CC BY
14ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, 1994, том 36, №11, с. 1862 - 1875
УДК 541.64:531.79
ПОЛИМЕРНЫЕ СИСТЕМЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ И БИОСЕНСОРЫ НА ИХ ОСНОВЕ (Обзор)
© 1994 г. Н. А. Платэ, В. В. Чупов
Институт нефтехимического синтеза им. A.B. Топчиева Российской академии наук
117912 Москва, Ленинский пр., 29 Поступила в редакцию 15.04.94 г.
Рассмотрены особенности синтеза и свойств соиммобилизованных систем синтетические полимеры-клетки микроорганизмов с точки зрения влияния ковалентной иммобилизации клеток на их функциональную активность и способность к репродуцированию, а также влияния клеток на структурные и физико-химические свойства наполненных полимеров, формируемых в присутствии ин-тактных или химически модифицированных фотобактерий при их связывании. Показано, что низкомолекулярные ненасыщенные модификаторы клеток в определенных условиях полностью инактивируют внутриклеточную активность микроорганизмов, в то время как полимерные реакци-онноспособные носители взаимодействуют с клетками, не затрагивая их внутриклеточных элементов. Предложены способы создания биосенсоров на основе иммобилизованных фотобактерий для качественного и количественного определения микропримесей в водных средах.
При рассмотрении вопросов использования синтетических полимеров для получения иммобилизованных клеток прежде всего следует иметь в виду, что несмотря на многообразие методов иммобилизации клеток и широкий круг используемых полимерных носителей, основные исследования выполнены на клетках микроорганизмов, иммобилизованных химическим включением их в полимерные гели, тогда как для промышленных процессов как правило используют клетки, фиксированные на носителях ионно или сорбционно [1 - 8].
Методы ковалентного связывания клеток с носителями развиты слабее, чем сорбционные. При этом в большинстве опубликованных работ четко прослеживается мысль о необходимости подробного изучения особенностей физиологического и морфологического поведения клеток при иммобилизации [9-11].
В этом связи представляет интерес изучение особенностей процессов ковалентной иммобилизации клеток на поверхности синтетических полимеров и в объеме полимерных гидрогелевых матриц, а также исследование структуры и свойств таких систем с точки зрения их функциональной активности. Настоящий обзор посвящен именно этому вопросу и включает результаты, полученные авторами и их сотрудниками в последние 5 - 10 лет.
В качестве модельных клеток с легко отслеживаемой функциональной активностью можно выбрать клетки морских люминесцентных бактерий РЬоюЬа^егшт НвсИеп (ФБ) и различ-
ные расы дрожжевых клеток ЗассЬаготусев Сеге-у1в1а (ДК).
ФБ являются прокариотами (безъядерными клетками) как многие типичные бактерии. Цитоплазма их окружена цитоплазматической мембраной и клеточной стенкой, основным структурным элементом которой является муреино-вый каркас (муреин - сшитый гетерополимер, пептидогликан, сочетающий в себе набор полипептидных и полисахаридных фрагментов неизученного строения), на котором располагаются белки, полисахариды, липиды, белково-липид-ные комплексы и тейхоевые кислоты [12]. Помимо этого в ФБ функционирует специфический фермент люцифераза - сложная надмолекулярная система, тесно ассоциированная с мембраной, причем местом преимущественной локализации этого фермента является периплазмати-ческое пространство. ФБ обладают высоким уровнем биолюминесценции, легко регистрируемым без вмешательства в жизнедеятельность данного вида клеток. Максимум спектра люминесценции ФБ локализован в области 490 - 500 нм, протяженность спектра составляет 430 - 615 мкм, интенсивность свечения штамма б ФБ составляет 1200 - 31000 квант/с на 1 клетку в широком интервале температур.
Среди так называемых темновых и тусклых мутантов ФБ (интенсивность свечения составляет Ю-2 - 10~5 от интенсивности свечения клеток "дикого" типа) выделены мутанты, свечение которых стимулируется добавлением к их суспензии алифатических альдегидов (альдегид-
1862
зависимые мутанты) РЬсЛоЬас1егшт Р1зсЬеп, штамм 148 [13].
Для ковалентиой иммобилизации указанных микроорганизмов в матрицах полимерных гидрогелей был выбран разработанный нами
ранее подход [14-16], заключающийся во введении реакционноспособных двойных связей С=С в иммобилизуемую субстанцию и в последующей сополимеризации полученного ненасыщенного производного с гидрофильным сомономером и сшивающим агентом по схеме
Ненасыщенное производное иммобилизуемого соединения
1ЧН2 + С1-С-СН=СН2 О
Ы-С-СН=СН2 II
Гидро- Сшивающий фильный агент мономер
Сшитый сополимер с ковалентно иммобилизованным соединением,гель
Синтез ненасыщенных производных микроорганизмов (НМ) осуществляли реакцией аци-лирования ФБ и ДК акрилоил- или метакрило-илхлоридами (АХ или МХ). Поскольку никакой информации о взаимодействии клеток с этими модификаторами в литературе нет, целесообразно рассмотреть особенности реакции взаимодействия ненасыщенных модификаторов с ФБ и ДК.
Наличие молекул белков в клеточных стенках и во внутриклеточном пространстве позволяло надеяться, что взаимодействие указанных модификаторов будет протекать в первую очередь по свободным аминогруппам этих биополимеров, как это имеет место в случае нейтральных белков, ферментов, их ингибиторов и других веществ [14 - 16]. Действительно, массовое соотношение между общим внутриклеточным и мембранным белком в клетках обычно смещено в сторону первого [17]. При взаимодействии АХ или МХ с суспензией клеток в условиях диффузионной прозрачности мембраны в первую очередь ацилиро-ванию должны подвергаться внутриклеточные компоненты.
Для оценки механизма взаимодействия микроорганизмов с ненасыщенными модификаторами в качестве модельного соединения можно использовать ацетилхлорид (АЦХ). При этом применение радиоактивных индикаторов делает возможным изучить распределение "активатора" в клетке. С этой целью из 14С-уксусной кислоты, меченой по концевому атому С, был синтезирован ,4С-ацетилхлорид с удельной активностью 81.4 МБк/мл (2.2 М Ки/мл), с помощью которого
осуществляли модификацию предварительно отмытых от питательной среды ФБ [18].
Для изучения распределения продуктов аци-лирования в ФБ суспензию интактных клеток подвергали обработке различными количествами 14С-меченого АЦХ с последующим разрушением модифицированных клеток осмотическим шоком или ультразвуком и измерением радиоак-
Таблица 1. Результаты радиохимического изучения модификации интактных и предварительно разрушенных ФБ 14С-меченым ацетилхлоридом
Среднее число меченых групп на 1 клетку Радиоактивность, % (±0.5%) Отношение радио-активностей Способ разрушения клеток*
в мембранной фракции в бесклеточном экстракте
Интактные клетки
9490 72.7 27.3 2.66 1 УЗ
18800 62.8 37.2 1.68 1 УЗ
189000 81.8 18.2 4.50 1 ОШ
203000 71.4 28.6 2.49 1 УЗ
760000 77.9 22.1 3.52 1 ОШ
2350000 63.5 36.6 1.74 1 УЗ
Разрушенные клетки
367000 20.3 79.7 1:3.92 ОШ
1030000 31.0 69.0 1 :2.22 УЗ
5110000 30.0 70.0 1:2.33 ОШ
* УЗ - ультразвук, ОШ - осмотический шок.
Время, сут Время, сут
Рис. 1. Зависимость радиоактивности ПААГ от времени его щюмывания "голодной" (а) и "богатой" (б) питательной средой. Гели получены инкубированием 8.3 х 1(г меченых 1251 и обработанных АХ (/) или АЦХ (2) ФБ с акриламидом и БИС в присутствии системы ПС/ТМЕДА.
тивности мембранной фракции и внутриклеточного экстракта. Из приведенных в табл. 1 данных видно, что независимо от количества АЦХ и способа разрушения клеток, распределение радиоактивности в мембранной фракции и бесклеточном экстракте практически постоянно и составляет в среднем 2.8 : 1, причем основная доля радиоактивности (63 - 82%) приходится на мембранную фракцию (несмотря на пониженное содержание в ней белкового компонента), а ее меньшая часть (18-37%) оказывается во внутриклеточном экстракте. При этом радиоактивность общего белка, выделенного из мембранной фракции, составляет 90-95% от общей активности мембранной фракции.
Наблюдаемый эффект распределения радиоактивности обусловлен, по-видимому, двумя обстоятельствами. Первое заключается в том, что мембраны ФБ кроме белков содержат и другие легко ацилируемые по свободным аминогруппам компоненты, например аминосодержащие полисахариды, количество которых в мембранах грамотрицательных бактерий может быть значительным [19]. Вторым обстоятельством являются диффузионные ограничения для проникновения молекул ацилирующих агентов сквозь мембраны клеток. Действительно, при обработке АЦХ предварительно разрушенных ФБ максимум радиоактивности приходится на бесклеточный экстракт, причем соотношение радиоактивности во внутриклеточной и мембранной фракциях (1: 2.3 -1:3.9) пропорционально соотношению белковых компонентов в тех же фракциях (1:5-10). Отсюда следует, что при взаимодействии интактных клеток с АЦХ (равно как и с АХ) наиболее эффективно реагируют аминосодержащие компоненты мембраны (и в первую очередь белки по свободным аминогруппам), а сама мембрана препятствует
проникновению ацилирующего агента внутрь клетки, хотя и не исключает его целиком. В этом случае локализация модифицирующих групп на поверхности клетки максимальна.
Использованный способ модификации позволяет ввести максимально 2.35 х 10е меченых групп на 1 клетку, что составляет 1 - 2% от всего количества АЦХ, взятого в реакцию. При этом в среднем одна ацильная группа приходится на 185 А2 поверхности клетки, если исходить из того, что площадь всей поверхности ФБ аппроксимируется цилиндром вращения с диаметром 0.5 и высотой 1.5 мкм и равняется 270 мкм2.
Для выяснения возможности модифицированных ФБ участвовать в процессах радикальной со-полимеризации, предварительно меченые 1251 клетки обрабатывали АХ из расчета 105 - 106 моль на 1 клетку, отмывали буферным раствором и инкубировали с инициирующей системой персульфат аммония - М,М,№,М'-тетраметилэтилендиа-мин (ПС/ТМЭДА). При этом было установлено, что инкубирование обработанных ацетилхлори-дом ФБ в течение 2 - 3 ч не приводит к изменению оптической плотности суспензии, т.е. образования укрупненных форм ФБ не наблюдается, а при введении в данную систему бифункционального сшивающего агента, например, метилен-бис-акриламида (БИС), образования геля не происходит. В то же время инкубирование 8.3 х х 108 клеток, обработанных АХ со 100 мг акрила-мида и 10 мг БИС в 1 мл фосфатного буфера, содержащего 0.3 М ИаС1, в присутствии системы ПС/ГМЭДА при 20°С приводит к образованию устойчивого гидрогеля, как и при инкубировании в тех же условиях обработанных АЦХ клеток.
На рис. 1 приведена зависимость радиоактивности гидрогелей, полученных в присутствии модифицированных АХ (кривая /) и АЦХ (кривая 2)
ФБ, от времени их промывания "голодной" средой (буферным раствором, не содержащим питательных веществ, чтобы исключить размножение клеток) при 4°С. Видно, что ФБ, модифицированные АЦХ, довольно скоро вымываются из геля, в то время как обработанные АХ клетки вымываются медленнее и в меньшем количестве, о чем свидетельствует сохранение высокой радиоактивности гелей при промывании их во времени. При инкубировании этих же образцов гелей в "богатой" питательной среде обнаруживается, что радиоактивность гелей с модифицированными акрилоилхлоридом ФБ снижается незначительно, тогда как радиоактивность гелей с обработанными ацетилхлоридом ФБ падает почти до нуля на четвертые сутки инкубирования (кривая 2). Поскольку накапливающиеся в результате роста бактерии в конце концов разрушают гидрогель на мелкие осколки (что известно как явление "выбухания" геля [20]), можно полагать, что в первом случае радиоактивно меченые материнские клетки остаются прочно связанными с полимерной матрицей, а некоторое увеличение радиоактивности среды определяется переходом части метки в дочерние клетки при делении. Во втором же случае не существует ограничений для выхода всех клеток в среду при деструкции геля (практически вся радиоактивность оказывается в инкубационной среде).
Факт введения двойных связей на поверхность клеток при их обработке АХ подтверждается и данными по сополимеризации модифицированных клеток с гидрофильным мономером и сшивателем. Это означает, что клетки микроорганизмов могут быть ковалентно иммобилизованы в объеме гидрогеля. Такие продукты должны напоминать сополимёры, получаемые методом по-лимеризационного наполнения [21], однако в данном случае в качестве винилированного наполнителя выступает сложная биологически активная система - клетка, взаимодействие которой с модификатором может существенно изменить процессы ее жизнедеятельности: функциональную активность и способность к репродуцированию (делению).
На рис. 2 приведена кинетика ингибирования свечения ФБ некоторыми компонентами модифицирующей системы и их аналогами в условиях in vivo. Видно, что и БИС, и акриламид, и его насыщенный аналог (ацетамид) ингибируют свечение, причем тем сильнее, чем выше их концентрация в суспензии клеток. После отмывки ФБ от ак-риламида свежей порцией буферного раствора часть мономера удаляется из клеток и при концентрации акриламида менее 5 мае. % наблюдается восстановление уровня свечения, достигающее 50% от исходного (кривая 4). Аналогичное явление наблюдается и в случае ацетамида и БИС.
/, отн. ед.
Рис. 2. Кинетика ингибирования свечения ФБ в системе in vivo. Концентрация клеток в суспензии 6.5 х 108 клеток/мл, объем суспензии 0.5 мл, концентрация акриламида 10.0 (i); 8.2 (3) и 0.1 мае. % (4), ацетамида 10.0 мае. % (2), БИС 0.1 мае. % (6). 5 - интактные ФБ.
1//
(1/с)х 103
Рис. 3. Влияние акриламида на альдегидзависи-мую люминесценцию препарата люциферазы из ФБ. Концентрация белка 1.2 мг/мл, концентрация акриламида 0 (/); 2.5 (2); 10.0 (5) и 14.8 мае. % (4). Т= 25°С.
Полагая, что акриламид может воздействовать непосредственно на внутриклеточную люци-феразу, было изучено его влияние на ферментативную реакцию препарата бактериальной люциферазы с ее субстратом (деканалем) in vitro. Влияние акриламида на альдегидзависимую люминесценцию препарата люциферазы из ФБ приведено на рис. 3. Как видно, при концентрации акриламида в системе менее 5 мае. % ингибирова-ние носит конкурентный характер по отношению к деканалю. При увеличении содержания акриламида в системе ингибирование становится неконкурентным, а это означает, что тушение биолю-
что это действительно так, свидетельствует отсутствие ингибирующего эффекта при взаимодействии ФБ с полимерными модификаторами -полиакрилоилхлоридом (ПАХ) и полимет-акрилиолхлоридом (ПМХ) (кривые 4 и 5).
Действительно, размеры пор клеточных стенок грамотрицательных бактерий (и ФБ в том числе) таковы, что не позволяют проникать внутрь клетки веществам с ММ выше 600 [22], в силу чего ингибирование люциферазы осуществляется только низкомолекулярными агентами, причем в отсутствие химического взаимодействия ингибирование носит обратимый характер, а при протекании реакций взаимодействия хлоран-гидридных групп с аминогруппами или другими, способными к взаимодействию, ингибирование становится необратимым.
По-другому ведут себя при ацилировании АХ или МХ дрожжевые клетки. При умеренных концентрациях ацилирующих агентов их активность, определяемая количеством сброженного в спирт сахара, остается на уровне исходной активности интактных клеток [23]. Это означает, что для ДК используемый модификатор не оказывает ингибирующего действия на их функциональную активность (рис. 6).
Таким образом, модификация клеток микроорганизмов АХ иногда сопровождается потерей ими своей функциональной активности, а иногда нет, и связано это с чрезвычайно высокой чувствительностью внутриклеточных систем к данному модификатору.
Если в процессе иммобилизации нарушаются системы репродуцирования, то клетка перестает делиться. Как уже отмечалось, иммобилизация ФБ в объеме полиакриламидных гидрогелей (ПААГ) сопровождается исчезновением способности клеток к свечению. Вместе с тем как обработанные ацилирующим агентом, так и иммобилизованные ковалентно, ФБ сохраняют
Рис. 5. Кинетика нарастания биомассы (а) и свечения (б) интактных (1), ковалентно иммобилизованных в ПААГ (2) и обработанных 10 мае. % акриламида (3) и 0.2 мае. % АХ (4) ФБ при инкубировании в "богатой" питательной среде.
Время, мин
Рис. 4. Зависимость интенсивности свечения ФБ от типа и количества модификатора (мае. %): 1 -0.2 АЦХ; 2 - 0.2 АХ; 3 - 2.0 ПАА; 4 - 2.0 ПМХ; 5 - интактные ФБ.
минесценции клеток под влиянием акриламида связано с непосредственным влиянием мономера на люциферазную активность, однако такое влияние не является драматическим с точки зрения функциональной активности ФБ при невысоких концентрациях акриламида в системе.
Обработка же ФБ ацилирующими агентами (АХ, АЦХ) приводит к резкому и необратимому тушению люминесценции даже при незначительных концентрациях этих соединений в системе (рис. 4, кривые 1 и 2), причем уровень свечения не восстанавливается после отмывки ФБ от реагентов. Тушение люминесценции в данном случае происходит, очевидно, за счет химического взаимодействия проникающих внутрь клетки молекул галоидангидридов с аминогруппами веществ внутриклеточной ферментной системы. О том,
способность к делению и остаются достаточно жизнеспособными.
На рис. 5 приведена кинетика нарастания биомассы и свечения при ингибировании в "богатой" питательной среде образцов гидрогелей с иммобилизованными клетками, а также суспензии клеток, обработанных компонентами модифицирующей системы. Видно, что объем биомассы модифицированных ФБ возрастает сравнимо с объемом биомассы растущих интактных клеток. Большой лаг-период для ковалентно иммобилизованных ФБ может быть связан с дефицитом кислорода и диффузионными ограничениями для проникновения питательных веществ. У вновь появляющихся клеток наблюдается восстановление люминесценции, хотя при этом свечение суспензии ФБ оказывается тусклым: его интенсивность на 2 порядка ниже, чем для интактных клеток. Такое слабое свечение наблюдается и при размножении обработанных акриламидом клеток, что может быть связано с образованием "темнового" варианта ФБ, известного для них как мутантный штамм 148. К сожалению, имеющиеся к настоящему времени сведения о репродуцировании иммобилизованных клеток микроорганизмов крайне ограничены, противоречивы, а работ, посвященных изучению морфологии иммобилизованных клеток, практически нет.
Ковалентная иммобилизация ДК в матрицы полимерных гидрогелей не сопровождается потерей их бродильной активности. Ковалентно иммобилизованные, физические включенные и интактные клетки имеют практически одинаковую абсолютную бродильную активность (количество сброженного в спирт сахара постоянно для всех трех систем), но скорости процесса изменяются: в первом случае скорость ферментации максимальна, что может быть связано с влиянием гидрогелевой матрицы, способствующей повышению локальной концентрации сахара вблизи активных центров ферментных систем иммобилизованных клеток за счет дополнительной сорбции [23].
Таким образом, путем "активирования" микро-биальных клеток АХ и последующей сополиме-ризации их с мономерами и сшивающими агентами удается получать препараты иммобилизованных клеток с сохраняющейся жизнеспособностью и (в некоторых случаях) с высокой функциональной активностью. Угнетение же функциональной активности клеток при их взаимодействии с ненасыщенными модификаторами может иметь самостоятельное значение в плане регулирования их метаболизма.
Такое поведение иммобилизованных клеток определяется структурой полимерных гидрогелей, формируемых в присутствии НМ. Действительно, при анализе особенностей структуро-образования в трех системах, таких как ПААГ, полученные радикальной сополимеризацией вод-
Содержание этанола, об. %
Время, сут
Рис. 6. Изменение содержания спирта в сусле, сбраживаемом интактными (1) ДК, и обработанными 2 мае. % АХ при 4°С (2). Использовано 50 мл суспензии ДК, содержащей 30 млн. клеток/мл, на 1 мл виноградного сусла.
ного раствора, содержащего 10 мае. % акрила-мида и 0.5 мае. % БИС (содержание сшивающего агента от мономера составляет 5%) (гель I); ПААГ, полученные сополимеризацией такого же раствора, но в присутствии различного количества интактных ФБ (гель И); ПААГ, полученные сополимеризацией первой системы в присутствии разного количества модифицированных ФБ со средним содержанием связей С=С на 1 клетку, равным 104 - 106 (гель III), был установлен ряд интересных закономерностей.
На рис. 7а приведены кинетические кривые набухания гелей в искусственной морской воде. Как видно, степени набухания гелей I - III и скорости их набухания различны. Наибольшей набуха-емостью обладает гель II, меньшая набухаемость наблюдается у геля I, а хуже всего набухает гель III. Если равновесно набухшие гели подвергнуть действию ДМСО, разрушающего клетки [24], вымыть разрушенные клетки и провести повторное набухание после высушивания образцов, то 'характер и тип кривых набухания сохранится (рис. 76), хотя абсолютные значения величины Sr несколько возрастут. Это означает, что ФБ оказывают влияние на характер закладывающихся при полимеризации структур. Такое влияние должно быть тем ббльшим, чем большее количество клеток присутствует в полимеризующейся системе. На рис. 8а представлена зависимость Sr от количества вводимых в полимеризующуюся смесь активированных акрилоилхлоридом ФБ. По сравнению с гелем I (начиная с некоторого значения концентрации ФБ) наблюдается снижение величины Sr. При дальнейшем увеличении
Время, сут
Рис. 7. Кинетические кривые набухания гелей I (/), до (а) и после (б) удаления ФБ.
количества клеток в исходной смеси на 2 порядка емкости гелей по растворителю изменяются незначительно. В случае сополимеризации акрила-мида с БИС в присутствии интактных клеток повышение их концентрации приводит к заметному падению величины 5Г (рис. 86, кривая /). Можно полагать, что увеличение концентрации гидрофобных ненабухающих частиц, которыми являются ФБ, равносильно повышению степени сшивки ПААГ. Характерно, что и в этом случае разрушение клеток и их удаление из геля также сопровождается некоторым ростом величины 5Г, причем в случае активированных клеток набуха-емость изменяется незначительно, тогда как для геля II она оказывается пропорциональной количеству вводимых в исходную смесь интактных клеток (рис. 8а, 86, кривые 2).
Время, сут
П (2) и П1 (5) в искусственной морской воде при 20°С
Следовательно, в первом случае образуется гель с меньшими размерами пор, чем гель II. Иными словами, присутствие интактных клеток в системе приводит к образованию гидрогелей сббльшими размерами пор. По-видимому, ФБ выступают в этом случае в качестве твердого нерастворимого структурного модификатора, причем размеры макропор геля при этом должны быть соизмеримы с размерами клеточных агломератов, образующихся в зависимости от концентрации суспензии клеток. Следовательно, размеры макропор гидрогелей, формируемых в присутствии ФБ, определяются как качеством клеток (интактные или модифицированные), так и их количеством.
Одним из условий жизнедеятельности иммобилизованных клеток является высокая проница-
Sn г Н20/г 9-
0 0.5
(а)
-i <Г-
5 20 35
СфБ х 10"5, млн/мл
Sn Г Н20/г 15
-М i-
50 0 0.5
5 20 35
СфБ х 10~5, млн/мл
50
Рис. 8. Зависимость степеней набухания гелей II (а) и III (б) до (/) и после (2) удаления клеток от концентрации ФБ в исходной мономерной смеси.
емосгь матрицы, в которой они иммобилизованы, для питательных веществ и продуктов метаболизма. Проницаемость гелей I - III можно оценить по значениям коэффициентов диффузии для различных веществ.
Рассчитанные из экспериментальных данных значения коэффициентов диффузии приведены в табл. 2. Как следует из таблицы, величина D для гелей III оказывается ниже, чем для гелей I и II. Для образцов гелей I заметное снижение скорости проникновения вещества в гель наблюдается начиная с декстрана с М = 20000, декстран с М = 500000 не проникает сквозь поры геля, тогда как для образцов геля III заметное снижение скорости диффузии наблюдается уже для полиэти-ленгликоля с М = 1000, а декстран с М = 70000 вообще не диффундирует в гель. Эти данные свидетельствуют о том, что, действительно, количество и качество ФБ определяют тип макроструктуры гелей.
Совокупность полученных данных позволяет сделать вывод о том, что при сополимеризации акриламида с БИС в присутствии ФБ последние выступают в роли активного структурного модификатора. Если введение интактных «леток, для которых характерно образование колоний (ассо-циатов) в исходной суспензии, приводит к существенному возрастанию размеров макропор геля, то клетки, несущие на своей поверхности связи С=С (напомним, что на поверхность клетки удается ввести не более 2 х 106 ацильных групп), способны вступать в реакции сополимеризации с ак-риламидом и БИС. В этом случае, с одной стороны, они являются дополнительным сшивающим агентом, уменьшающим размеры пор геля (а, следовательно, его набухаемость и проницаемость), а с другой - могут выступать в качестве гидрофобных включений, придавая всей системе в целом характер наполненного материала [25].
Для выяснения механизма структурообразова-ния в таких системах необходимо знание моле-кулярно-массовых характеристик и строения
Л пр. дл/г 2.6
2.4
2.2
о 1 • 2
0.1
0.2 с, г/дл
Рис. 9. Зависимость приведенной вязкости растворов ПАА в воде (I) и в 30%-ной Н202 (2).
ПАА-цепей, образующих собственно матрицу геля. Как известно [26], ПААГ чувствительны к действию пероксида водорода, причем количество образующихся при расщеплении гелей метило-лакриламидных групп составляет ровно половину от количества звеньев сшивателя в сополимере, а образующийся продукт хорошо растворим в воде. Использование пероксидного расщепления ПААГ возможно только в том случае, если при этом не происходит деструкции основной полимерной цепи. На рис. 9 представлена зависимость приведенной вязкости раствора линейного ПАА от его концентрации в воде и в 30%-ном растворе Н202. Как видно, величина Т) в обоих случаях практически одинакова, а значения рассчитанных по формуле
[т)] = 6.8 х 1(Г2М066 [27] '
величин Мц составляет 1.98 х 105 и 1.96 х 103 соответственно и совпадают в пределах точности измерений, что делает правомерным использование указанной методики для оценки длины цепей ПАА.
Таблица 2. Значения коэффициентов диффузии некоторых полимеров в гелях I - Ш
Соединение М Коэффициент диффузии D, м2/с (±5%)
гель I гель II гель III
Полиэтиленгликоль 600 _*
1000 5.07 х 10~w
Декстран 20000 7.93 х 10"10 2.62 х 10~10
40000 1.79 х 10"10 5.33 х ИГ10
70000 7.11 хЮ"11 Не диффундирует
500000 Не диффундирует _* То же
Голубой декстран 2000000 Тоже 5.05 хЮ"11 Тоже
* Измерение коэффициентов диффузии невозможно из-за чрезвычайно высокой скорости проникновения вещества в гель.
/, отн. ед.
Время, сут
Ряс 10. Стабильность свечения интактных (1) и модифицированных ПМХ (2) и ВП-МХ (3) клеток при их исходной концентрации 6.7 х 10® клеток/мл.
Рассчитанные значения Мц для гелей I, II и III равны 47900, 7600 и 28300 соответственно. Это различие можно объяснить исходя из предположения о том, что при одинаковых условиях инициирования ФБ, содержащие связи С=С, более активно участвуют в процессах обрыва цепей [28].
Таким образом, присутствие ФБ в полимери-зующейся системе акриламид-БИС оказывает влияние как на ранние стадии структурообразо-вания в гидрогелевой системе, так и на макросвойства гелей в целом, а образующиеся продукты можно рассматривать как привитые на клетки макромолекулы синтетических полимеров.
В табл. 3 приведены результаты механических испытаний образцов гелей I - Ш, из которой видно, что наибольшие значения Мс имеют гели с включенными клетками (гели II), а минимальные расстояния между узлами сетки - гели Ш, что полностью согласуется с приведенными выше данными по набухаемости и проницаемости этих гидрогелевых систем.
Приведенные результаты позволяют заключить, что присутствие клеток микроорганизмов в полимеризующейся системе акриламид-БИС изменяет характер ее гелеобразования. Введение
способных к агломерации интактных клеток эквивалентно введению в систему "неактивного" наполнителя и приводит к увеличению средних размеров пор геля, его набухаемости и проницаемости. Клетки, несущие на своей поверхности двойные связи, способны выступать в роли "активного" наполнителя. При этом образующийся сополимер имеет блочный характер и ббльшую частоту сшивки, что в совокупности с его ди-фильным строением (участок гидрофильного ПАА - участок гидрофобной клетки) определяют комплекс его физико-химических свойств, отвечающих за процессы метаболизма клеток и их деления.
Выше было показано, что ингибирование функции свечения ФБ низкомолекулярными модификаторами является результатом проникновения последних внутрь клетки и непосредственного их взаимодействия с внутриклеточной люци-феразной системой. Поскольку размеры пор внешней мембраны клеточной оболочки грам-отрицательных бактерий позволяют проникать в клетку веществам с ММ не более 600 - 700, можно ожидать, что модификация клеток реакционно-способными полимерными веществами позволит и осуществить связывание ФБ с полимером, и сохранить активность люциферазы.
Для проверки этого предположения в соответствии с работой [29] были синтезированы линейные полимерные модификаторы: гомополимеры МХ с М = 7000 и 20000 (ПМХ 7000 и ПМХ 20000 соответственно) и сополимер ВП-МХ, содержащий 7 мол. % МХсМ = 30000 (ВП-МХ 30000).
Обработку клеток полимерами проводили следующим образом. Навеску полимера помещали в суспензию ФБ, тщательно отмытых от компонентов питательной среды, и инкубировали при перемешивании дЬ полного растворения полимеров (30 - 60 мин). Взаимодействие клеток с ПМХ оценивали вискозиметрическим методом, измеряя удельную вязкость раствора полимера до и после контакта с клетками (клетки отделяли центрифугированием при 7000 об/мин). Контролем служила суспензия клеток, обработанная растворами неионогенных и нереакционноспо-собных полимеров: ПЭГ, ПВП, ПАА с М = 20000 различной концентрации. Результаты, предсгав-
Таблица 3. Модули упругости, средние значения [т|], Мс и средняя длина цепей ПАА между сшивками для образцов гелей I - Ш
_ _ Среднее число звеньев
Образец геля [т|] Мч х 10"3 б, Н/м2 (±5%) Мс акриламида между
сшивками п
Гель1 0.23 28.3 1.267 х 104 183001 900 260 ± 10
ГельП 0.35 47.9 1.578x104 16300 ±1300 370 ±20
ГельШ 0.08 7.6 0.856 Х104 15200 ± 700 210 ±10
Рис. 11. Зависимость уровня свечения клеток на пленке от времени ее инкубирования с суспензией клеток, содержащих 5.6 х 108 клеток/мл (1) и самой суспензии (2) (а) и от концентрации суспензии клеток (б). Время инкубирования 8 ч.
ленные в табл. 4 показывают, что ПМХ 20000 значительно хуже взаимодействует с ФБ, нежели ПМХ 7000. Обработка суспензии ФБ сополимером ВП-МХ также сопровождается связыванием его с клетками, однако количество присоединенного модификатора меньше, чем ПМХ. Следует отметить, что ПЭГ, ПАА и ПВП вообще не связываются с ФБ и практически никак не влияют на их свечение, что видно из рис. 4 и 10, на котором приведена зависимость свечения ФБ от времени при обработке указанными полимерами. Следовательно, взаимодействие ПМХ с ФБ не приводит к угнетению функциональной активности клеток и позволяет получать соиммобилизованные системы "прививочного" типа.
Такие соиммобилизованные системы полимер-клетка могут быть получены не только со-полимеризационным путем, но и взаимодействием интактных клеток с реакционноспособными полимерными носителями. Используя привитые на поверхность "обычных" биоинертных полимеров (ПЭ, ПЭТФ) АХ или МХ [30], удается получить соиммобилизованные системы полимер-микроорганизм без потери функциональной активности (биолюминесценции) клеток. Схематически этот процесс может быть представлен следующим образом:
Н2С=СН ^ I 0=С~С1
(У)
Гсо)
Полимер
-(СН2-СН^-СН2-СН2
о=с I
С1
о=с I
С1
Иммобилизацию ФБ осуществляли инкубированием их суспензии с привитым сополимером
Таблица 4. Взаимодействие фотобактерий с полимерными модификаторами
Полимерный модификатор Концентрация раствора, г/мл Число молей полимера, связанного с 1 клеткой*
до контакта с ФБ после контакта с ФБ
ПМХ 7000 0.0100 0.0078 (3.03 ± 0.05) хЮ7
0.0050 0.0026 (1.20 ± 0.03) х 107
ПМХ 20000 0.0100 0.0097 (1.29 ± 0.03) х 10б
0.0050 0.050 -
ВП-МХ 30000 0.0010 0.0010 -
0.0050 0.0043 (2.21 ± 0.06) х 104
Привитой сополимер
* Концентрация суспензии клеток составляет 7.2 х 109 клеток/мл.
Время, сут
Рис. 12. Стабильность свечения пленки, содержащей 3.8 х 107 клеток/см2 (7) и суспензии ФБ, содержащих 3.1 х 107 клеток/мл (2) при 20°С.
при 0 - 4°С из расчета 1 мл суспензии на 1 - 2 см2 поверхности пленки. Эффективность иммобилизации определяли двумя способами: с помощью метода радиоактивных индикаторов, используя меченые изотопом 1251 фотобактерии, и по количеству высвобождающего аденозинтрифосфата.
На рис. 11а приведена кинетика изменения интенсивности свечения суспензии клеток, контактирующих с пленкой, и самой пленки. Видно, что интенсивность свечения пленки возрастает, но после 7 - 8 ч инкубирования свечение пленки перестает возрастать. В то же время уровень свечения клеток, иммобилизованных на пленке, определяется и временем контакта, и концентрацией ФБ в исходной суспензии: возрастание свечения
Таблица 5. Зависимость эффективности иммобилизации фотобактерий на пленке ПЭ-МХ от условий инкубирования пленки с суспензией клеток
м X Л _ с: Ц я 3 .о ч - . * Ж * X £ Количество иммобилизованных на 1 см2 пленки клеток (± 10%), определенное по
Степень привш МХ п х 106, мох * ,л »8 Н 4> X О " м 5* й 5 Я с и к в Р о С 2 Я и о. Н> Й Я § О с АТФ-ана-лизу по1251
3.2 2.8 х 108 2.0 0.81 х 107 3.85 х 107
4.7 5.6 х 108 1.0 1.48 х 107 9.21 х 107
5.4 5.6 x10е 1.0 1.37 х 107 9.60 хЮ7
6.5 3.3 х 109 1.0 2.92 х 107 7.33 х 107
4.7* 5.6 х 107 1.0 - 0.07 х 107
6.5* 3.3 х 109 1.0 - 0.28 х 107
* Привитые пленки предварительно прогидрол изованы водой.
пленок происходит вплоть до 8 х 108 клеток/мл, после чего увеличение концентрации клеток даже на порядок не вызывает увеличения свечения пленки (рис. 116).
Данные по иммобилизации клеток в зависимости от условий ее проведения приведены в табл. 5. Как видно, значения величины эффективности иммобилизации, определенные биохимически (по количеству высвобождающегося АТФ) и радиохимически, совпадают по порядку величин, причем этот порядок (107 клеток/см2) один и тот же для всех использованных образцов с различными степенями прививки.
Иммобилизованные на нерастворимой пленке ФБ не только не теряют абсолютный уровень биолюминесценции, но и повышают стабильность свечения во времени, что проявляется в увеличении времени полузатухания люминесценции у этих образцов в 4 - 5 раз по сравнению с ин-тактными клетками (рис. 12).
Химически связанные с полимерной подложкой клетки сохраняют и способность к делению. Так, после инкубирования в богатой питательными веществами среде в течение 1 сут пленки с иммобилизованными мечеными 1251 ФБ сохраняют около 60% радиоактивности, в то время как радиоактивность среды возрастает на 40% и одновременно наблюдается прирост биомассы: оптическая плотность среды при X = 660 нм возрастает за 1 сут с 0.006 до 0.18.
Итак, иммобилизация микроорганизмов на твердой нерастворимой полимерной подложке приводит к получению полимерных материалов с ковалентно иммобилизованными клетками, обладающими жизнеспособностью, высокой функциональной активностью и повышенной стабильностью ее проявления, что может быть использовано для практического применения.
Перспективность применения биолюминесценции для анализа веществ определяют три основных обстоятельства. Во-первых, современные методы детектирования излучения в оптическом диапазоне достигли чувствительности, позволяющей считать отдельные кванты. Второе - это высокая специфичность, определяющаяся ферментативной реакцией, лежащей в основе метода. Третье обстоятельство заключается в том, что энергетическое обеспечение биолюминесценции осуществляется через общие метаболические пути, а это позволяет использовать цепи сопряжения ферментов с люциферазой таким образом, что большинство ключевых метаболитов и антиметаболитов может быть измерено посредством люминесценции. Кроме того, стоимость биолюминесцентных измерений (которые являются экспресс-методами) мала благодаря относительной дешевизне используемых реагентов, а источники бактериальной люциферазы практически неиссякаемы.
При высокой чувствительности и воспроизводимости метод бактериальной биолюминесценции применяется для анализа субстратов бактериальной люминесцентной системы: флави-нов, пиридин-нуклеотидов, липидов, кислорода; ИЛЬ/Р/Н-зависимых ферментов и их субстратов; различных гидрофобных соединений, наркотиков, канцерогенов, инсектицидов: АТФ и АДФ-зависимых ферментов (посредством сопряженных ферментных систем) и т.д. [31 - 35]. Иными словами, фотобактерии сами по себе являются сенсорными системами.
Препараты ковалентно иммобилизованных ФБ можно рассматривать в качестве биосенсоров для проведения анализа в потоке. Модифицированную клетками полимерную подложку из ПЭ площадью 1 см2 помещают в специальный проточный реактор из стекла объемом 1 см3 (рис. 13). Этот реактор заключают в светонепроницаемую камеру перед фотоэлектронным умножителем люминометра. Реактор соединяют с проточной системой (подающей инкубационную среду и раствор анализируемого соединения), скорость потока в которой (4 - 20 мл/мин) задается блоком управления по заданной программе (рис. 14). После введения раствора анализируемого соединения и регистрации сигнала реактор промывают свежей порцией среды (фосфатный буферный раствор, содержащий ЫаС1) до восстановления уровня биолюминесценции к исходному (в автоматическом режиме), после чего система готова для проведения нового анализа.
При введении ингибитора в проточный реактор с иммобилизованными ФБ наблюдается тушение биолюминесценции, которое выходит на стационарный уровень через 1 мин (рис. 15). Для отмывки ингибитора и восстановления уровня свечения на 95 - 98% от исходного требуется 8-9 мин при скорости потока 15 мл/мин, после чего возможно введение в поток новой порции раствора, содержащего л-хлоркарбонилфенил-гидразон. При этом уменьшение интенсивности свечения коррелирует с моментом появления ингибитора в анализируемой пробе, что позволяет считать пленку с иммобилизованными ФБ датчиком для определения органических веществ [36].
При анализе альдегидов в реактор помещают 1 см5 пленки с иммобилизованными клетками альдегидзависимого мутанта ФБ, штамм 148. Введение в поток тетрадеканаля в концентрации 10~3% вызывает быстрое нарастание интенсивности свечения. После достижения максимальной интенсивности реактор промывают средой в течение 1.5 мин до восстановления работоспособности сенсора (рис. 16). В данном случае наблюдается линейная зависимость интенсивности свечения от концентрации альдегида в интервале концентраций 10"3 -10-6 моль/л (рис. 17), что позволяет проводить количественное тестирование альдегидов на одном и том же образце. Такой
Исследуемое вещество
Спив
Образец пленки с
иммобилизованными
фотобактериями
Рамка-держатель с
герметичной
крышкой
Рис. 13. Схематическое изображение проточного реактора.
Рис. 14. Блок-схема установки для анализа растворов иммобилизованными ФБ.
/, отн. ед.
100
50
{ 7.3 х 10"6 м | 2.7 х 1СГв м | 2.7 X 10"5 м
20
40
Время, мин
60
Рис. 15. Ингибирование свечения интактных (7) и ковалентно иммобилизованных на ПЭ-плен-ке (2) ФБ ж-хлоркарбонилфенилгидразоном в потоке и временная зависимость интенсивности люминесценции суспензии интактных клеток (3).
Рис. 16. Зависимость интенсивности свечения ПЭ-пленки с иммобилизованными ФБ от времени при введении 3.5 х 10~7 моль/л тетрадеканаля в проточный реактор. Момент появления альдегида отмечен стрелкой.
Рис. 17. Зависимость интенсивности свечения ПЭ-пленки с иммобилизованными ФБ от концентрации тетрадеканаля в потоке.
подход дает возможность многократного использования (более 60 опытов на одном образце пленки в день) иммобилизованных ФБ в анализе альдегидов в автоматическом режиме, что в сочетании с высокой стабильностью препаратов дает основания для использования их в аналитических определениях [37].
Таким образом, существует реальная возможность ковалентной иммобилизации модифицированных ненасыщенными соединениями клеток микроорганизмов в объеме полимерных гидрогелей. Иммобилизация клеток по-разному влияет на параметры сеток сшитых сополимеров, мик-ро- и макроструктуру которых удается регулировать варьированием качества и количества иммобилизуемых ФБ или ДК. При этом оказывается возможным регулировать функциональную ак-
тивность клеток и их способность к репродуцированию. При невозможности использования сопо-лимеризационного метода оказывается полезным способ получения гидрогелевых сорбентов реакциями полимераналогичных превращений предварительно синтезированных реакционно-способных сополимеров. Взаимодействием таких реакционноспособных носителей с микроорганизмами удается получить высокоактивные со-иммобилизованные системы, проявляющие свойства биосенсоров, подходящих для аналитических целей.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Chibata I. // Immobilized Microbial Cells. SFM. 1979.
2. Зуева H.H., Яковлева В.И., Веревкин А.Н., Авсюк И.В., Арен А.К., Березин И.В. // Прикл. биохимия и микробиология. 1985. Т. 21. № 3. С. 334.
3. Чеховская Т.П. // Иммобилизованные клетки микроорганизмов. Пущино, 1978. С. 62.
4. Гвоздяк П.И. // Иммобилизованные клетки микроорганизмов. Пущино, 1978. С. 80.
5. Campagne С.Р., Girard F., Morin N. // Biotechnol. Lett. 1988. V. 10. P. 463.
6. Beifort J. H Biotechnol Bioengin. 1989. V. 33. P. 1674.
7. Cottenceau G., Dherbomez M., Lubochinsky В., Letel-lier F. H Enzyme Microb. Tehnol. 1990. V. 12. P. 355.
8. Carenza M., Yoshida M., Kumakura M., Fujimura T. // Eur. Polym. J. 1993. V. 29. № 7. P. 1013.
9. Введение в прикладную энзимологию / Под ред. Березина И.В., Мартинека К. М.: МГУ, 1982.
10. Kinoshita S., Muranata M., Okada H. // J. Ferment. Technol. 1975. V. 53. № 4. P. 223.
11. Chen T.S. H J. Chem. Technol. and Biotechnol. 1982. V. 32. № 7. P. 669.
12. Баранова НА., Александрушкшш H.A., Егоров H.C. H Биологические науки. 1980. T.' 12. С. 77.
13. Шумихин В.Н., Данилов B.C., Егоров Н.С. // Биофизика. 1981. Т. 26. № 1. С. 130.
14. Pia té NA., Valuev LI., Chupov V.V. // Pure Appl. Chem. 1984. V. 56. Ms 10. P. 1351.
15. Платэ HA., ВалуевЛ.И., Синани В А., Чупов B.B. // Биотехнология. 1987. Т. 3. № 2. С. 174.
16. Синани В А., ВалуевЛ.И., Чупов В.В., Платэ НА. //Высокомолек. соед. А. 1988. Т. 30. № 10. С. 2088.
17. Иост X. Физиология клетки. М.: Мир, 1975.
18. Усова A.B., Чупов В.В., ВалуевЛ.И.,Лыс Я.И., Федосеев В.М., Платэ НА. // Высокомолек. соед. Б. 198». Т. 30. №4. С. 304.
19. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1972.
20. Гулевская С.А., Суходольская Г.В. // Иммобилизованные клетки микроорганизмов. Пущино, 1978. С. 149.
21. Иваннев С.С. Радикальная полимеризация. Д.: Химия, 1985.
22. Тысячная И.В., Фечина В.Я., Яковлева В.И., Березин И.В. // Прикл. биохимия и микробиология. 1984. Т. 20. №4. С. 433.
23. Чупов В.В., Валуев JIM., Платэ Н.А. // Тез. докл. V В се союз. симп. "Инженерная энзимология". Ко-булети, 1985. Ч. 1. С. 35.
24. Rodionov Yu.V., Lebedeva N.V., Kondratieva EjJ. // Arch. Microbiol. 1986. V. 143. № 3. P. 345.
25. Чупов B.B., Усова A.B., Землянская В.A., Платэ Ни4. // Веста. МГУ. Сер. 2. Химия. 1991. Т. 32. №3. С. 75.
26. Остерман Ли4. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981.
27. Brandrup J., Immergut ЕЯ. // Polymer Handbook. New Yoik; London; Sidney; Toronto: Wiley, 1975.
28. Imoto M„ Ouchi Т., Nakamura Y., Morita E., Toku-jama Y., Obata H., Iwamoto S. // J. Polym. Sci., Polym. Lett. 1979. V. 17. №6. P. 347.
29. Халиков Т., Надясимутдинов Ш., Усманов Х.У. // Азерб. хим. журн. 1972. >6 1. С. 90.
30. Бурдыгина И.Ф., Чупов В.В., Валуев Л.И., Александрова Л.В., Голубев В.Б., Платэ Ни4. // Высо-комолек. соед. А. 1982. Т. 24. № 2. С. 372.
31. Chang-KeeH., Tamiya £., Takeushi Т., Karubel. //Bio-technol. Bioengin. 1993. V. 4. P. 1107.
32. Lloid D., James K., Williams J., Williams NA. // Analyt. Biochem. 1981. V. 116. P. 17.
33. QuistorffB., Chance В., Hundling A. // 3rd Symp. Int. Soc. Oxygen Tr. New York: Acad. Press, 1977. P. 126.
34. Imaeda K., Ohisawa K., Uchijama K. // Bunseku Ka-gaku. 1983. V. 32. № 2. P. 159.
35. Makigushi N.. Arita M., Asai J. I I Ferment. Technol. 1980. V. 58. № 1. P. 17.
36. Чупов B.B., Усова A.B., Платэ H.A. // Прикл. биохимия и микробиология. 1992. Т. 28. № 2. С. 217.
37. Valuev LJ., Chupov V.V., Plate NA. // J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 1993. V. 5. № 1 /2. P. 37.
Polymeric Systems Containing Immobilized Microbial Cells and Biosensors on Their Basis (Review)
N. A. Plate and V. V. Chupov
Topchiev Institute of Petrochemical Synthesis, Russian Academy of Sciences, Leninskiipr. 29, Moscow, 117912 Russia
i
Abstract - The synthesis and properties of coimmobilized systems involving a synthetic polymer and microbial cells are considered. The effects of covalent immobilization of the cells on their functional activity and reproductivity are discussed, as well as the effects that the cells show on the structure and physicochemical properties of filled polymers synthesized in the presence of intact or chemically modified photobacteria. Under certain conditions, the low-molecular-mass cell modifiers completely ruin the intracellular activity of microorganisms, whereas polymeric reactive carriers interact with the cells, leaving their intracellular elements intact. Procedures for preparation of biosensors based on immobilized photobacteria are described; these biosensors allow qualitative and quantitative identification of the impurities in aqueous media.
