CC BY
62
УДК 575.174.4
© и. А. захаров 1 2, Е. В. Шайкевич 1
1 Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН, Москва;
2 Московский Государственный Университет им. М. В. Ломоносова, каф. генетики, Москва
& Изучен полиморфизм мтДНК по гену COI в популяции двуточечной божьей коровки Adalia bipunctata Санкт Петербурга и зараженность жуков симбиотической бактерией Spiroplasma. Обнаружено 13 митотипов, различающихся последовательностью нуклеотидов в средней части гена coi. Из проверенных 84 жуков 21 заражен Spiroplasma. среднее попарное различие нуклеотидов последовательностей coi среди зараженных жуков 0,001, среди незараженных 0,020, таким образом полиморфизм мтДНК значительно выше среди незараженных, чем среди зараженных жуков.
& Ключевые слова: двуточечная божья коровка; Adalia bipunctata; состав популяции; митохондриальная ДНК; Spiroplasma.
Поступила в редакцию 10.06.2010. Принята к публикации 27.10.2010.
полиморфизм мтднк в петербургской популяции adalia bipunctata и его связь с зараженностью симбиотической бактерией spiroplasma
ВВЕДЕНИЕ
Двуточечная божья коровка Adalia bipunctata L. (Coleoptera: Coccinel-lidae) является удобным объектом для разработки проблем экологической и популяционной генетики (обзоры — Majerus, 1994; Захаров, 1995). В проведенных на этом объекте исследованиях обычно учитывается полиморфизм по одному гену, определяющему окраску и характер рисунка на надкрыльях. Полиморфизм по молекулярным маркерам (митохондриальная ДНК) почти не изучался, он был описан только в одной работе (Schulenburg et al., 2002). Среди популяций A. bipunctata петербургская, которая явилась объектом настоящего исследования, выделяется очень высоким содержанием форм-ме-ланистов (Лусис, 1961; Сергиевский, Захаров, 1983; Захаров, 2009). Также было показано, что в этой популяции большой процент жуков заражен ци-топлазматической бактерией Spiroplasma (Захаров и др., 1998, 2000). Эта популяция обитает в северной части ареала вида и имеет возраст всего лишь около 300 лет (считая с момента основания Санкт-Петербурга). Поскольку размножение адалий в городе происходит главным образом на растениях-ин-тродуцентах (липа, карагана, дерн) численность жуков в Санкт-Петербурге намного превосходит их численность в естественных биотопах Ленинградской области. Все сказанное позволяло ожидать своеобразие генетической структуры этой популяции.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Использованные в настоящей работе жуки Adalia bipunctata L. (Coleoptera: Coccinellidae) были собраны на стадии имаго в июне 2009 г. на кустах караганы, растущих на Университетской наб., вдоль зданий Санкт-Петербургского Университета. Выборка была представлена перезимовавшими жуками, т. е. собравшимися в место сбора из разных колоний, где происходило их размножение. Состав изученной популяции по признаку окраски надкрылий описан в работе И. А. Захарова (2009).
Для выделения ДНК из живых жуков использовали набор DIAtom™ DNA Prep (Изоген, Москва). В реакции амплификации использовали по 0,1 мкг выделенной ДНК. Полимеразную цепную реакцию проводили на термоциклере GeneAmpR PCR System 2700 (Applied Biosystems, USA), применяя наборы для амплификации GenePak™ PCR Core (Изоген, Москва), придерживаясь инструкции производителя. Набор состоит из готовых Мастермиксов и PCR Diluenta. Конечные концентрации компонентов реакционной смеси были: Трис-HCl, pH 8,8, 67mM; (NH4)2SO4 16mM; MCl2 2,5 mM; dNTP 200pM каждого и одна единица Taq ДНК-полимеразы.
Шуленбург и др. (Schulenburg et al., 2002 ) показали, что в митохондри-альном геноме адалии один из наиболее изменчивых районов — средняя область гена СО1. В настоящей работе для амплификации этой области в по-лимеразной цепной реакции (ПЦР) были использованы рекомендованные в вышеупомянутой работе праймеры:
C1-j-1951-(5'-TTCATCAATTTTAGGAGCTG-3') и
C1-N-2618-(5'-TGCTATAATAGCAAATACAG-3').
28
генетика популяций и эволюция
Были получены амплифицированные продукты размером 700 п. н. Условия ПЦР: первичная денатурация — 5 мин при 94 °С; 35 циклов: денатурация при 94 °С — 30 сек, отжиг при 55 °С — 40 сек, синтез при 72 °С — 40 сек; завершающий синтез при 72 °С — 10 мин.
Определение зараженности жуков симбиотической бактерией Spiroplasma проводили с помощью ПЦР со специфическими к гену малой субъединицы 16S РНК бактерии праймерами:
MGSO-(5'-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3') и FP-(5'-GCTCAACCCCTAACCGCC-3') (Kuppeveld et al., 1992).
Условия проведения ПЦР: первичная денатурация — 5 мин при 94 °С; 35 циклов: денатурация при 95 °С — 35 сек, отжиг при 55 °С — 1 мин, синтез при 72 °С — 1 мин; завершающий синтез при 72 °С — 10 мин. Размер специфичного для ДНК Spiroplasma ПЦР-продукта составлял 429 п. н.
Ампликоны выявляли путем электрофореза в 1%-м агарозном геле (Sigma, США). Амплифицированные фрагменты ДНК гена COI выделяли из геля с использованием набора JETQUICK Gel Extraction Spin Kit (Genomed, Germany) для последующего секвенирования. Секвенирование проводили на приборе ABI PRISM 310 с использованием реагентов фирмы "Applera", США, по инструкции производителя. Последовательности, полученные в результате секвенирования продуктов амплификации COI гена, были зарегистрированы в GenBank под номерами: HM150667-HM150700.
Сопоставление нуклеотидных последовательностей выполняли с использованием программ ChromasPro и MEGA version 4.0 (Tamura et al., 2007) с помощью последней программы строили приведенное ниже филогенетическое дерево.
Описанные в работе (Schulenburg et al., 2002) и использованные нами для сравнения нуклеотидные последовательности центральной области гена СО1 были взяты из GenBank (AJ313060-AJ313070).
РЕЗУЛЬТАТЫ
По составу митотипов петербургская популяция Adalia bipunctata оказалась высоко полиморфной (рис. 1), в ней обнаружено 6 из 10 ранее описанных ми-тотипов (отсутствуют № 5, 6, 7, 8). Кроме того, нами найдены новые, которые были обозначены 11, 12, 13, 14, 15, 16 и 17 (рис. 1). Все новые митотипы, кроме 13, отличаются от ранее обнаруженных одной нуклео-тидной заменой. Митотип № 13 отличается от третьего тремя нуклеотдными заменами. Всего, таким образом, в проанализированной выборке из 34 особей было обнаружено 13 митотипов, из которых численно преобладает тип 1 (18 особей).
Среди изученных 84 жуков 21 оказался зараженным спироплазмой (что соответствует ранее полученным данным (Захаров и др., 1998, 2000). При анализе жуки не были разделены по полу; если самки составляют около 50 % выборки, то среди них доля зараженных оказывается равной около 50 % (самцы зараженными быть не могут, спироплазма является андроцидным агентом).
Как показывают данные, представленные на рис. 1 и 2, среди зараженных особей преобладает митотип 1 (11 жуков); встречаются также митотипы 2, 3, 11, 17, которые отличаются от первого только одной заменой нуклеотидов (рис. 1). В то же время среди незараженных спироплазмой встречено 10 митотипов, 9 из которых отличаются от типа 1 по 1—4, 24 и 34 нуклеотидам.
ОБСУЖДЕНИЕ
Хотя петербургская популяция располагается близко к северной границе ареала вида Adalia bipunctata, и можно было бы ожидать в ней низкий уровень полиморфизма как эффект бутылочного горлышка при основании этой популяции, она оказалась по мтДНК высоко полиморфной (13 митотипов). Для сравнения можно привести данные из работы (Schulenburg et al., 2002) по популяциям Билефельд-Германия и Москва, соответственно: 7 митотипов среди 16 особей и 8 среди 22. Подобных данных для других популяций нет.
Особый интерес представляют митотипы 9 и 10. По данным Шуленбурга и др. (Schulenburg et al., 2002) они встречаются в Великобритании (митотип 9), Германии (оба), Петербурге (оба), Москве (оба). При этом жуки митотипа 10 всегда заражены риккетсией, митотипа 9 — либо также содержат риккетсию, либо свободны от инфекции. В настоящей работе мы не учитывали зараженность риккетсией. Происхождение сильно отличающихся от всех остальных митотипов 9 и 10 заслуживает специального изучения.
Проведенное нами исследование позволяет рассмотреть влияние зараженности симбиотической бактерией на полиморфизм по мтДНК. Известно, что и симбиотические бактерии (Spiroplasma, Wolbachia), и мтДНК передаются строго по материнской линии, т. е. проявляют, формально говоря, «неравновесие по сцеплению». Как было отмечено в работе Шуленбурга и др. (Schulenburg et al., 2002) среди зараженных жуков преобладает один митотип — в случае спироплаз-мы № 1. Это наблюдение мы подтвердили и дополнили. Оказалось, что среди зараженных жуков резко снижен уровень полиморфизма мтДНК — были определены средние нуклеотидные различия между жуками в двух выборках — зараженных и незараженных. Для первой эта величина оказалась равной 0,001, для второй 0,020. Подобный эффект присутствия симбиотических бактерий был описан нами для популяций комаров (Шай-
[ 11111111 1112223333 3333333333 4444444455 55555]
[ 1122367788 9912455666 7791890012 3346677889 1233389901 23444]
[ 3623340358 1467547069 2504081468 4891769587 2403616984 02147] Митотип
#SP8 TGTCCATAAA ATTTACTTAG TACAGACATT TCTTATACCA GTAAATTTAC GATGG 1
#SP9+ ............................C....................................................3
#SP10+ ................................................G............2
#SP11 .....G..................................................................................................4
#SP12 .ACT....TG G.C.....GA ..T.AG.G.. CT.......G AC.TTC......CAA 9
#SP13+ ..............................................................................................................1
#SP14 AT.T...T.. GCCCGTC... C..GA.T..C .TCCGCGTT. A.GGTCCCGT ....T 10
#SP15 ..............................................................................................................1
#SP16 ..............................................................................................................1
#SP17 AT.T...T.. GCCCGTC... C..GA.T..C .TCCGCGTT. A.GGTCCCGT ....T 10
#SP18 ..............................................................................................................1
#SP19 .....................G......C....................................................12
#SP20 ..............................................................................................................1
#SP21+ ..............................................................................................................1
#SP22+ .................G..........................................................................11
#SP23 .................G..........................................................................11
#SP25 ..............................................................................................................1
#SP26 ....T............G......A...C....................................................13
#SP27 ......A................................................................................................14
#SP28 .....G...........G.................................G... 15
#SP29 ............................C....................................................3
#SP30 ............................C....................................................3
#SP32 ............................C.........................T 16
#SP33 ..............................................................................................................1
#SP35+ ..............................................................................................................1
#SP37+ ..............................................................................................................1
#SP40+ ..............................................................................................................1
#SP43+ ..............................................................................................................1
#SP44+ ...................................................G... 17
#SP49+ ..............................................................................................................1
#SP62+ ..............................................................................................................1
#SP65+ ..............................................................................................................1
#SP68+ ..............................................................................................................1
#SP79+ ..............................................................................................................1
#AJ313070type1 ..............................................................................................................1
#AJ313061type2 ................................................G............2
#AJ313062type3 ............................C....................................................3
#AJ313063type4 .....G..................................................................................................4
#AJ313064type5 ..............G................................................................................5
#AJ313065type6 ............................C.....................A...T 6
#AJ313066type7 ........................A............................................................7
#AJ313060type8 .......T....................C..........G ..............................8
#AJ313067type9 .ACT....TG G.C.....GA ..T.AG.G.. CT.......G AC.TTC......CAA 9
#AJ313068type10 AT.T...T.. GCCCGTC... C..GA.T..C .TCCGCGTT. A.GGTCCCGT ....T 10
Рис. 1. Сравнение вариабельных нуклеотидных сайтов средней области гена COI Adalia bipunctata из Санкт-Петербурга (SP) и ранее обнаруженных митотипов (GenBank: AJ313060-AJ313070). Плюсом обозначены особи, зараженные Spiroplasma
кевич и др., 2005) и другими авторами для ряда видов присутствие симбиотической бактерии придает насеко-
насекомых (Turelli et al., 1992; Jiggins, 2003 и др.). Эти мому какие-то значительные преимущества и заражен-
наблюдения могут быть объяснены тем, что симбиоти- ные линии, несмотря на редкость их возникновения,
ческие бактерии передаются вертикально в ряду поко- успешно распространяются в популяциях, что обеспе-
лений, а горизонтальная их передача происходит крайне чивает и распространение «сцепленного» с бактерией
редко. При таком исключительном событии — зараже- митотипа. Этот эффект, неоднократно описанный для
нии особи de novo возникает линия, в которой с мате- Wolbachia, как показали результаты настоящей рабо-
ринской стороны передаются внедрившаяся бактерия и ты, точно также имеет место и при распространении
определенный тип мтДНК. Вероятно, во многих случаях Spiroplasma.
Литература
SP27 SP68+ SP49+ SP20 SP43+ SP8 SP16 SP65+ SP62+
AJ313070type1 SP35+ SP15 SP79+ SP13+ SP40+ SP25 SP21+ SP37+ SP18 SP33 SP44+
SP28
32 |SP11 j*> AJ313063type4 AJ313064type5 ISP10+ 61 AJ313061type2 I SP22+ SP23
SP26 AJ312060type8
65~|_SP32
AJ313065type6
SP30
AJ313062type3 _SP9+
SP19 SP29 AJ313066type7
-1 SP12
<00 AJ313067type9 SP17
SP14
AJ313068type10
Рис. 2. Дендрограмма сходства последовательностей нуклео-тидов гена COI A. bipunctata, построенная с использованием метода Neighbor-Joning (NJ). Плюсом обозначены особи, зараженные Spiroplasma. Цифрами указаны бутстреп-коэффициенты, рассчитанные для 1000 повторов
1. Захаров И. А., 2009. Динамика генофонда петербургской популяции Adalia bipunctata за 75 лет наблюдений // Экологическая генетика. Т. 7. № 4. С. 57—59.
2. Захаров И. А., Шайкевич Е. В., Горячева И. И. Бактерии рода Spiroplasma инфицируют двуточечную божью коровку (Adalia bipunctata L.) в России // ДАН. 1998. Т. 362. № 4. С. 570-573.
3. Захаров И. А., Горячева И. И., Шайкевич Е. В., Доржу Ч. М., 2000. Распространение в популяциях Adalia bipunctata L. Евразии цитоплазматически наследуемой бактерии рода Spiroplasma, влияющей на соотношение полов // Генетика. Т. 36. № 2. С. 191-194.
4. Лусис Я. Я., 1961. О биологическом значении полиморфизма окраски у двуточечной коровки Adalia bipunctata L. // Latvijas Entomologs. № 4. С. 3-29.
5. Сергиевский С. О., Захаров И. А. 1983. Изучение генетического полиморфизма популяций двуточечной божьей коровки Adalia bipunctata (L.) Ленинградской области. 2. Состав популяций города Ленинграда // Генетика. Т. 19. С. 635- 640.
6. Шайкевич Е. В., Виноградова Е. Б., Платонов А. Е, и др., 2005. Полиморфизм митохондриальной ДНК и зараженность цитоплазматической симбиотической бактерией Wolbachia pipientis комаров комплекса Culexpipiens (Diptera, Culicidae) из России // Генетика. Т. 41. № 3. С. 320-325.
7. Jiggins F. M., 2003. Male-killing Wolbachia and mitochondrial DNA: selective sweeps, hybrid introgression and parasite population dynamics // Genetics. Vol. 164. P. 5-12.
8. Schulenburg J. H., Hurst G. D., Tetzlaff D. et al., 2002. History of infection with different male-killing bacteria in the two-spot ladybird beetle Adalia bipunctata revealed through mitochondrial DNA sequence analysis // Genetics. Vol. 160. P. 1075-1086.
9. TamuraK, Dudley J., Nei M., Kumar S., 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4. 0. Molecular Biology and Evolution. Vol. 24. P. 1596-1599. (Publication PDF at http://www. kumarlab. net/publications.
10. Turelli M., Hoffmann A. A., McKechnie S. W. 1992. Dynamics of cytoplasmic incompatibility and mtDNA variation in natural Drosophila simulans populations // Genetics. Vol. 132. P. 713-723.
11. VanKuppeveldF. J. M., Van der LogtH. T. M., Angulo A. F. et al., 1992. Genus- and species-specific identification of mycoplasmas by 16S rRNA amplification // Appl. Environ. Microbiol. Vol. 58. P. 2606-2615.
12.Zakharov I. A., Shaikevich E. V., 2001. The Stockholm populations of Adalia bipunctata (L) (Coleoptera: Coccinellidae) — a case of extreme female-biased population sex ratio // Hereditas. Vol. 134. P. 263-266.
POLYMORPHISM OF mtDNA IN ST PETERSBURG POPULATION OF ADALIA BIPuNcTATA AND ITS RELATION WITH INFECTION BY SYMBIOTIC BACTERIUM
spiroplasma
Zakharov I. A., Shaikevich E. V.
* SUMMARY: Polymorphism of the mtDNA gene coi was studied in a St. Petersburg population of two spot ladybird Adalia bipunctata and analyzed in relation with the presence of a symbiotic bacterium Spiroplasma. Variable nucleotide sequences in the middle part of the gene coi formed 13 mitotypes. 84 ladybirds were studied, 21 of these were found to be infected by Spiroplasma. Mean pairwise difference of nucleotides in the coi sequence was 0.001 for uninfected and 0.020 for infected individuals, thus mtDNA polymorphism was considerably higher among uninfected ladybirds compared with infected ones.
* KEY WORDS: two spot ladybird; Adalia bipunctata; population composition; mitochondrial DNA; Spiroplasma.
Ф Информация об авторах
Захаров Илья Артемьевич — член-корр. РАН, советник РАН. Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН. 119991 Москва, ул. Губкина 3. E-mail: iaz34@mail.ru.
Шайкевич Елена Владимировна — с. н. с.
Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН. 119991 Москва, ул. Губкина 3. E-mail: elenashaikevich@mail.ru.
Zakharov Ilya Artemjevich — corresponding member RAS. Vavilov Insitute of General Genetics RAS. 119991 Moscow, Gubkin Str. 3. E-mail: iaz34@mail.ru.
Shaikevich Elena Vladimirovna — Senior research scientist. Vavilov Insitute of General Genetics RAS. 119991 Moscow, Gubkin Str. 3. E-mail: elenashaikevich@mail.ru.
