% соответствующий диагноз установлен у девочек, дебют заболевания — около 3-х лет. Подтип с поздним началом заболевания наблюдается с частотой 10-15%, развивается в возрасте 8-15 лет. Болеют преимущественно мальчики (до 90% случаев), начало заболевания чаще всего совпадает с дебютом юношеского анкилози-рующего спондилита. В нашем исследовании этот подтип составил 23%, диагноз установлен у 9-ти девочек и 9-ти мальчиков среднего возраста около 12 лет. Выделен подтип олигоар-трита с дебютом в возрасте 6-ти лет, который встречается среди всех возрастных групп, но преимущественно у девочек. В нашем исследовании эти случаи составили 5% и наблюдались у 3-х девочек и одного мальчика.
Во всех классификациях, в том числе ILAR, полиартикулярный вариант ювенильного артрита разделяют на два подтипа: серопози-тивный (РФ+, Polyarthritis RF positive) и се-ронегативный (РФ-, Polyarthritis RF negative) в зависимости от наличия или отсутствия ревматоидного фактора [28, 29]. РФ+ артрит очень редко наблюдается у детей (менее 5% от всех случаев ЮИА), при этом намного чаще встречается у лиц женского пола (до 80%); начинается обычно после достижения ребенком десятилетнего возраста и часто протекает в тяжелой форме. В нашем исследовании РФ+ полиартрит диагностирован только у двух пациентов, т. е. в 2% случаев.
На долю РФ-негативного полиартрита приходится от 10 до 30% всех случаев ЮИА; болезнь может развиться у детей любого возраста. В нашем исследовании этот подтип установлен у 16% пациентов с ЮИА, из них 68% девочек и 32% мальчиков с дебютом заболевания около 5-ти и 8-ми лет, соответственно. Согласно статистике, до 10% ЮИА составляет суставно-висцеральный артрит с системным началом (Systemic arthritis), которому могут быть подвержены мальчики и девочки разного возраста, но особенно часто он выявляется у детей раннего возраста и дошкольников. В нашем исследовании такие случаи составили 11%; соотношение полов примерно равное, дебют заболевания — 3-4 года; средний возраст пациентов 6,6 ± 4,0 лет. Из менее частых форм — артрит, связанный с энтезитом, на его долю обычно приходится до 20% всех
Таблица 6
Характеристика наиболее часто встречающихся подтипов ЮИА по полу, возрасту
и дебюту заболевания
Соотношение по полу (жен/муж), % Дебют болезни, лет Возраст, лет
Олигоартрит
74/26 4,88 ± 4,14 7,68 ± 4,78
Девочки 4,1 ± 3,40 7,25 ± 4,37
Мальчики 6,77 ± 5,29 8,50 ± 5,74
Олигоартрит с ранним началом
84/16 2,46 ± 0,99 5,44 ± 3,52
Девочки 2,54 ± 0,91 2,79 ± 3,64
Мальчики 2,15 ± 1,31 4,0 ± 2,66
Олигоартрит с началом в 6 лет
75/25 6,17 ± 0,35 11,5 ± 4,65
Олигоартрит с поздним началом
50/50 11,44 ± 2,43 12 ± 3,87
Девочки 10,89 ± 2,2 10,92 ± 4,12
Мальчики 12 ± 2,64 13,66 ± 2,91
Серонегативный (РФ-) полиартрит
68/32 5,81 ± 3,58 9,63 ± 5,34
Девочки 4,81 ± 2,36 7,92 ± 4,33
Мальчики 8 ± 4,94 13,33 ± 5,82
Системный артрит
54/46 3,62 ± 2,93 6,62 ± 4,03
Девочки 3,14 ± 1,59 5,43 ± 3,31
Мальчики 4,16 ± 4,11 8 ± 4,64
Артрит, связанный с энтезитом
40/60 13,7 ± 2,19 14,6 ± 2,41
случаев ЮИА, чаще болеют мальчики в возрасте старше 6-ти лет. В нашем исследовании установлен у 5 человек (4,25% случаев), преимущественно у мальчиков (60%), с дебютом заболевания около 14-ти лет. Следует отметить, что поражение глаз наблюдалось у 7 человек, то есть в 5,93% случаев ЮИА. Выполненный нами анализ выборки пациентов с установленным диагнозом ЮИА свидетельствует, что в ней присутствуют все подтипы заболевания
за исключением недифференцированного артрита. Распределение подтипов ЮИА по полу, возрасту и дебюту в общих чертах соответствует известным критериям и частотам.
Характеристика обеих групп обследования по ряду фенотипических признаков выявила некоторые различия, которые обусловлены гендерными особенностями включенных в исследование патологических состояний и их манифестацией в разном возрасте. В отличие
от наиболее частых дисфункций, представленных в контрольной группе, ЮИА может проявляться очень рано, при этом особенно распространенные подтипы имеют пики дебюта между 1-3 годами и в 9-14 лет [30]. В пре-пубертатном периоде и старше развиваются редкие подтипы ЮИА: серопозитивный полиартрит, псориатический либо энтезит-ассо-циированный артрит [31-33]. Высокая частота встречаемости вегетативной дисфункции и ва-рикоцеле в группе госпитального контроля, которые преимущественно диагностируются в среднем и старшем школьном возрасте, и низкая частота РФ+ артрита и других редких форм ЮИА с более поздним дебютом, обуславливают возрастные различия между группами обследования. Особенности в соотношении полов (в пользу мальчиков в группе госпитального контроля и в пользу девочек в группе ЮИА) также вполне объяснимы. Контрольная группа представлена в основном детьми с вегетативной дисфункций, которая, как известно, не имеет гендерного предпочтения. Варикоцеле — патология мальчиков, тогда как ЮИА — преимущественно развивается у девочек за исключением некоторых редких форм. Главный критерий исключения из контрольной группы соблюден, так как в ней
отсутствуют дети с патологией иммунитета и воспалительными заболеваниями.
Результаты генотипирования ДНК пациентов по полиморфным локусам STAT4, CTLA4, TRAF1/C5 и
В группе пациентов с ЮИА изучено распределение частот генотипов/аллелей по ряду полиморфных локусов в сравнении с контролем; в табл. 7 представлены данные, касающиеся генов STAT4 и CTLA4.
Представленные результаты показывают, что частота минорного аллеля ге7574865 гена STAT4 в контрольной выборке укладывается в диапазон частот, характерных для европейских стран (20-23%) [34-36] и отличается от этих показателей у азиатов (31-33%) [3739]. Наблюдаемая частота минорного аллеля ге574290 гена CTLA4 также близка его частотам в странах Западной Европы (от 8% в Великобритании до 13,5% в Италии) и мало отличается от этого показателя в Польше (8,6%) [40-42].
Что касается влияния полиморфизма этих генов на предрасположенность к ЮИА, то статистически значимые различия найдены только для минорного аллеля (Т) гена STAT4, частота которого понижена при олигоартрите
Таблица 7
Распределение частот генотипов/аллелей полиморфных локусов ге7574865 и ге5742909 в группах пациентов с ЮИА по сравнению с контролем
Группа пациентов п STAT4 ге7574865; частоты, % СТ.'1Л4 ге5742909; частоты, %
ОО GT ТТ Т аллель СС СТ ТТ Т аллель
Контроль (выборка) 167 56,9 37,1 6 24,6 80,2 19,2 0,6 10,2
ЮИА (выборка) 118 64,4 30,5 5,1 20,3 82,2 17,8 0,0 8,9
Олигоартрит 78 69,2 28,2 2,6 16,7 83,3 16,7 0,0 8,3
РФ- полиартрит 19 36,8 47,4 15,8 39,5 84,2 15,8 0,0 7,9
Системный артрит 13 76,9 23,1 0,0 11,5 76,9 23,1 0,0 11,5
Контроль (мальчики) 97 54,6 40,2 5,2 25,3 82,5 16,5 1,0 9,3
ЮИА (мальчики) 36 72,2 25,0 2,8 15,3 88,9 11,1 0,0 5,6
Контроль (девочки) 70 60,0 32,9 7,1 23,6 77,1 22,9 0,0 11,4
ЮИА (девочки) 82 61 32,9 6,1 22,6 79,3 20,7 0,0 10,4
Примечание. Жирным шрифтом отмечены статистически значимые различия (р < 0,05) с контролем
и повышена при РФ-негативном полиартрите. Показатели отношения шансов — OR = 0,61; 95% С1 [ 0,38-1,00] (р = 0,05) и OR = 2,00; 95% С1 [1,00-4,02] (р = 0,047) — свидетельствуют о протекторном эффекте аллеля Т против развития олигоартрита и его ассоциации с риском появления РФ-негативного полиартрита. Такие разнонаправленные эффекты могут указывать на различные молекулярно-гене-тические пути патогенеза этих двух наиболее распространенных подтипов заболевания.
Следует отметить, что масштабными исследованиями на популяциях разного этнического происхождения установлено, что STAT4 относится к числу генов, полиморфизм которых модифицирует предрасположенность к ревматоидному артриту взрослых и ЮИА [34, 37, 43], при этом есть сведения как об отсутствии какого-либо эффекта [44], так и диаметрально противоположные данные о снижении риска развития ревматоидного артрита под влиянием мутантного аллеля Т (для азиатских популяций) [45]. Установленные нами на сравнительно небольших выборках ассоциации нуждаются в дальнейшем изучении, тем более что межгрупповые различия доказаны на границе статистической значимости (р = 0,047-0,05). Нам не удалось выявить какое-либо влияние полиморфизма в локусе ге5742909 гена СТЬА4 на развитие ЮИА, что также требует подтверждения, так как известные из литературы данные противоречивы [46-48].
Результаты генотипирования по полиморфным локусах MIF -173 G/C (rs755622) и TRAF1/C5 A/G (rs3761847), представленные в табл. 8, показали, что частоты минорных аллелей обоих генов находятся в пределах значений, характерных для европейских популяций [34, 49, 50].
Обнаружены статистически значимые различия в частотах гомозиготного по минорному аллелю генотипа TRAF1/C5 между группой контроля и выборкой пациентов с ЮИА. Эти различия касались, прежде всего, девочек (p = 0,000096). Полиморфизм гена MIF rs755622 не изменял чувствительность популяции к ЮИА. Так, частоты минорного аллеля (С) этого гена практически одинаковы во всех исследованных группах.
Изучение распределения частот генотипов/ аллелей по данным локусам в зависимости от подтипа заболевания (рис.) выявило ряд тенденций и закономерностей.
Несмотря на визуально определяемые различия между частотами некоторых генотипов и минорного аллеля MIF -173* C в группах олигоартрита и системного артрита, а также в группах серонегативного полиартрита и системного заболевания, все они не достигли статистической значимости.
В отличие от этих данных генотипирование по локусу rs3761847 гена TRAF1/C5 оказалось более результативным, так как сравнение оли-го- и системного артрита продемонстрировало существенное снижение частоты аллеля дикого
Таблица 8
Распределение частот генотипов/аллелей полиморфных локусов МШ и TRAF1/C5 в группах
пациентов с ЮИА по сравнению с контролем
Группа пациентов MIFrs755622; частоты, % TRAF1/C5 rs3761847; частота, %
n GG GC CC C аллель n AA AG GG G аллель
Контроль/в 167 69 27 5 17,66 163 39 48 13 36,81
ЮИА/в 117 64 35 1 18,38 120 39 38 231 42,081
Контроль/м 97 71 26 3 15,98 94 39 46 15 37,72
ЮИА/м 37 73 24 3 14,86 38 34 37 292 47,37
Контроль/д 70 66 28 6 20,00 69 39 51 10 35,51
ЮИА/ д 80 60 40 0 20,00 82 41 38 213 39,63
Примечание. в — вся выборка; м — мальчики; д — девочки. Жирным шрифтом отмечены статистически значимые различия с контролем: 1,2 — р < 0.05; 3 — р < 0,0001 согласно критерию х2
типа А при системном заболевании (42% по сравнению с 64%, р = 0,034). И наоборот, минорный аллель О представлен с высокой частотой у пациентов с системным заболеванием (58% против 36%), а показатель отношения шансов OR = 2,43; 95% С1 [1,05-5,6] р = 0,037 указывает на более чем двукратное увеличение вероятности развития этого подтипа заболевания по сравнению с олигоартику-лярной формой ЮИА. По-видимому, полученные данные отражают особенности влияния полиморфизма в локусе ^3761847 гена TRAF/C5 на чувствительность белорусской популяции к ЮИА. Результаты позволяют также предположить, что минорный аллель затрагивает функционирование гена (экспрессию
или активность его продукта), что в свою очередь направляет патогенез заболевания по пути развития наиболее тяжелой формы заболевания.
Результаты генотипирования по локусу -794 САТТ5-8 гена МШ (^755622) после их верификации, как указано выше (см. материалы и методы), представлены в табл. 9. Из литературы известно, что аллель -794 САТТ5 связан с наименьшей степенью экспрессии гена МШ [51]. С увеличением числа повторов функциональная активность гена повышается, что зачастую ассоциировано с ухудшением прогнозных показателей и хронизацией патологического процесса при разных аутоиммунных заболеваниях [52-54].
сс
00
ее
ггг
118,4
ГТ8Т"
ТШГ
3 15,4
ГТ5Х
I 36,8
I 36,8
137,7
Пзе
Л7/Р
84,6
0 20 40 60 80 100
Е ЮИА-выборка □ ЮИА-олигоартрит
щ ЮИА-системный □ ЮИА-полиартрит РФотр.
58 77?АР7/С5
0 20 0 ЮИА-выборка 0 ЮИА-системный
40 60
□ ЮИА-олигоартрит
□ ЮИА-полиартрит РФотр
80
Группа, человек Частота генотипов -794 САТТ58 М!¥, % Частота аллелей, %
5,5 5,6 5,7 6,6 6,7 7,7 5 6 7
Контроль-выборка, 99 10 31 8 33 14 3 30 56 14
ЮИА-выборка, 94 10 41 5 24 19 0 33 55 12
Контроль-девочки, 65 9 29 8 35 14 5 28 57 15
ЮИА-девочки, 62 10 42 6 23 19 0 34 53 13
Контроль-мальчики, 34 12 35 9 29 15 0 34 54 12
ЮИА-мальчики, 32 9 41 3 28 19 0 31 58 11
б
а
Рис. Распределение частот генотипов/аллелей по локусам ге755622 (а) и ге3761847 (б) в зависимости
от подтипов ЮИА
Таблица 9
Частоты генотипов/аллелей по полиморфному локусу -794 САТТ5 8 гена МШ в разных
группах обследования
Судя по данным табл. 9, аллели -794 САТТ5 САТТ6 и САТТ7 встречаются во всех обследованных группах с одинаковой частотой, а наиболее распространенным аллелем является -794 САТТ6, частота которого достигает 53-58%. В обеих выборках чаще выявляются гетерозиготные генотипы -794 САТТ5 6 и гомозиготы САТТ6 6 Наблюдается тенденция к разнонаправленному изменению частоты встречаемости генотипов -794 САТТ5 6 (к повышению) и САТТ6 6 (к снижению) в группе ЮИА относительно контрольного уровня (41% против 31%, р = 0,157; 24% против 33%, р = 0,174), а также преобладание гетерозиготного генотипа -794 САТТ5 6 среди девочек с ЮИА по сравнению с соответствующим контролем (42% против 29%, р = 0,134). Однако статистически значимых отклонений от контрольных показателей в группе ЮИА либо каких-либо гендер-специфических особенностей установить не удалось. Отметим, что аллель -794 САТТ8 в нашем исследовании не обнаружен ни в группе ЮИА, ни в контрольной группе.
Следовательно, результаты генотипиро-вания по полиморфным локусам ^755622 и ге5844572 на имеющейся выборке пока не позволяют делать какие-либо однозначные выводы о влиянии однонуклеотидного полиморфизма и/или микросателлитной изменчивости гена МШ на риск развития ЮИА и отдельных его подтипов в белорусской популяции.
Заключение
В работе дана клинико-демографическая характеристика исследованной выборки пациентов с установленным диагнозом «ювенильный идиопатический артрит» (ЮИА) в сравнении с группой госпитального контроля. В группе пациентов с ЮИА диагностированы все подтипы заболевания, среди которых наиболее представительную группу составляют пациенты с олигоартритом; 70% пациентов ЮИА — девочки. Демографические особенности и наблюдаемое распределение по подтипам заболевания соответствуют известным данным литературы.
Исследовано влияние пяти полиморфных локусов («755622, «5844572, «5742909, «7574865 и «3761847), контролирующих иммунный и воспалительный ответы, на риск развития ЮИА в целом и отдельных его под-
типов. Среди изученных полиморфных вариантов наиболее существенным эффектом обладал гомозиготный по минорному аллелю генотип GG TRAF1/C5 (rs3761847), частота которого преобладала в группе ЮИА, особенно у девочек. При сравнении результатов гено-типирования по этому локусу при различных подтипах заболевания оказалось, что у пациентов с системным заболеванием частота минорного аллеля G TRAF1/C5 статистически значимо выше, чем у пациентов с олигоартри-том. Показатель отношения шансов OR = 2,43; 95% CI [1,05-5,6] при p = 0,037 указывал на более чем двукратное увеличение вероятности развития тяжелой формы заболевания у носителей этого аллеля.
Интересные, но неоднозначные данные получены относительно эффектов полиморфизма в локусе rs7574865 гена STAT4: минорный аллель Т повышал риск развития РФ-негативного полиартрита (OR = 2,00; 95% CI [1,00-4,02]; p = 0,047), но снижал вероятность появления у детей олигоартрита (OR = 0,61; 95% CI [0,38-1,00]; p = 0,05). Полиморфизм других изученных локусов существенно не изменял чувствительность белорусской популяции к ЮИА. Полученные результаты свидетельствуют об индивидуальных (возможно, альтернативных) молекулярно-генетических путях патогенеза различных подтипов заболевания. Однако для доказательства наличия или отсутствия ассоциаций ЮИА с определенными генетическими вариантами необходимо расширение выборок и дальнейшие исследования с учетом гендерных, возрастных и других этиологически и патогенетически важных факторов.
Список использованных источников
1. Adib, N. Outcome following onset of juvenile idiopathic inflammatory arthritis: I. frequency of different outcomes / N. Adib, A. Silman, W. Thomson // Rheumatology (Oxford). — 2005. — Vol. 44, № 8. — P. 995-1001.
2. Prahalad, S. A comprehensive review of the genetics of juvenile idiopathic arthritis / S. Prahalad, D.N. Glass // Pediatr. Rheumatol. Online J. — 2008. — Vol. 6:11.
3. Dense genotyping of immune-related disease regions identifies 14 new susceptibility loci for juvenile idiopathic arthritis / A. Hinks
[et al.] // Nat. Genet. 2013. — Vol. 45, № 6. — P. 664-669. — doi: 10.1038/ng.2614.
4. Angeles-Han, S. The genetics of juvenile idiopathic arthritis: what is new in 2010? / S. Angeles-Han, S. Prahalad // Curr. Rheumatol. Rep. — 2010. — Vol. 12, № 2. — P. 87-93. — doi: 10.1007/s11926-010-0087-0.
5. Independent confirmation of juvenile idiopathic arthritis genetic risk loci previously identified by immunochip array analysis / R.C. Chiaroni-Clarke [et al.] // Pediatr. Rheumatol. Online J. — 2014. — Vol. 12:53. — doi: 10.1186/1546-0096-12-53.
6. Частота генотипов и аллелей полиморфных локусов генов воспалительного ответа PTN22, TNFa и MIF у детского контингента Республики Беларусь / Н.В. Савина [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. трудов. — 2016, Т. 22. — С. 14-24.
7. Sambrook, J. Isolation of high-molecular-weight DNA from mammalian cells / J. Sam-brook, E.F. Fritsch, T. Maniatis // Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Pla-inview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press — 1989. — P. 9.14-9.23.
8. A genetic role for macrophage migration inhibitory factor (MIF) in adult-onset Still's disease / F.-F. Wang [et al.]. // Arthritis Research & Therapy. — 2013. — Vol. 15, R65. — P. 2-8.
9. CTLA-4 and CD28 activated lymphocyte molecules are closely related in both mouse and human as to sequence, message expression, gene structure, and chromosomal location / K. Harper [et al.] // J. Immunol. — 1991. — Vol. 147, № 3. — Р. 1037-1044.
10. Is there an association between two-STAT4 gene polymorphisms and rheumatoid arthritis in Turkish population? / B. Yuksel [et al.] // Arch. Rheumatol. — 2014. — Vol.29, №1. — P. 20-27.
11. Susceptibility to childhood-onset rheumatoid arthritis: investigation of a weighted genetic risk score that integrates cumulative effects of variants at five genetic loci / S. Prahalad [et al.] // Arthritis Rheum. — 2013. — Vol. 65, № 6. — P. 1663-1667.
12. A MIF haplotype is associated with the outcome of patients with severe sepsis: a case control study / L.E. Lehmann [et al.] // Journal
of Translational Medicine. — 2009. — 7:100. — doi:10.1186/1479-5876-7-100.
13. The Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) [Electronic resource] // NCBI, National Center for Biotechnology Information. — Date of access: 15.02.2016.
14. Renner, P. Macrophage migration inhibitory factor: gene polymorphisms and susceptibility to inflammatory diseases / P. Renner, T. Roger, T. Calandra // Clin. Infect. Dis. — 2005. — Vol. 41, Suppl. 7. — S513-519.
15. Glucocorticoids suppress macrophage migration inhibitory factor (MIF) expression in a cell-type-specific manner. / Z. Alourfi [et al.] // J. Mol. Endocrinol. — 2005. — Vol. 34. — P. 583-595.
16. A functional promoter polymorphism in the macrophage migration inhibitory factor (MIF) gene associated with disease severity in rheumatoid arthritis. / J.A. Baugh [et al.] // Genes Immun. — 2002. — Vol. 3. — P. 170-176.
17. Macrophage migration inhibitory factor enzymatic activity, lung inflammation, and cystic fibrosis / H. Adamali [et al.] // Am. J. Respir. Crit. Care Med. — 2012. — Vol. 186, № 2. — P. 162-169.
18. A CTLA-4 gene polymorphism at position -318 in the promoter region affects the expression of protein. / X.B. Wang, [et al.] // Genes Immun. — 2002. — Vol. 3. — P. 233-234.
19. Signaling by IL-12 and IL-23 and the im-munoregulatory roles of STAT4 / W.T. Watford [et al.] // Immunol. Rev. — 2004. — Vol. 202. — P. 139-156.
20. Kaplan, M.H. STAT4: a critical regulator of inflammation in vivo. / M.H. Kaplan // Immunol. Res. — 2005. — Vol. 31. — P. 231-242.
21. STAT4 gene polymorphism in patients after renal allograft transplantation // E. D^browska-Zamojcin [et al.] // Cent. Eur. J. Immunol. — 2016. — Vol. 41, № 3. — P. 255-259.
22. Gasque, P. Complement: a unique innate immune sensor for danger signals. / P. Gasque // Mol. Immunol. — 2004. — Vol. 41, № 11. — P. 1089-1098.
23. Systematic review and meta-analysis: pharmacogenetics of anti-TNF treatment response in rheumatoid arthritis / S. Bek [et al.] // The Pharmacogenomics Journal. — 2017. — Vol. 17. — P. 403-411.
24. Бабич, П.Н. Применение современных статистических методов в практике кли-
нических исследований / П.Н. Бабич, А.В. Чубенко, С.Н. Лапач // Украшский медичний часопис. — 2005. — №2(46). — С.113-119.
25. Oberle, E.J. Polyarticular juvenile idiopathic arthritis - epidemiology and management approaches / E.J. Oberle, J.G. Harris, J.W. Verb-sky // Clin. Epidemiol. — 2014. —Vol. 6. — P. 379-393.
26. Заваденко, Н.Н. Клинические проявления и лечение синдрома вегетативной дисфункции у детей и подростков / Н.Н. Заваденко, Ю.Е. Нестеровский // Педиатрия. — 2012. — Т. 91, № 2 (доступ на сайте http://medi.ru/doc/ a1501118.htm).
27. Waalkes, R. Varicocele in adolescents: a review and guideline for the daily practice / R. Waalkes, I.F. Manea, J.M. Nijman // Arch. Esp. Urol. — 2012. — Vol. 65, № 10. — P. 859-871
28. International League of Associations for Rheumatology classification of juvenile idiopathic arthritis: second revision, Edmonton, 2001 / RE. Petty [et al.] // J. Rheumatol. — 2004. — Vol. 31, № 2. — P. 390-392.
29. Алексеева, Е.И. Ювенильный артрит: возможности медикаментозного и немедикаментозного лечения на современном этапе / Е.И. Алексеева, Т.М. Бзарова // Лечащий Врач: научно-практический журнал. — М., 2011. — № 8. — С. 84-89 (доступ на сайте http://www. lvrach.ru/2011/08/15435267).
30. Oen, K. Epidemiology of juvenile rheumatoid arthritis in Manitoba, Canada, 1975—92: cycles in incidence / K. Oen, M. Fast, B. Postl // J. Rheumatol. — 1995. — Vol. 22, № 4. — P. 745-750.
31. Incidence and prevalence of juvenile idiopathic arthritis in Catalonia (Spain) / C. Modesto [et al.] // Scand. J. Rheumatol. — 2010. — Vol. 39, № 6. — P. 472-479.
32. Merino, R. Evaluation of ILAR classification criteria for juvenile idiopathic arthritis in Spanish children / R. Merino, J. De Inocencio, J. Garcia-Consuegra // J. Rheumatol. — 2001. — Vol. 28, № 12. — P. 2731-2736.
33. Prevalence and distribution of juvenile idiopathic arthritis in a region of Western France / E. Solau-Gervais [et al.] // Joint Bone Spine. — 2010. — Vol. 77, № 1. — P. 47-49.
34. Overlap of disease susceptibility loci for rheumatoid arthritis and juvenile idiopathic ar-
thritis / A. Hinks [et al.] // Ann. Rheum. Dis. — 2010. — Vol. 69, № 9. — P. 1049-1053.
35. Association of STAT4 with rheumatoid arthritis: A replication study in three European populations / G. Orozco [et al.] // Arthritis Rheum. — 2008. — Vol. 58, № 7. — P. 1974-1980.
36. Polymorphisms in STAT-4, IL-10, PSORS1C1, PTPN2 and MIR146A genes are associated differently with prognostic factors in Italian patients affected by rheumatoid arthritis / C. Ciccacc [et al.] // Clinical and Experimental Immunology. — 2016. — doi:10.1111/ cei.12831.
37. STAT4 rs7574865 G/T and PTPN22 rs2488457 G/C polymorphisms influence the risk of developing juvenile idiopathic arthritis in Han Chinese patients / Z.-D. Fan [et al.] // PLoS One. — 2015. — Vol. 10:3.
38. Association of STAT4 with susceptibility to rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus in the Japanese population / S. Kaboyashi [et al.] // Arthritis Rheum. — 2008. — Vol. 58, № 7. — P. 1940-1946.
39. Association of STAT4 with rheumatoid arthritis in the Korean population / H.-S. Lee [et al.] // Mol. Med. — 2007. — № 9-10. — P. 455-460.
40. No evidence for allelic association of a human CTLA-4 promoter polymorphism with autoimmune thyroid disease in either population-based case-control or family-based studies / J.M. Heward [et al.] // Clin. Endocrinol. (Oxf). — 1998. — Vol. 49, № 3. — P. 331-334.
41. Association of -318 C/T and +49 A/G cytotoxic T lymphocyte antigen-4 (CTLA-4) gene polymorphisms with a clinical subset of Italian patients with systemic sclerosis / G. Balbi [et al.] // Clin. Exp. Immunol. — 2007. — Vol. 149, № 1. — P. 40-47.
42. Influence of CTLA-4/CD28/ICOS gene polymorphisms on the susceptibility to cervical squamous cell carcinoma and stage of differentiation in the Polish population / E. Paw-lak [et al.] // Hum. Immunol. — 2010. — Vol. 71, № 2. — P. 195-200.
43. Independent replication analysis of genetic loci with previous evidence of association with juvenile idiopathic arthritis / J.A. Ellis [et al.] // Pediatric Rheumatology. — 2013. — Vol. 11:12.
44. Investigation of juvenile idiopathic arthritis susceptibility loci: Results from a Greek popula-
tion / D.G. Gimopoulu [et al.] // Human Immunology. — 2013. — Vol. 74, № 9. — P. 1194-1198.
45. An updated meta-analysis of the signal transducer and activator of transcription 4 (STAT4) rs7574865 G/T polymorphism and rheumatoid arthritis risk in an Asian population / X. Jiang [et al.] // Scand. J. Rheumatol. —
2014. — Vol. 43, № 6. — P. 477-480.
46. Complex genetic predisposition in adult and juvenile rheumatoid arthritis / B. Miterski [et al.] // BMC Genetics. — 2004. — Vol. 5, № 2. — doi: 10.1186/1471-2156-5-2.
47. Lack of association of functional CTLA4 polymorphisms with juvenile idiopathic arthritis / S. Prahalad [et al.] // Arthritis Rheum. — 2008. — Vol. 58, № 7. — P. 2147-2152.
48. Study of the association between CD28/ CTLA-4 expression and disease activity in juvenile idiopathic arthritis / L. Zhang [et al.] // Experimental and Therapeutic Medicine. —
2015. — Vol. 9, № 5. — P. 1733-1738.
49. Mutation screening of the macrophage migration inhibitory factor gene: positive association of a functional polymorphism of macrophage migration inhibitory factor with juvenile idiopathic arthritis / R. Donn [et al.] // Arthritis Rheum. — 2002. — Vol. 46. — P. 2402-2409.
50. Contribution of the -173 G/C polymorphism of macrophage migration inhibitory factor gene to the risk of inflammatory bowel diseases / K. Przybylowska [et al.] // Pol. Przegl. Chir. — 2011. — Vol. 83. — P. 76-80.
51. A functional promoter polymorphism in the macrophage migration inhibitory factor (MIF) gene associated with disease severity in rheumatoid arthritis / J.A. Baugh [et al.] // Genes and Immunity. — 2002. — Vol. 3. — P. 170-176.
52. Macrophage migration inhibitory factor (MIF): genetic evidence for participation in early onset and early stage rheumatoid arthritis / M.A. Llamas-Covarrubias [et al.] // Cytokine. — 2013. — Vol. 61. — P. 759-765
53. Macrophage migration inhibitory factor: Association of -794 CATT and -173 G>C polymorphisms with TNF- in systemic lupus erythematosus / U. De la Cruz-Mosso [et al.] // Hum. Immunol. — 2014. — Vol. 75, № 5. — P. 433-439.
54. Роль фактора, ингибирующего миграцию макрофагов, в хронизации патологического процесса (обзор литературы) / А.С. Водопьянов [и др.] // Медицинский вестник юга России. — 2013. — №3. — С. 4-7.
N.V. Savina1, H.A. Yatskiu1, N.V. Nikitchenko1, T.D. Kuzhir1, E.V. Sechko2, A.M. Tchitchko2,
A.V. Sukalo2, R.I. Goncharova1
POLYMORPHISM OF A SET OF GENES INVOLEVED IN IMMUNE AND INFLAMMATORY RESPONSES AS A PREDISPOSING FACTOR FOR JUVENILE IDIOPATHIC ARTHRITIS
institute of Genetics and Cytology of the NAS of Belarus Minsk BY-220072, Republic of Belarus
2Belarusian State Medical University Minsk, BY-220116, Republic of Belarus,
The results of comparison between groups of patients with diagnosed juvenile idiopathic arthritis (JIA) and children without joint pathology with respect to clinical and demographic traits as well as the distribution of genotype/allele frequencies in five polymorphic loci controlling the inflammatory and immune responses are presented herein. It was established that girls prevailed among patients with JIA (70%), and oligoarthritis is the most common subtype of the disease (66%). Polymorphism of TRAF1/C5 and STAT4 genes was shown to contribute to JIA predisposition in the Belarusian population. The frequency of GG genotype in the rs3761847 locus (TRAF1/C5) was significantly increased in the total sample of JIA patients as compared to the control group. Besides, the G minor allele increased the chance of developing of a severe disease subtype — systemic arthritis. Polymorphism of the STAT4 gene (rs7574865) oppositely affected different subtypes of JIA, the minor T allele protecting against oligoarthritis and increasing the risk of seronegative polyarthritis. Findings indicate specific molecular mechanisms of pathogenesis of different JIA subtypes.
Key words: juvenile idiopathic arthritis, immune and inflammatory responses, gene polymorphism.
Дата поступления статьи: 20 февраля 2018 г.
