CC BY
63
Вестник Челябинского государственного университета. 2015. № 21 (376). Биология. Вып. 3. С. 23-27.
УДК 575:616.3
ББК 28.04-28.074-54.133 (235.55)
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА 1Ь-10 У БОЛЬНЫХ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИМ ЯЗВЕННЫМ КОЛИТОМ И СИНДРОМОМ РАЗДРАЖЁННОГО КИШЕЧНИКА РУССКОЙ ПОПУЛЯЦИИ ЧЕЛЯБИНСКОЙ ОБЛАСТИ
Д. С. Сташкевич1, А. Г. Василенко2, Е. Л. Иванова
ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет», Челябинск, Россия 2ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница», Челябинск, Россия 3ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет», Челябинск, Россия
Представлены данные по изучению ассоциации полиморфизма гена ^-10 с синдромом раздражённого кишечника и неспецифическим язвенным колитом. Установлены следующие особенности больных СРК: в группе женщин, больных СРК, снижена частота гетерозиготного генотипа С/Т-819 и и повышена частота гомозиготного генотипа С/С. Выявлена комбинация генотипов ^-10 С/С-819-С/А-592, носительство которой повышает вероятность развития СРК. Показано, что полиморфизм промоторной области в гене ^-10 вносит больший вклад в формирование предрасположенности к синдрому раздражённого кишечника, чем к неспецифическому язвенному колиту в популяции русских Челябинской области.
Ключевые слова: синдром раздражённого кишечника, неспецифический язвенный колит, одно-нуклеотидный полиморфизм, интерлейкин 10.
Введение. Интерлейкин-10 (1Ь-10) является ключевым регулятором иммунного ответа. Ген ^-10 локализован на первой хромосоме в участке Ц31-32 [3], содержащем 5 экзонов. Наиболее изученными являются биаллельные замены (SNP) в позициях от сайта транскрипции -1082, -819, -592 и 2 микросателлитных полиморфизма, влияющие на транскрипционную активность гена. Обнаружена корреляция точечных замен, лежащих в промоторном регионе гена 1Ь-10 в позициях -1082 и -592, с уменьшением продукции цитокина, поскольку они лежат внутри ETS-подобного сайта узнавания [1], а в позиции -819 — с увеличением продукции цитокина ^-10 [4]. Существующие на сегодня данные позволяют предположить, что полиморфные гены цитоки-нов, в том числе 1Ь-10, способны принимать активное участие в формировании специфического иммунного ответа на патологические состояния человека. При этом отдельные аллельные варианты могут быть ассоциированы с уровнем продукции соответствующего белкового продукта, что тоже оказывает влияние на характер течения, возникновение определённых осложнений заболеваний. К цитокин-опосредованным заболеваниям относят неспецифический язвенный колит и синдром раздражённого кишечника.
В ряде иностранных исследований показана ассоциация полиморфизма промоторной области
гена IL-10 с синдромом раздражённого кишечника (СРК). Носительство частого гомозиготного и гетерозиготного генотипов SNP-1082 снижает вероятность развития СРК. Частота мутантного аллеля -1082*А и его гетерозиготного генотипа повышены у больных СРК, а носительство часто -го генотипа -592 СС повышает вероятность возникновения СРК у европеоидов [5].
Согласно литературным данным при неспецифическом язвенном колите (НЯК) в поражённой слизистой оболочке с активным воспалением толстой кишки повышены уровни IL-10 и его мРНК и установлено наличие ассоциации полиморфизма сайта -819 с предрасположенностью к НЯК [6].
Цель исследования: оценить распределение частот встречаемости аллелей, генотипов, комбинаций генотипов SNPs -1082 G/A, -819 C/T, -592 C/A IL-10 у больных НЯК и СРК русской популяции Челябинской области.
Задачи:
1. Установить частоты встречаемости аллелей, генотипов IL-10 в группе больных НЯК в сравнении с условно здоровыми лицами русской популяции.
2. Определить гендерные различия в частотах встречаемости аллелей, генотипов IL-10 в группе больных НЯК и СРК в сравнении с условно здоровыми лицами русской популяции.
3. Оценить распределение частот сочетаний генотипов SNPs IL-10 у больных НЯК, СРК в сравнении с контрольной группой.
Материалы и методы. Проведённая работа относится к типу ретроспективных исследований «случай-контроль».
Контингент обследуемых лиц. В качестве контрольной группы (118 чел.) использовали популяци-онную выборку, сформированную случайным образом на основе ДНК-банка потенциальных доноров стволовой клетки Челябинской областной станции переливания крови, проживающих в Челябинске и Челябинской области. Популяционная принадлежность определялась по данным генеалогического анамнеза до третьего поколения (согласно рекомендациям VIII Международного симпозиума, Лос-Анджелес, США, 1980).
Выборка больных СРК состояла из 81 чел. русской этнической группы, с диагнозом СРК, которые находились на лечении в гастроэнтерологическом отделении Дорожной клинической больницы МПС на станции Челябинск в период с 2001 по 2007 г. (таблица). Для диагностики заболевания использовались Римские критерии III (2007) [2].
Группа больных НЯК состояла из 115 человек русской этнической группы, которые находились на лечении в гастроэнтерологических отделениях Дорожной клинической больницы МПС на станции Челябинск и Челябинской областной клинической больницы.
Методы исследования. В качестве биологического материала для исследования использовалась венозная кровь, взятая в пробирки с 0,5 %-м раствором калиевой соли этилендиаминтетраук-сусной кислоты (ЭДТА). Выделение ДНК проводили с использованием реагентов Protrans DNA Box 500. Определение SNPs в полиморфных сайтах -1082G/A, -819С/Т и -592С/А гена IL-10 проводилось аллель-специфической ПЦР с реактивами ООО НПФ «Литех» (Москва, Россия) с после -дующей УФ-детекцией результатов в 3 %-м ага-розном геле.
Статистическая обработка. Критериями для анализа служили:
1) частота аллельного варианта. Абсолютное число аллеля (А) вычисляется по формуле АА*2 + АВ + АС. Частота аллеля — доля от общего числа обследованных лиц в выборке, умноженного на два, %;
2) частота генотипа — доля от общего числа обследованных лиц в выборке, %;
3) сочетания генотипов — доля носителей определённых генотипов двух генов от общего числа обследованных лиц, %.
Для расчёта достоверности различий по частоте встречаемости аллельных вариантов, генотипов, сочетаний генотипов между исследуемыми группами использовали критерий Пирсона (%2), точный двусторонний критерий Фишера. Статистическую обработку результатов исследований проводили с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0 для Windows, в котором использовали модули: «непараметрические критерии» (критерий Пирсона, критерий Пирсона с поправкой Йетса, точный двухсторонний критерий Фишера). Во всех случаях различия считали статистически значимыми при р < 0,05, незначимыми при р > 0,10; для промежуточных значенийр (0,05 <р < 0,10) обсуждали тенденцию к различиям.
Результаты и обсуждение. В ходе проведённого исследования получены следующие результаты. Распределение частот аллелей и генотипов SNPs IL-10 у больных синдромом раздражённого кишечника было описано нами ранее [2]. В продолжение исследования были установлены частоты встречаемости аллелей, генотипов и комбинаций генотипов SNPs -1082 G/A, -819 C/T, -592 C/Ау больных НЯК, гендерные особенности больных СРК и НЯК.
Группа больных НЯК отличалась сниженной частотой гомозиготного генотипа -592 А/А по сравнению с контрольной группой (0,9 % против 5,4 %, р = 0,08). Частоты аллельных вариантов и генотипов -1082G/A, -819С/Т и C/C,
Демографическая характеристика обследуемых групп
Обследуемые Группа сравнения Больные СРК Больные НЯК
118 % 81 % 115 %
Мужчины 66 56,0 23 28,4 49 43,0
Женщины 52 44,0 58 71,6 66 58,0
Средний возраст, лет 34,6±0,75 41,9±1,3 43,4±1,6
С/А -592 не различались между группой больных НЯК и контролем.
При определении гендерных особенностей в распределении аллелей и генотипов SNPs ^-10 у больных НЯК и СРК и контрольной группы установлены следующие изменения. В группе женщин, больных СРК, снижена частота гетерозиготного генотипа С/Т -819 (29,3 % против 45,5 %, х2 = 3,42, р = 0,065) и повышена частота гомозиготного генотипа С/С -819 (29,3 % против 45,5 %, х2 = 3,42, р = 0,065). Не установлено различий в частотах встречаемости аллелей и генотипов ^-10 в зависимости от пола больных НЯК.
Установлена маркерная комбинация генотипов С/С-819-С/А-592, носители которой чаще обнаруживались среди больных СРК по сравнению с контрольной выборкой и группой больных НЯК (17,7 % в СРК против 3,4 % в контроле, 0,89 % у НЯК, р << 0,0001). Вероятно, данную комбинацию генотипов 1Ь-10 можно рассматривать не только как предрасполагающую к развитию синдрома раздражённого кишечника, но и в качестве критерия дифференциальной диагностики СРК от НЯК.
Таким образом, в данной работе установлено, что полиморфизм промоторной области в гене 1Ь-10 вносит больший вклад в формирование предрасположенности к синдрому раздражённого кишечника, чем к неспецифическому язвенному колиту в популяциях европеоидного происхождения.
Данные по влиянию исследуемых полиморфных сайтов ^-10 на предрасположенность к муль-тифакторным заболеваниям, в том числе к воспалительным заболеваниям кишечника, противоречивы. Вероятно, этот факт можно объяснить межэтническими различиями в распределении аллелей, генотипов и гаплотипов, образованных полиморфными сайтами внутри гена ^-10.
В нашем исследовании обнаружено изменение частот генотипов полиморфного сайта -592 ^-10 в группе больных НЯК, а ассоциации с другими SNPs не было выявлено.
Известно, что исследуемые сайты 1Ь-10 находятся в неравновесном сцеплении, поэтому в продолжение исследования можно рассмотреть формирование гаплотипов у больных СРК и НЯК.
Наше исследование вносит вклад в развитие представлений об иммуногенетической компоненте неспецифического язвенного колита и синдрома раздражённого кишечника, а также их дифференциальной диагностике.
Выводы:
1. Установлены частоты встречаемости аллелей и генотипов SNPs ^-10 у больных НЯК в сравнении с выборками больных СРК и контролем.
2. Показаны отличия в частотах встречаемости генотипов SNP -819 у женщин, больных СРК.
3. Выявлена комбинация генотипов ^-10 С/С-819-С/А-592, носительство которой повышает ве -роятность развития СРК.
Список литературы
1. Коненков, В. И. Структурные основы и функциональная значимость аллельного полиморфизма генов цитокинов человека и их рецепторов / В. И. Коненков, М. В. Смольникова // Мед. иммунология. -2003. - Т. 5, № 1-2. - С. 11-28.
2. Сташкевич, Д. С. Ассоциация полиморфизма промоторной области гена IL-10 с предрасположенностью к синдрому раздражённого кишечника у русских Челябинской области / Д. С. Сташкевич, А. Л. Бурмистрова, Е. Л. Иванова, С. В. Тимофеева, А. В. Сорокин, Ю. Ю. Шамурова // Вестн. Урал. мед. акад. науки. - 2012. - № 4 (41). - С. 245-246.
3. Cardona-Castro, N. IL-10 gene promoter polymorphisms and leprosy in a Colombian population sample [Электронный ресурс] / N. Cardona-Castro, M. Sánchez-Jiménez, W. Rojas [et al.] // Biomedica. -2012. - Vol. 32, iss. 1. - P. 71-76. - URL: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0120-41572012000100009&lng=en&nrm=iso&tlng=en
4. Hyun, M. H. Interleukin-10 Promoter Gene Polymorphisms and Susceptibility to Asthma: a Meta-Analysis / M. H. Hyun, C. H. Lee, M. H. Kang [et al.] // PLoS One. - 2013. - Vol. 8, iss. 1. - P. 1-8.
5. Romero-Valdovinos, M. Interleukin-8 and -10 gene polymorphisms in irritable bowel syndrome / M. Rome-ro-Valdovinos, A. Gudiño-Ramírez, J. Reyes-Gordillo // Molecular biology reports. - 2012. - Vol. 39 (9). -P. 8837-8843.
6. Tedde, A. Interleukin-10 promoter polymorphisms influence susceptibility to ulcerative colitis in a gender-specific manner [Электронный ресурс] / A. Tedde, L. A. Putignano, S. Bagnoli, C. Congregati, M. Milla, S. Sorbi, M. Genuardi, L. Papi // Scandinavian Journal of Gastroenterology. - 2008. - Vol. 43 (6). - P. 712-718. -Doi: 10.1080/00365520701885507
Сведения об авторах
Сташкевич Дарья Сергеевна — кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии, иммунологии и общей биологии Челябинского государственного университета, Челябинск, Россия. stashkevich_dary@ mail.ru
Василенко Александр Георгиевич — заведующий гастроэнтерологическим отделением Челябинской областной клинической больницы, Челябинск, Россия. stashkevich_dary@mail.ru
Иванова Екатерина Леонидовна — ассистент кафедры поликлинической терапии и клинической фармакологии Южно-Уральского государственного медицинского университета, Челябинск, Россия. kate-future@mail.ru
Bulletin of Chelyabinsk State University. 2015. No. 21 (376). Biology. Issue 3. Pp. 23-27.
THE GENE POLYMORPHISM OF IL-10 IN PATIENTS WITH ULCERATIVE COLITIS AND IRRITABLE BOWEL SYNDROME IN RUSSIAN POPULATION OF CHELYABINSK REGION
D. S. Stashkevich
Chelyabinsk State University, Chelyabinsk, Russia. stashkevich_dary@mail.ru
A. G. Vasilenko
Chelyabinsk Regional Clinical Hospital, Chelyabinsk, Russia. stashkevich_dary@mail.ru
E. L. Ivanova
South Ural State Medical University, Chelyabinsk, Russia. kate-future@mail.ru
Objective: the evaluation of the distribution of frequencies of alleles, genotypes, combinations of genotypes of SNPs -1082 G/A, -819 C/T, -592 C / A IL-10 in patients with ulcerative colitis and irritable bowel syndrome in Russian population of the Chelyabinsk region is performed in this article. Materials and methods. The study included 81 patients with IBS, 115 patients with ulcerative colitis and 118 apparently healthy individuals. The genotyping of promoter polymorphism IL-10 was performed by allele-specific polymerase chain reaction. The Pearson's criterion and the exact two-tailed Fisher's criterion were used as statistical analysis. Results. The following features of IBS patients are established: in a group of female patients with IBS the frequency of heterozygous genotype C/T and -819 was decreased and frequency of homozygous genotype C/C was increased. The combination of genotypes of IL-10/S-819-C/A-592 was identified. The carriage rate of its increases the likelihood of IBS. Conclusion. In this study we revealed that a polymorphism in the promoter region of the gene IL-10 contributes more to a predisposition to irritable bowel syndrome, than to ulcerative colitis In Russian population Chelyabinsk region.
Keywords: irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, single nucleotide polymorphism, interleukin 10.
References
1. Konenkov V.I., Smol'nikova M.V. Strukturnye osnovy i funkcional'naya znachimost' allel'nogo polimor-fizma genov tsitokinov cheloveka i ikh receptorov [The structural basis and functional significance of allelic polymorphism of cytokine genes and their receptors of human]. Medicinskaya immunologiya [Medical immunology], 2003, vol. 5, no. 1-2, pp. 11-28. (In Russ.).
2. Stashkevich D.S., Burmistrova A.L., Ivanova E.L., Timofeeva S.V., Sorokin A.V., Shamurova Yu.Yu. As-sociaciya polimorfizma promotornoy oblasti gena IL-10 s predraspolozhennost'yu k sindromu razdrazhennogo kishechnika u russkikh Chelyabinskoy oblasti [The Association of polymorphism of the promoter region of the gene of IL-10 with a predisposition to irritable bowel syndrome Russian Chelyabinsk region]. Vestnik Ural'skoy medicinskoy akademicheskoy nauki [Bulletin of the Ural Medical Academic Science], 2012, no. 4 (41), pp. 245246. (In Russ.).
3. Cardona-Castro N., Sánchez-Jiménez M., Rojas W. IL-10 gene promoter polymorphisms and leprosy in a Colombian population sample. Biomedica, 2012, vol. 32, pp. 71-76. Available at: http://www.scielo.org.co/scielo. php?script=sci_arttext&pid=S0120-41572012000100009&lng=en&nrm=iso&tlng=en, accessed 17.10.2015.
4. Hyun M.H., Lee C.H., Kang M.H. Interleukin-10 Promoter Gene Polymorphisms and Susceptibility to Asthma: a Meta-Analysis. PLoS One, 2013, vol. 8, iss. 1, pp. 1-8.
5. Romero-Valdovinos M., Gudino-Ramirez A., Reyes-Gordillo J. Interleukin-8 and -10 gene polymorphisms in irritable bowel syndrome. Molecular Biology Reports, 2012, vol. 39, iss. 9, pp. 8837-8843.
6. Tedde A., Putignano L.A., Bagnoli S., Congregati C., Milla M., Sorbi S., Genuardi, L. M. Papilnterleu-kin-10 promoter polymorphisms influence susceptibility to ulcerative colitis in a gender-specific manner. Scandinavian Journal of Gastroenterology, 2008, vol. 43, iss. 6, pp. 712-718. Doi: 10.1080/00365520701885507
