CC BY
31
УДК 575
ПОЛИМОРФИЗМ ПРОМОТОРНЫХ УЧАСТКОВ ГЕНОВ МАТРИЧНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ (ММР2, ММР3, ММР9) ПРИ ВОЗРАСТНОЙ МАКУЛОДИСТРОФИИ СРЕДИ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СТАРШИХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП ЕВРОПЕОИДНОГО НАСЕЛЕНИЯ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ
Владимир Иосифович КОНЕНКОВ1, Алла Владимировна ШЕВЧЕНКО1, Виктор Федорович ПРОКОФЬЕВ1, Лилия Владимировна ДУДНИКОВА2, Наталья Юрьевна КАШКИНА2, Дмитрий Валерьевич ЧЕРНЫХ2
1 ФГБУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН 630117, Новосибирск, ул. Тимакова,2
2 Новосибирский филиал ФГБУМНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Минздрава России
630096, г. Новосибирск, ул. Колхидская, 10
Одним из основных звеньев патогенеза возрастной макулярной дегенерации (ВМД), наряду с процессами старения клеток сетчатки и расстройства зрительного цикла, являются дистрофические изменения в межклеточном матриксе. Поддержание нормального экстрацеллюлярного мактрикса между эпителием сетчатки и мембраной Бруха происходит за счет регулирования активности матричных металлопротеиназ ММР-2, ММР-3, ММР-9. Поскольку регуляция экспрессии генов металлопротеиназ происходит прежде всего на транскрипционном уровне, мы провели анализ ассоциированности полиморфизма их промоторных регионов с развитием возрастной макулодистрофии. Материал и методы. Обследовано 52 пациента с ВМД и 49 лиц без ВМД. Полиморфизм про-моторных регионов генов ММР2-1306 С^Т, ММР3 -1171 5А^6А,ММР9 -1562 С^Тисследовали методом ре-стрикционного анализа продуктов амплификации. Результаты и обсуждение. Выявлены возрастные особенности в распределении частот генотипов анализируемых генов, ассоциированные с риском развития ВМД. Кроме того, ассоциированность полиморфизма ММР9 с патологией носит двоякий характер: в «младшей» возрастной группе генотип ММР9 СС является фактором резистентности, а в «старшей» возрастной группе - фактором предрасположенности к заболеванию, что, вероятно, может свидетельствовать о непрямом характере связи между полиморфизмом ММР и ВМД. Таким образом, полученные нами пилотные данные свидетельствуют в пользу необходимости дальнейшего исследования ассоциированности полиморфизма матричных металлопротеиназ с ВМД и включения в анализ полиморфных позиций генов, продукты которых сопряженно вовлечены в процесс развития заболевания.
Ключевые слова: возрастная макулярная дегенерация, полиморфизм генов, матричные металлопротеиназы.
Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) -прогрессирующее дегенеративное заболевание макулярной области сетчатки, являющееся ведущей причиной потери центрального зрения у пожилых людей в развитых странах [20]. По данным Всемирной организации здравоохранения, ее распространенность составляет 300 человек на
100 тысяч населения, 25-30 млн человек в мире страдает ВМД. В возрасте старше 40 лет заболевают 25-40 % населения, среди лиц старше 60 лет данная патология выявляется у 58 % [12]. В настоящее время проблема становится все более актуальной, так как, с одной стороны, возросшая продолжительность жизни человека во многих
Коненков В.И. - д.м.н., проф., академик РАН, руководитель лаборатории клинической иммуногенетики, директор, e-mail: konenkov@soramn.ru
Шевченко А.В. - к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории клинической иммуногенетики, e-mail: shalla64@mail.ru
Прокофьев В.Ф. - к.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории клинической иммуногенетики,
e-mail: vprok@ngs.ru
Дудникова Л.В. - врач-офтальмолог
Кашкина Н.Ю. - врач-офтальмолог
Черных Д.В. - врач-офтальмолог
странах приводит к увеличению доли населения пожилого возраста, а с другой стороны, идет процесс «омоложения» заболевания вследствие внедрения в нашу жизнь все новых и новых компьютерных и телевизионных технологий.
Заболевание представляет собой хронический дистрофический процесс, при котором происходит поражение хориокапиллярного слоя хо-риоидеи, мембраны Бруха и слоя пигментного эпителия сетчатки [11]. Одним из основных звеньев патогенеза ВМД, наряду с процессами старения клеток сетчатки и расстройства зрительного цикла, являются дистрофические изменения в межклеточном матриксе, сопровождающиеся процессами воспаления и патологическим ангио-генезом [19]. Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) индуцирует формирование сосудов, в том числе усиливая пролиферацию и миграцию эндотелиоцитов и индуцируя синтез металло-протеиназ - ферментов, необходимых для инвазии новообразованных сосудов в окружающие ткани [8]. Показано, что поддержание нормального внеклеточного мактрикса (коллагенов I и IV типов) между эпителием сетчатки и мембраной Бруха происходит за счет регулирования активности металлопротеиназ ММР-2, ММР-3, ММР-9 [10]. Поскольку регуляция экспрессии ММР происходит прежде всего на транскрипционном уровне, в промоторном регионе генов, и показаны полиморфизмы ММР2 -1306 С^Т, где аллельный вариант *С ассоциирован с высокой промоторной активностью, ММР-9 -1562 С^Т, где наличие минорного аллеля *Т в генотипе обеспечивает высокую транскрипционную активность гена, полиморфизм ММР3 -1171, обладающей высокой транскрипционной активностью при носительстве генотипа 5А5А [13, 17], мы провели анализ ассоциированности полиморфизма промоторных регионов генов металлопротеиназ с развитием ВМД.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Обследован 101 пациент (202 глаза), прошедший диагностическое обследование на базе Новосибирского филиала ФГБУ МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова в 2013 г. Все пациенты относились к представителям европеоидного населения РФ и идентифицировали себя и своих родителей как лиц русской национальности, длительное время проживающих на территории Сибири, языком общения которых является русский. Все пациенты в зависимости от наличия ВМД были разделены на 2 группы. В основную группу вошли 52 пациента (104 глаза), критерии включения - наличие диагноза ВМД и
возраст старше 60 лет. Количество женщин в обследованной группе составило 41 человек, мужчин - 11 человек, средний возраст - 64,19 ± 1,03 года. Группу сравнения составили 49 пациентов (98 глаз), критерии включения - отсутствие диагноза ВМД и возраст старше 60 лет. Количество женщин в группе - 44, мужчин - 5, средний возраст - 59,92 ± 0,77 года. Критерием исключения для обеих групп являлось: наличие у пациентов острых и обострения хронических воспалительных заболеваний органа зрения, глаукомы, уве-ита различной этиологии, полной осложненной катаракты, отслойки сетчатки, рубеоза радужки. Также из исследования исключались пациенты с сахарным диабетом, аутоиммунными и опухолевыми процессами любой локализации. Диагноз ВМД выставлен на основании стандартного офтальмологического обследования, включающего визометрию, тонометрию, биомикроскопию, офтальмоскопию, периметрию, оптическую когерентную томографию макулярной области. Исследование одобрено комитетом по биомедицинской этике Новосибирского филиала ФГБУ МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова. У всех пациентов получено информированное согласие на забор крови, а также использование данных исследования в научных целях.
Однонуклеотидный полиморфизм промотор-ного региона гена ММР2 исследовали в позиции -1306 С^Т, ММР9 - в позиции -1562 С^Т. Участки промоторного региона генов амплифи-цировали с использованием пары специфичных праймеров [6], затем продукты амплификации подвергали гидролизу эндонуклеазами рестрикции BstXI для ММР2 и SphI для ММР9 («СибЭн-зим», Новосибирск). Полиморфизм 5А6А ММР3 -1171 анализировали с использованием специфичных праймеров и эндонуклеазы рестрикции ТШ («СибЭнзим», Новосибирск) [21]. Электрофорез проводили в 2 % агарозном геле.
При статистическом анализе результатов исследований использовали такие показатели, как частота встречаемости генов, генотипов, отношение шансов (OR) с расчетом 95 % доверительного интервала (OR, 95 % С1). Расчет величины OR проводили по методу Вульфа - Холдейна [1, 16], частоту встречаемости отдельных генотипов и их комбинаций (/) определяли как процентное отношение индивидов, несущих генотип (комбинацию генотипов), к общему числу обследованных в группе по формуле:/ = п/И, где п - количество раз встречаемости генотипа (комбинации), N - численность обследованных. Распределение генотипов по исследованным полиморфным ло-кусам проверяли на соответствие равновесию Харди - Вайнберга [2]. Для повышения степени
выраженности взаимосвязи между количественными и качественными показателями применяли критерий X Колмогорова - Смирнова. С помощью данного критерия мы определяли точку максимального расхождения между выборками по возрасту, которая может использоваться как критическая при разделении всех испытуемых на тех, у кого «есть заболевание», и тех, у кого «нет заболевания» [4, 5]. Достоверность различий частот распределения изучаемых признаков в альтернативных группах определяли по критерию х2 с поправкой Йейтса на непрерывность и двустороннему варианту точного метода Фишера для четырехпольных таблиц - PTMF2 [3].
РЕЗУЛЬТАТЫ
В результате исследования полиморфизма трех генов матричных металлопротеиназ ММР2 (-1306), ММР3 (-1171) и ММР9 (-1562) у пациентов с ВМД относительно здоровых лиц аналогичного возраста установлено, что частоты их генотипов в сопоставляемых группах находятся в равновесии Харди - Вайнберга и достоверных различий частот генотипов в оппозитных группах не наблюдается (табл. 1). Учитывая, что одним из факторов риска развития заболевания является возраст, все обследованные были разделены с помощью критерия Колмогорова - Смирнова на две возрастные группы: группу 1 «условно более молодых» (68 лет и младше) и группу 2 «более пожилых» (старше 68 лет) (табл. 2). В группе 1 выявлены статистически значимые различия в частотах генотипов ММР9. Генотип ММР9 СС, ответственный за более низкий уровень экспрессии, достоверно реже встречается у пациентов более молодого возраста относительно здоровых лиц своей возрастной группы, а в старшей возрастной группе он является фактором риска
развития патологии (соответственно OR = 0,43; р = 0,047 и OR = 5,60; р = 0,028).
В группах «пожилых» пациентов с ВМД в развитие болезни включены все три анализируемые матричные металлопротеиназы. У этих больных частота генотипа ММР2 -1306 СС, ответственного за повышенный уровень экспрессии белка, увеличена и ассоциирована с патологией (OR = 11,43; р = 0,0081), а также статистически значимо повышена частота гетерозиготного генотипа генаММР3 (ОЯ = 16,00; р = 0,0009).
ОБСУЖДЕНИЕ
Семейство матричных металлопротеиназ (ММР) ответственно за деградирование компонентов внеклеточного матрикса и играет важную роль в физиологическом и патологическом ремо-делировании тканей. Показана секреция ММР1, 2, 3 и 9 пигментным эпителием сетчатки и хори-оидальными эндотелиальными клетками мембраны Бруха, причем ее выраженность у пациентов с ВМД и у здоровых лиц аналогичного возраста заметно различается [10]. Именно поэтому вызывает интерес полиморфизм промоторных регионов генов металлопротеиназ, регулирующих уровень их белкового продукта. На сегодняшний день ассоциированности полиморфизма промо-торных регионов генов ММР2, ММР3 и ММР9 с макулодистрофией в мире посвящены единичные работы. Показано, что пациенты с ВМД и группой контроля не различаются по частоте генотипов ММР2 С-1306Т и ММР3 5А -11716А [14, 15, 18], что подтверждено и в нашем исследовании. Единственные опубликованные на сегодняшний день данные регрессионного анализа показали, что генотип ММР9 (-1562) СС увеличивал вероятность развития ВМД с небольшим значением отношения шансов. Данные закономерности со-
Таблица 1
Анализ частоты анализируемых генотипов у обследованных
Полиморфная позиция Генотип Пациенты с ВМД, N = 52, % Пациенты без ВМД, N = 49, % оя 95 % С1 РТМБ2
ММР2 -1306 ТТ 8 (15,38) 8 (16,33) 0,93 0,32-2,71 1,0000
ТС 14 (26,92) 18 (36,73) 0,63 0,27-1,48 0,3923
СС 30 (57,69) 23 (46,94) 1,54 0,70-3,38 0,3221
ММР3 -1171 5А5А 8 (15,38) 11 (22,45) 0,63 0,23-1,72 0,4480
5А6А 32 (61,54) 25 (51,02) 1,54 0,70-3,39 0,3201
6А6А 12 (23,08) 13 (26,53) 0,83 0,34-2,05 0,8182
ММР9 -1562 СС 29 (55,77) 30 (61,22) 0,80 0,36-1,77 0,6869
СТ 21 (40,38) 17 (34,69) 1,28 0,57-2,86 0,6815
ТТ 2 (3,85) 2 (4,08) 0,94 0,13-6,95 1,0000
Таблица 2
Анализ частоты генотипов ММР2, ММР3, ММР9 у пациентов с ВМДразных возрастных групп
относительно здоровых
Полиморфная позиция Генотип Пациенты с ВМД, N = 52, % Пациенты без ВМД, N = 49, % оя 95 % С1 РТМБ2
ММР2 -1306, «молодые» ТТ 4 (7,69) 7 (14,29) 0,50 0,14-1,83 0,3487
ТС 10 (19,23) 18 (36,73) 0,41 0,17-1,01 0,0744
СС 20 (38,46) 22 (44,90) 0,77 0,35-1,70 0,5494
ММР2 -1306, «пожилые» ТТ 4 (7,69) 1 (2,04) 4,00 0,43 -37,11 0,3635
ТС 4 (7,69) 0 (0,00) 9,19 0,48-175,24 0,1182
СС 10 (19,23) 1 (2,04) 11,43 1,40-93,04 0,0081
ММР3 -1171, «молодые» 5А5А 7 (13,46) 11 (22,45) 0,54 0,19-1,52 0,3015
5А6А 19 (36,54) 24 (48,98) 0,60 0,27-1,33 0,2318
6А6А 8 (15,38) 12 (24,49) 0,56 0,21-1,52 0,3201
ММР3 -1171, «пожилые» 5А5А 1 (1,92) 0 (0,00) 2,88 0,11-72,48 1,0000
5А6А 13 (25,00) 1 (2,04) 16,00 2,00-127,74 0,0009
6А6А 4 (7,69) 1 (2,04) 4,00 0,43-37,11 0,3635
ММР9 -1562, «молодые» СС 19 (36,54) 28 (57,14) 0,43 0,19-0,96 0,0470
СТ 15 (28,85) 17 (34,69) 0,76 0,33-1,77 0,6691
ТТ 0 (0,00) 2 (4,08) 0,18 0,01-3,87 0,2329
ММР9 -1562, «пожилые» СС 10 (19,23) 2 (4,08) 5,60 1,16-27,01 0,0288
СТ 6 (11,54) 0 (0,00) 13,84 0,76-252,57 0,0271
ТТ 2 (3,85) 0 (0,00) 4,90 0,23-104,70 0,4954
хранялись и при делении на возрастные группы, причем наличие генотипа ММР9 (-1562) СС являлось фактором риска развития ВМД в раннем возрасте (до 65 лет) (ОЯ = 1,51; р = 0,046) [14].
В исследованной нами группе русских европеоидов выявлены достоверные возрастные различия по трем анализируемым генам. Кроме того, ассоциированность полиморфизма ММР9 с патологией носит двоякий характер: в «младшей» возрастной группе генотип ММР9 СС является фактором резистентности, а в «старшей» - фактором предрасположенности к заболеванию, что, вероятно, может свидетельствовать о непрямом характере взаимосвязи между полиморфизмом ММР и риском развития ВМД. Так, показано, что многие представители семейства ММР вовлечены в процессы васкулярного ремоделирования в качестве промитотических факторов, реализующих свой эффект посредством регулирования экспрессии иных факторов, таких как семейство VEGF [19]. Для ММР-9, например, доказана способность повышать биодоступность VEGF и тем самым индуцировать процесс неоангиогенеза [7]. Выявленное нами значительное повышение в старшей возрастной группе частоты встречаемости гомозиготного варианта СС гена ММР9, тесно ассоциированного с уменьшением продук-
ции самого фермента, свидетельствует о том, что носители данного генотипа обладают врожденно обусловленной способностью к более низкой инвазии новых сосудов в ткани глаза и более низкой способностью к поддержанию коллагенов, входящих в состав экстрацеллюлярного матрикса в оптимальном состоянии. Такое ослабление способности тканей глаза к поддержанию процессов неоангиогенеза на функционально оптимальном уровне, на наш взгляд, может приводить к развитию дистрофических процессов при возрастной макулодистрофии. Наряду с этим нами выявлено и значительное повышение в этой старшей возрастной группе частоты гомозиготного варианта СС генаММР2, ассоциированного с высокой про-моторной активностью гена при синтезе данного фермента, что свидетельствует о значительном разрегулировании функционирования внеклеточного матрикса у пожилых пациентов с таким комбинированным генотипом.
Таким образом, полученные нами практически пилотные данные свидетельствуют в пользу необходимости дальнейшего исследования ассоциированности полиморфизма матричных ме-таллопротеиназ с ВМД с вовлечением в анализ полиморфных позиций генов, продукты которых участвуют в развитии заболевания.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бабич П.Н., Чубенко А.В., Лапач С.Н. Применение современных статистических методов в практике клинических исследований. Сообщение третье. Отношение шансов: понятия, вычисление и интерпретация // Укр. мед. журн. 2005. 46. (2). 113-119.
2. Вейр Б. Анализ генетических данных. Дискретные генетические признаки. М., 1995. 400 с.
3. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М., 1999. 459 с.
4. Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. Л., 1978. 296 с.
5. Лашков К.В., Поляков Л.Е. Применение методов непараметрической статистики в научных медицинских исследованиях // Статистические методы исследования в медицине и здравоохранении. М., 1971. 32-92.
6. Шевченко А.В., Голованова О.В., Коненков В.И. и др. Анализ полиморфизма генов матриксных металлопротеиназ-2 и 9 у пациентов с ишемичес-кой болезнью сердца // Терапевт. арх. 2010. 82. (1). 31-35.
7. Bergers G., Brekken R., McMahon G. et al. Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis // Nat. Cell. Biol. 2000. 2. 737-744.
8. Ferrara N., Gerber H.-P., LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors // Nat. Med. 2003. 9. 669-676.
9. Funahashi Y., Shawber C., Sharma A. et al. Notch modulates VEGF action in endothelial cells by inducing matrix metalloprotease activity // Vasc. Cell. 2011. 3. 2.
10. Hussain A.A., Lee Y., Zhang J.-J., Marshall J. Disturbed matrix metalloproteinase activity of Bruch's membrane in age-related macular degeneration // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2011. 52. (7). 44594466.
11. Hyman L., Schachat A.P., He Q., Leske M.C. Hypertension, cardiovascular disease, and age-related macular degeneration. Age-Related Macular
Degeneration Risk Factors Study Group // Arch. Ophthalmol. 2000. 118. (3). 351-358.
12. Klein R., Klein B.E.K., Lee K.E. et al. Changes in visual acuity in population over a 10-year period. The Beaver Dam Study // Ophthalmol. 2001. 108. 1757-1766.
13. Lamblin N., Bauters Ch., Hermant X. et al. Polymorphisms in the promoter regions of MMP-2, MMP-3, MMP-9 and MMP-12 genes as determinants of aneurysmal coronary artery disease // J. Am. Coll. Cardiol. 2002. 40. (1). 43-48.
14. Liutkeviciene R., Lesauskaite V., Sinkunaite-Marsalkiene G. et al. The role of matrix metallopro-teinases polymorphisms in age-related macular degeneration // Ophthalmic Genet. 2013. doi: 10.3109/ 13816810.2013.838274.
15. Ortak H., Demir S., Ate§ O. et al. The role of MMP2 (-1306C>T) and TIMP2(-418G>C) promoter variants in age-related macular degeneration // Ophthalmic Genet. 2013. 34. (4). 217-222.
16. Pearce N. What does the odds ratio estimate in a case-control study? // Int. J. Epidemiol. 1993. 22. (6). 1189-1192.
17. Pollanen P., Lehtimaki T., Mikkelsson J. et al. Matrix metalloproteinase 3 and 9 gene promoter polymorphisms: joint action of two loci as a risk factor for coronary artery complicated plaques // Atherosclerosis. 2005. 180. 73-78.
18. Seitzman R.L., Mahajan V.B., Mangione C. et al. Estrogen receptor alpha and matrix metalloproteinase 2 polymorphisms and age-related maculopathy in older women // Am. J. Epidemiol. 2008. 167. 1217-1225.
19. Stone E.M. Macular degeneration // Annu. Rev. Med. 2007. 58. 477-490.
20. SwaroopA., ChewE.Y., Rickman C.B., Abecasis G.R. Unraveling a multifactorial late-onset disease: From genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration // Annu. Rev. Genomic Hum. Genet. 2009. 10. 19-43.
21. Takahashi M., Haro H., Wakabayashi Y. et al. The association of degeneration of the intervertebral disc with 5a/6a polymorphism in the promoter of the human matrix metalloproteinase-3 gene // J. Bone Joint Surg. 2001. 83. 491-495.
POLYMORPHISM OF PROMOTER SITES OF MATRIX METALLOPROTEINASE GENES (MMP2, MMP3, MMP9) AT AGE-RELATED MACULAR DEGENERATION AMONG REPRESENTATIVES OF SENIOR AGE GROUPS OF THE SIBERIA CAUCASIAN POPULATION
Vladimir Iosifovich KONENKOV1, Alla Vladimirovna SHEVCHENKO1, Viktor Fedorovich PROKOF'EV1, Liliya Vladimirovna DUDNIKOVA2, Nataliya Yurevna KASHKINA2, Dmitri Valerevich CHERNYKH2
1 Institute of Clinical and Experimental Lymphology of SB RAMS 630117, Novosibirsk, Timakov str., 2
2 S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution, Novosibirsk Branch 630071, Novosibirsk, Kolkhidskaya str., 10
One of the basic parts of age-related macular degeneration (AMD) pathogeneses alongside with processes of ageing retinal cells and frustration of visual cycle are dystrophic changes in intercellular matrix. Maintenance of normal extra cellular matrix between cells epithelium and Bruch's membrane occurs due to regulation of metalloproteinase MMP-2, MMP 3, MMP9 activity. The analysis of association between MMP promoter genes polymorphism and AMD development has been carried out considering that regulation of MMP expression occurs first of all on the transcriptions level. Materials and methods. 52 patients with AMD were examined. The group of comparison was made by 49 people. Polymorphism of promoter genes MMP 2 1306 C^T, MMP3-1171 5A^6A, MMP 9-1562 C^T was investigated with restriction analysis of amplified products. Results and discussions. Age features in distribution of genotypes frequencies of the analyzed genes associated with risk of development AMD are revealed. Besides, the association of MMP9 polymorphism with the pathology has the dual character: MMP9 CC genotype is the resistant factor in «younger» age group, but it is the factor of predisposition to disease in the «senior» age group. That probably can testify to indirect character of polymorphism association MMP with AMD. Thus, the received pilot data testify for the benefit of necessity of the further research of polymorphism matrix metalloproteinase associations with AMD and for inclusion into the analysis of polymorphic positions of the genes which products is connected are involved in the disease development.
Key words: Age-related macular degeneration, genes polymorphism, matrix metalloproteinase
Konenkov V.I. - doctor of medical sciences, professor, academician of RAS, head of the laboratory of clinical immunogenetics, director, e-mail: konenkov@soramn.ru
Shevchenko A.V. - candidate of biologic sciences, senior researcher of laboratory for clinical immunogenetics, e-mail: shalla64@mail.ru
Prokofiev V.F. - candidate of medical sciences, leading researcher of laboratory for clinical immunogenetics,
e-mail: vprok@ngs.ru
Dudnikova L.V. - ophthalmologist
Kashkina N.Yu. - ophthalmologist
Chernykh D.V. - ophthalmologist
