CC BY
22© А.Н. Емельянова, Ю.А. Витковский, 2013 УДК 616.36-002.2-022.7:578.891]-092:[612.6.05:577.21
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ ИЛ2 (ТЗЗОв), ИЛ10 (С819Т) И ИЛ10 (01082А) ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВИРУСНОМ ГЕПАТИТЕ С
А.Н. Емельянова, кандидат медицинских наук, Ю.А. Витковский, доктор медицинских наук, профессор
Читинская государственная медицинская академия
Е-mail: yuvitkovsky@rambler.ru
Исследован полиморфизма генов цитокинов ИЛ2 (T330G), ИЛ10 (С819Т) и ИЛ10 (G1082A) при хроническом вирусном гепатите С. Проведен анализ частоты встречаемости полиморфизма T330G промоторной области гена ИЛ2, С819Т и G1082A промоторной области ИЛ10 у здоровых доноров и больных хроническим вирусным гепатитом С в разные стадии фибротических изменений в европеоидной популяции Забайкальского края. Среди пациентов с хроническим вирусным гепатитом С в разных стадиях фибротических изменений чаще встречается аллель G полиморфизма генов ИЛ2 (T330G), аллель Т гена ИЛ10 (С819Т), аллель А гена ИЛ10 (G1082A). При ХВГС без признаков цирроза гомозиготный вариант ТТполиморфизма ИЛ2 (T330G) выявлялся у 3%, GG — у 3% больных, превалировал гетерозиготный тип TG — у 94%. При ХВГС частота аллеля G гена ИЛ2 (T330G) составила 0,52, аллеля T среди больных — 0,48, в контроле — 0,96. У больных циррозом печени частота аллеля Т гена ИЛ2 (T330G) составила 0,71, а аллеля G — 0,29.
Ключевые слова: генетический полиморфизм, ИЛ2, ИЛ10, хронический вирусный гепатит С
POLYMORPHISM OF GENES OF CYTOKINES OFIL-2 (T330G), IL-10 (S819T) AND IL10 (G1082A) IN CHRONIC VIRUS HEPATITIS C A.N. Еmelyanova, Yu.A. Vitkovsky
Chita State Medical Academy
Summary. Polymorphism of cytokine genes IL-2 (T330G), IL-10 (S819T) and IL10 (G1082A) in chronic viral hepatitis C. The analysis of the frequency of occurrence T330G polymorphism in the promoter region of the gene IL-2, S819T and G1082A promoter region of IL-10 in healthy donors and patients with chronic hepatitis C at different stages of fibrotic changes Caucasian population of Trans-Baikal region. Among patients with chronic hepatitis C at different stages of fibrotic changes more common G allele polymorphism of IL-2 (T330G), T allele of the gene IL-10 (S819T) allele of the gene IL10 (G1082A). With no signs of chronic hepatitis C cirrhosis - homozygous TT polymorphism IL-2 (T330G) was detected in 3%, GG — 3% of persons, the heterozygotic TG type — 94% prevailed. Among patients with HCV G allele frequency of IL-2 gene (T330G) was 0,52, T allele among patients — 0,48 in the control group — 0,96). In patients with liver cirrhosis frequency of the T allele of IL-2 gene (T330G) was 0,71, and allele G — 0,29.
Key words: IL-2, IL-10, gene polymorphism, HCV- infection
ВВЕДЕНИЕ
Хронический вирусный гепатит С (ХВГС) представляет собой одну из важнейших проблем здравоохранения во всем мире в связи с высокой частотой формирования цирроза печени (ЦП) и гепатоцел-люлярной карциномы [2—4, 8]. Известно, что у одних больных наблюдается медленный темп развития фиброза печени, у других формирование ЦП происходит быстро [1,17]. Показана роль генетических факторов, которые определяют характер взаимодействия возбудителя и макроорганизма, модифицируют скорость фиброгенеза в печени при ХВГС [2, 12]. К настоящему времени изучена ассоциация полиморфизма примерно 20 генов-кандидатов с ХВГС, особенностями течения этого заболевания и его осложнениями [2, 13—16]. При этом большое
значение придается роли полиморфизма генов ци-токинов — участников иммунопатогенеза вирусных гепатитов [10, 13, 14].
Важное значение в реализации иммунного ответа играет ИЛ2, который вызывает антигенную неспецифическую пролиферацию всех популяций Т-лимфоцитов, является фактором роста киллерных клеток, принимает непосредственное участие в реализации механизмов противоопухолевого и трансплантационного иммунитета [9].
Показано, что вырабатываемый ТЫ ИЛ2 принимает участие в клеточном иммунном ответе и ассоциируется с антивирусным эффектом [9,18].Наличие аллельных вариантов в промоторной области гена ИЛ2 приводит к различным уровням транскрипции данного гена. Доказана роль полиморфизма гена
ИЛ2 в патогенезе ряда заболеваний. В частности, с использованием современных иммунологических и молекулярно-генетических методов исследования выявлено, что течение инфильтративного туберкулеза легких сопровождается снижением продукции ИЛ2 мононуклеарами периферической крови. Установлено, что подверженность туберкулезной инфекции ассоциирована с аллелем О, генотипами ТО и ОО полиморфизма Т-3300 гена ИЛ2. Максимальный риск развития инфильтративного туберкулеза легких связан с комбинацией генотипов ОО полиморфного участка Т-ЗЗОО гена ИЛ2. Иммуногене-тическим фактором, обладающим протективным эффектом в отношении туберкулеза, являются аллель Т и гомозиготный генотип ТТ полиморфизма Т-ЗЗОО гена [11].
Важную роль в регуляции иммунных и воспалительных реакций играет противовоспалительный цитокин ИЛ10. Обнаружен ряд полиморфизмов, связанных с единичными нуклеотидными заменами в гене ИЛ10. В ряде работ изучали влияние полиморфизмов гена ИЛ10 на печеночную патологию. Данные авторов противоречивы, в том числе о влиянии полиморфизмов гена ИЛ10 на течение вирусных гепатитов [2]. Отмечается ассоциация полиморфизма гена ИЛ10, связанного с более низким уровнем его продукции, с развитием С-вирусного гепатита у больных, перенесших трансплантацию печени [2].
Целью настоящего исследования было изучение частоты аномальных аллельных вариантов ИЛ2 (ТЗЗОО), ИЛ10 (С819Т) и ИЛ10 (О1082А) при ЦП в исходе ХВГС у жителей Забайкальского края.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Нами были обследовано 72 русских пациента с ХВГС, проживающих на территории Забайкальского
Таблица 1
ЧАСТОТА ВСТРЕЧАЕМОСТИ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ Т3300 В ГЕНЕ ИЛ2, С819Т В ГЕНЕ ИЛ10, 01082Л В ГЕНЕ ИЛ10 У БОЛЬНЫХ ЦП В ЗАБАЙКАЛЬСКОМ КРАЕ
Генотип ЦП (n=40) ХВГС (n=32) Контроль (n=100)
абс. % абс. % абс. %
ТЗЗОО в гене ИЛ2
Генотип ТТ 20 7 11 34 3 3
Генотип ТО 17 43 9 28 94 94
Генотип ОО 3 50 12 38 3 3
С819Т в гене ИЛ10
Генотип СС 16 40 19 60 70 70
Генотип СТ 21 53 7 22 27 27
Генотип ТТ 3 7 6 18 3 3
О1082А в гене ИЛ10
Генотип ОО 30 75 12 38 91 91
Генотип ОА - - - - 2 2
Генотип АА 10 25 20 62 7 7
края (40 мужчин и 32 женщины) в возрасте от 25 до 56 лет (средний возраст 33±4 года). При постановке диагноза использовали Международную классификацию хронических гепатитов, принятую Всемирным конгрессом гастроэнтерологов в Лос-Анджелесе (1994), основанную на этиологическом принципе, и классификацию ЦП по морфологическим признакам Чайлда—Пью.
Диагноз устанавливали на основании данных инструментального исследования (сцинтиграфиче-ское, УЗИ, эластометрия печени), серологического и генетического методов (полимеразная цепная реакция — ПЦР). Стадию фиброза оценивали согласно системе METAVIR [15]. Степень активности заболевания определяли по выраженности отклонений показателей цитолиза от нормы. Для оценки функционального состояния печени у всех пациентов изучали биохимические показатели стандартными унифицированными методами. Критерии исключения — наличие тяжелой соматической патологии, токсического и аутоиммунного гепатита. Пациенты были распределены на 2 группы: основную (40 пациентов с ЦП в исходе ХВГС, класс А по Чайлду—Пью, стадия компенсации) и группу сравнения (32 пациента с II—III стадии ХВГС невысокой степени активности). В качестве контрольной группы обследованы 100 (мужчин — 62, женщин — 38) условно здоровых жителей Забайкалья. Группы были сопоставимы по полу и возрасту. Все обследованные были русские; родились и проживали на территории Забайкальского края. В работе соблюдались этические принципы, подписываемые Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Médical Association Déclaration of Helsinki (1964, 2000 — поправки) и Правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266.
Определение полиморфизма генов ИЛ2 (T330G), ИЛ10 (С819Т) и ИЛ10 (G1082A) осуществлялось методом ПЦР с использованием праймеров ООО «Литех» (Москва). Проводили анализ геномной ДНК, выделенной из лейкоцитов цельной крови с помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь», затем — реакцию амплификации с 2 парами аллельспецифических праймеров. Электрофорез осуществляли в агарозном геле.
Исследованный контингент проверяли на соответствие закону Харди—Вайнберга.
Статистическую обработку данных проводили с помощью электронных программ Microsoft Excel 2007, STATISTICA 6,0
42
№3, 2013 Молекулярная медицина
(StatSoft Inc., США), с определением достоверности различий при p<0,05. Для сравнения частот применялся критерий х2 (Пирсона).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что в контрольной группе гомозиготный вариант ТТ-полиморфизма ИЛ2 (T330G) выявлялся лишь у 3%, GG — 3% обследованных, но превалировал (94%) гетерозиготный тип TG (табл. 1). У жителей Забайкалья, заболевших ХВГС, превалировал гомозиготный вариант ТТ — 34%. Среди больных ХВГС частота аллели G гена ИЛ2 (T330G) составила 0,52, тогда как среди здоровых — 0,04 (р<0,001), аллель T — соответственно 0,48 и 0,96 (p<0,001; табл. 2). Обнаружено, что у пациентов с ЦП частота аллели Т гена ИЛ2 (T330G) была несколько выше, чем в группе с ХВГ С без признаков ЦП, и составила 0,71, а аллели G — ниже (0,29).
При этом в группе больных с ЦП в исходе ХВГС частота ТТ-полиморфизма гена ИЛ2 (T330G) оказалась выше почти в 1,5 раза, чем в группе больных с ХВГС во II-III стадии фибротических изменений, и почти в 15 раз по сравнению с группой контроля (р<0,05; см. табл. 1).
У больных ХВГС преобладали гомозиготные варианты СС гена ИЛ10 (С819Т) - 60% и AA ИЛ10 (G1082A) - 62% (см. табл.1). У больных ХВГС с переходом процесса в ЦП частота аллели Т полиморфизма гена ИЛ10 (C819T) составила 0,30 и 0,34, что существенно выше, чем в контрольной группе — 0,02 (р<0,001). При этом встречаемость аллели С у пациентов оказалась ниже (0,70 и 0,66), чем у здоровых (0,98) (р<0,001; см. табл. 2).
Среди пациентов с ХВГС аллель А полиморфизма гена ИЛ10 (G1082A) встречалась с частотой 0,63, а при исходе болезни в ЦП — 0,25, тогда как у здоровых — 0,08 (р<0,001). Напротив, частота аллели G у больных ХВГС находилась на уровне 0,37 и повышалась в группе с ЦП до 0,75, в контроле — 0,92 (p<0,001; см. табл. 2).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что у пациентов с ХВГС и переходом патологического процесса в ЦП частота встречаемости аллельных вариантов полиморфизма генов медиаторов иммунного ответа — ИЛ2 (T330G), ИЛ10 (С819Т) и ИЛ10 (G1082A) существенно отличается от таковой у здоровых.
Известно, что различные полиморфные варианты генов цитокинов могут сказываться на их продукции. Это в свою очередь влияет на направленность иммунного ответа, своевременность и эффективность межклеточной сигнализации [5]. Полиморфизм генов цитокинов является существенным фактором предрасположенности/резистентности к инфицированию [7], развитию заболевания и длительному его течению с осложнениями. Большую роль в этом играют не только отдельные аллели ге-
нов, но и их сочетание [7]. Например, аллель А в G308А гена фактора некроза опухоли а (ФНОа) и аллель Т и С589Т ИЛ4 ответственны за повышенную транскрипцию, в результате чего повышается продукция ФНОа и ИЛ4. Значительное повышение концентрации данных цитокинов способствует быстрому прогрессированию гепатита С и более тяжелому его течению. При этом аллель А полиморфизма гена ИЛ10 С592А и аллель А полиморфизма гена ИЛ10 G1082А способствуют пониженной продукции ИЛ 10. Известно, что ИЛ 10 — это провос-палительный цитокин, оказывающий тормозящее действие на Т-хелперы 1-го клона, снижая, таким образом, синтез провоспалительных цитокинов [12]. В случае низкого уровня ИЛ10 поддерживает-
Таблица 2
ОТНОСИТЕЛЬНАЯ И АБСОЛЮТНАЯ ЧАСТОТА ГЕНОТИПОВ ИЛ2 (I330G), ИЛ10 (С819Т) И ИЛ10 (G1082A)
Генотип Здоровые (n=100) ХВГС (n=32) ЦП (n=40)
T330G ИЛ2
Аллель Т 0,96 0,48 0,71
Аллель G 0,04 0,52 0,29
Генотип T/T р2 (Р2 ■ N) 0,92 0,07 0,02
Генотип T/G 2 ■ pg(2 ■ pg ■ N) 0,07 0,16 0,17
Генотип G/G g2 (g2 ■ N) 0,01 0,09 0,03
С819Т ИЛ10
Аллель C 0.98 0,7 0,66
Аллель Т 0,02 0,3 0,34
Генотип C/C P2 (P2 ■ N) 0,96 0,17 0,16
Генотип C/T 2 ■ pg(2 ■ pg ■ N) 0,03 0,13 0,1
Генотип T/T g2 (g2 ■ N) 0,01 0,03 0,05
G1082A ИЛ10
Аллель G 0,92 0,37 0,75
Аллель A 0,08 0,63 0,25
Генотип G/G P2 (P2 ■ N) 0,85 0,04 0,23
Генотип G/A 2 ■ pg(2 ■ pg ■ N) 0,14 0,15 0,15
Генотип A/A g2 (g2 ■ N) 0,01 0,13 0,03
Примечание. р2 (р2 • N — относительная частота генотипа; р2 • N 2 • pg • N g2 • N — абсолютная частота генотипа ^ — общее число наблюдений).
ся высокая концентрация провоспалительных ци-токинов, что также проводит к неблагоприятному течению заболевания. Так, ранее было показано, что наличие аллели А в С592А и О1082А гена ИЛ10 у больных коклюшем способствует пониженной продукции ИЛ10 и развитию осложнений заболевания [6]. У детей с Т/Т-вариантом участка С589Т гена ИЛ4 продукция ИЛ4, ^М и ^А более высокая, чем у носителей нормальных гомозигот и гетерозигот. Для обладателей полиморфных маркеров в участке О1082А ИЛ 10 при неосложненном течении также характерна гиперпродукция противовоспалительных цитокинов. Носители А/А-варианта С592А гена ИЛ10 отличаются гипопродукцией ИЛ10, ИЛ4, ^М. Наличие полиморфных маркеров в участке О1082А гена ИЛ10 ассоциировано со сниженным образованием лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов, а следовательно, и с миграцией иммунокомпетент-ных клеток в очаг повреждения [6].
Полученные результаты являются подтверждением роли ИЛ2 и ИЛ10 в патогенезе поражения печени при хронической НСУ-инфекции. Установлена связь наличия аллеля О полиморфного варианта 330Т/О ИЛ2, аллеля Т 819С/Т ИЛ10, аллеля А 1082О/А ИЛ 10 с выраженностью прогрессирова-ния фиброза и поражения печени при хронической НСУ- инфекции.
ВЫВОДЫ
У больных с ХВГС в разных стадиях фибротиче-ских изменений частота встречаемости аллельных вариантов полиморфизма генов ИЛ2 (Т330О), ИЛ10 (С819Т) и ИЛ10 (О1082А) существенно отличается от таковой у здоровых.
У больных ХВГС в разных стадиях фибротических изменений чаще встречается аллель О полиморфизма генов ИЛ2 (Т3306), аллель Тгена ИЛ10 (С819Т), аллель А гена ИЛ10 (ОЮ82А).
ЛИТЕРАТУРА
1. Абдуллаев С.М., Целищева Ю.И., Само-ходская Л.М. и др. Генетические факторы агрессивного течения хронического гепатита С // Вестн. РАМН. - 2007; 1: 8-13.
2. Виноградова С.В. Роль полиморфизма генов цитокинов в развитии заболеваний печени // Сучасна гастроентеролопя. -2004; 5 (19): 23-7.
3. Гастроэнтерология. Клинические рекомендации. - М., ГЭОТАР-Медиа, 2009.
4. Горяйнов С.В., Зорин Н.А. На сегодня нет доказательства преимущества в эффективности одного из пегилированных интерферонов-а (2а и 2b) в комбинации с рибавирином в лечении хронического гепатита С (критическая публикация о современной противовирусной терапии хронического вирусного гепатита С с точки зрения доказательной медицины) // Гепатологический форум. - 2010; 2: 2-10.
5. Доржиева Н.Э., Витковский Ю.А., Суда-кова Л.Р. и др. Полиморфизм гена ИЛ10 (C819T) у больных с воспалительными заболеваниями пародонта в Забайкальском крае // Забайкальский мед. вестн. (электронный ресурс). - 2011; 1: 44-48.
- Режим доступа: http://medacadem, chita.ru/zmv (10 июня 2011).
6. Епифанцева Н.В., Витковский Ю.А. Взаи-
мосвязь лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии с цитокинами у детей при коклюшной инфекции [Электронный ресурс] // Забайкальский мед. вестн. -2011; 2: 98-103. - Режим доступа: http:// medacadem.chita.ru/zmv.
7. Зима А.П. Система цитокинов и их рецепторов при хронических вирусных инфекциях: молекулярные механизмы дизрегуляции. Автореф. дисс... докт. мед. наук. - 2008. - 43 с.
8. Ивашкин В.Т., Буеверов А.О, Грязин А.Е. Механизмы устойчивости вируса гепатита С к противовирусным препаратам // Мол. медицина. - 2004; 2: 18-23.
9. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цито-кины/СПб.: Фолиант, 2008; 550
10. Коротчаева Ю.В., Самоходская Л.М., Сперанский А.И. и др. Прогностическое значение определения ИЛ6 в сыворотке крови и цитохрома Р450 в ткани печени у больных хроническим вирусным гепатитом С//2008; 18 (2): 42-7.
11. Новицкий В.В., Стрелис А.К., Уразова О.И. и др. Полиморфизм генов ИЛ2 и ИЛ4 при инфильтративном туберкулезе легких // Иммунология. - 2009; 2: 88-92.
12. Кузник Б.И., Цыбиков Н.Н., Витковский Ю.А. Единая клеточно-гуморальная система защиты организма // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2005; 2 (22): 3-14.
13. Рязанцева, Новицкий В.В., Белоконь В.В. и др. Цитокины и противовирусный иммунитет // Успехи физиол. наук. - 2006; 37 (4): 1-11.
14. Семенова Н.А., Рязанцева Н.В. Новицкий В.В. Бычков и др. Роль полиморфизма гена ИЛ6 - 174C/G в развитии хронической HCV-инфекции // Бюллетень сибирской медицины. - 2010; 5: 93-7.
15. Серов В.В. От целлюлярной патологии Вирхова до молекулярной патологии сегодняшнего дня // Арх. патологии. -2001; 1: 3-5.
16. Фрейдин М.Б., Гончарова И.А., Рудко А.А. и др. Геномные основы подверженности инфекционным заболеваниям // Мол. медицина. - 2006; 3: 39-46.
17. Robert A., Levine, Schuler O., Sanderson. Оценка прогрессирования фиброза на фоне нелеченного хронического гепатита С у жительниц Ирландии, заразившихся в результате использования антипода) - иммуноглобулина // Клин. гастроэнтерол. и гепатол. Русское издание. - 2008; 1 (1): 24-31.
18. Bantel H., Schulce K., Cell Deth. Oshoff // Differ. - 2003; 10: 548-60.
19. Bedossa P., Poynard T. An algorithm for the grading of activity in chronic hepatitis C. The METAVIR Cooperative Study Group // Hepatology. - 1996; 24: 289-93.
44
№3, 20!3 Молекулярная медицина
