CC BY
19
УДК 578.245
С. Н. Куликов
ПОЛИМЕРНЫЕ МАТРИЦЫ В СОРБЦИИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ И ОПРЕДЕЛЕНИИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
Ключевые слова: полимерная матрица, ДНК, иммуноглобулин, протеиназная активность.
Показана возможность использования полимерной матрицы на основе полинуклеиновой кислоты для сорбции на ней специфических иммуноглобулинов. Сорбированные на полимерной матрицы иммуноглобулины могут быть использованы в качестве субстрата для действия протеолитических ферментов. Определение протео-литической активности представленным способом является высокочувствительным, специфическим и малозатратным и может быть использовано в биомедицинской сфере.
Keywords: polymeric matrix, DNA, immunoglobulin, proteinase activity.
Polymer matrix based on a polynucleic acid was used for sorption of the specific immunoglobulins. Immunoglobulins on the polymer matrix can be used as a substrate to determine ofproteolytic enzymes. Determination of the proteolytic activity of the present method is highly sensitive, specific, and low-cost and can be used in the biomedical field.
Введение
Протеиназы патогенных и условно-патогенных микроорганизмов играют существенную роль в патогенезе поражений. Большое внимание уделяется микробным протеолитическим ферментам, которые расщепляют молекулы иммуноглобулинов класса С (1дС). Для выявления активности этих энзимов применяются различные методы: спектрофотометрические, нефелометрические, им-мунопреципитирующие, иммунохимические в сочетании с гельфильтрацией в полиакриламидном геле [1, 2]. Однако, полуколичественная оценка протео-литической активности данными методами обладает невысокой чувствительностью, иногда не поддается стандартизации и, поэтому, трудно применима в практике. Наиболее перспективным из современных способов определения 1дС-протеиназной активности является метод иммуноферментного анализа благодаря своей высокой чувствительности.
В настоящее время существует несколько подходов к определению 1дС-протеиназной активности с помощью иммуноферментного метода [3]. В этих случаях используется предварительная сорбция бактериальных антигенов (например, бактериальных антигенов) в лунках полистиролового планшета, с которыми впоследствии специфически взаимодействует добавляемый к ним 1дС. Добавление к такой системе раствора, содержащего протеолити-ческие ферменты, приводит к расщеплению 1дС (отщеплению Fc-фрагмента), что легко фиксируется последующим добавлением в лунки конъюгата белка А стафилококка с пероксидазой. Преимуществом этого способа является его достаточно высокая чувствительность, однако, использование в качестве сорбируемого на полистироловую поверхность планшета антигена, представляющий тобой по сути комплекс бактериальных белков и гликопротеинов, обладает недостатком, а именно - подверженностью самого антигена к ферментативному расщеплению протеолитическими энзимами, что может исказить реальную величину активности исследуемого фермента. Для устранения этого нежелательного эффекта может быть применена схема раздельного осуще-
ствления ферментативной реакции - в одной ёмкости (планшете) с последующим определением концентрации неpacщеплённых антител в другой ёмкости (планшете), содержащую сорбированные антигены [3]. Однако, недостатками такой оценки проте-олитической активности являются: использование двух планшетов - для проведения реакции расщепления иммуноглобулинов, а затем переноса реакционной смеси во второй планшет тест-системы для определения количества нерасщеплённого субстрата; необходимость предварительного подбора разведения тестируемого фермента, чтобы попасть в диапазон концентраций, благоприятных для определения активности.
Вышеупомянутая проблема была устранена в подходе [4], где в качестве субстрата использовался 1дС, сорбированный непосредственно на полистироловую поверхность планшета без использования бактериального (белкового) антигена. Однако, такой подход, несмотря на всю его простоту, обладает существенным недостатком - пониженной доступностью молекул 1дС для ферментативного расщепления всилу того, что молекулы иммуноглобулинов благодаря гидрофобному взаимодействию зафиксированы на поверхности полистирола и менее доступны ферментам. Более того, благодаря большому размеру молекулы ^в, сорбированный на полистироле иммуноглобулин может подвергаться многократному протеолитическому расщеплению без потери способности связывать впоследствии специфический конъюгат (белок А стафилококка с перокси-дазой или специфический к Ро-фрагменту 1дС с пе-роксидазой), что может привести к заниженной оценки протеолитической активности исследуемого фермента.
В связи с этим задачей настоящей работы являлась разработка простого способа, позволяющего с высокой точностью и высокой чувствительностью определять протеолитическую активность с использованием иммуноферментного метода.
Экспериментальная часть
Определение ^в-протеиназной активности проводили следующим образом. В лунки планшета
предварительно сорбировали полимерную матрицу - двунитевую полидезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК). Для этого ДНК растворяли в 0,2 М натрий-фосфатном буферном растворе с рН 7,4 из расчёта 20 мкг/мл. Приготовленный раствор в объёме 50 мкл вносили в лунки планшета, инкубировали в течение 24 ч при 4°С. После этого лунки планшета трижды промывали 0,2 М натрий-фосфатным буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,05 % твин-20, заливая по 100 мкл в каждую лунку, затем планшет осушали путём вытряхивания остатка жидкости. Подготовленные таким образом планшеты можно хранить в течение года при 4°С в сухих условиях. Затем растворяли IgG специфический к двунитевой ДНК в 0,2 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,4, в концентрациях 0,1-1 мкг/мл и вносили по 50 мкл раствора в лунки планшета. Закрывали крышкой и оставляли на 1 ч при комнатной температуре. Три раза отмывали планшет 0,2 М натрий-фосфатным буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,05% твин-20, заливая по 100 мкл в каждую лунку, затем планшет осушали путём вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета вносили по 100 мкл 0,02 М натрий-фосфатного буферного раствора с рН 7,4. В одну из лунок планшета вносили 100 мкл раствора фермента (трипсина) в том же буфере в концентрации 1 мкг/мл. Далее готовили двукратные разведения трипсина, используя несколько следующих лунок. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, трёх отмывок 0,2 М натрий-фосфатным буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,05 % твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносили по 100 мкл конъюгата перокси-дазы с белком А золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus) в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, трёхкратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносили по 100 мкл субстратного раствора (0,038 %-ный раствор о-фенилендиамина в 0,1 М натрий-цитратном буфере, рН 6,0, содержащий 0,06% перекиси водорода). После 30 минутной инкубации в темноте при комнатной температуре реакцию останавливали внесением в каждую лунку 50 мкл 25% серной кислоты. Результаты реакции учитывали с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Количество расщепленного IgG определяли по разнице между количеством иммуноглобулина в контроле и опыте, используя стандартную калибровочную кривую. IgG-протеиназную активность рассчитывали по формуле:
A=(Ck-Co)/t Cf ;
где A - активность фермента (в усл. единицах) активности; Ck — концентрация иммуноглобулина в контроле; Co - концентрация иммуноглобулина в лунках, куда вносили раствор фермента; T — время протеолиза; Cf — концентрация фермента в анализируемом растворе.
Результаты и их обсуждение
Использование в качестве сорбированного антигена полимерных матриц, в данном случае - полинуклеиновой кислоты, позволяет избежать каталитически эффективного взаимодействия с ними исследуемого протеолитического фермента, что не приводит к искажению истинной величины активности изучаемого фермента. Кроме того, высокая степень полимеризации матриц с которыми связываются молекулы 1дС позволяет эффективно нивелировать негативный эффект от наличии в среде с протеиназами также ферментов, способных расщеплять эти полимерные матрицы - нуклеаз, поскольку эффективное расщепление высокополимерных соединений, сопровождающихся их полной десорбцией с поверхности полистирола, требует наличия очень высоких концентраций этих специфических энзимов Сравнительная схема способов определения представлена на рисунке 1.
Eg | БД № —Л— /у-ч . А ,ОП 1
ПП
F с г ^^^ ! - Б ОП
ПП
Ее 1 1 ™ 1 laG—JL—► „ / 1 ПП В ОП
Рис. 1 - Сравнительная схема способов определения !дО-протеиназной активности: А - по способу описанному в работе [3], Б - по способу описанному в работе [4], В - по способу описанному в работе [5]; !дО - молекула иммуноглобулина которую расщепляет протеиназа; Ро - отщеплённые или расщеплённые Ро-фрагменты иммуноглобулина; ПП - полистироловая подложка; БА -белковый антиген, ПМ - полимерная матрица; ОП - регистрация нерасщеплённых молекул иммуноглобулина по оптической плотности
Было установлено, что использование полинуклеиновой матрицы может быть использовано для сорбции на них специфических иммуноглобулинов с последующим воздействием на них ферментов -протеаз. В данной работе в качестве модельного объекта использовался фермент - трипсин. Результаты расщепления трипсином ^в, сорбированного на полимерной нуклеиновой матрице представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Зависимости оптической плотности (ОП) от концентрации трипсина
Трипсин, нг/мл ОП, 492 нм
976 0,082
488 0,199
244 0,319
122 0,425
61 0,555
30 0,783
15 0,900
7 1,050
3 1,125
0 1,515
Из данных таблицы 1 следует, что молекулы иммуноглобулина эффективно связываются с нуклеиновой кислотой, о чём свидетельствует большая величина значения оптической плотности в контроле без добавления фермента.
При добавлении фермента происходит расщепление сорбированного иммуноглобулина, как показано на рисунке 1 В. Fc-фрагмент отщепляется и впоследствии удаляется из лунки, поэтому не участвует во взаимодействии с конъюгатом, который добавляют на следующем этапе. Таким образом, чем выше протеиназная активность, тем большее количество молекул иммуноглобулина подвергается расщеплению, и, следовательно, меньше величина оптической плотности после добавления конъюгата и хромогенного субстрата. Экспериментальные данные свидетельствуют, что данный метод позволяет выявить ферентативную активность трипсина в на-нограммовых количествах.
При этом, полимерная матрица остаётся целой всилу того, что в реакционной среде отсутствуют ферменты, которые специфически её расщепляют. В случае присутствия в реакционной среде ферментов, которые могут воздействовать на полимерную матрицу, например - нуклеаз, содержащиеся в культуральной жидкости, следует учесть, что их активность не приведёт к десорбции полимера с полистироловой поверхности. Если же на наличие протеиназной активности используется ферментный препарат, содержащий и высокоактивные нуклазы, то в качестве полимерной матрицы можно выбрать другие полимеры, например, хитин. Хитиновые полимерные матрицы ранее нами были использованы для сорбции и детектирования хитин-специфических пероксидаз [5, 6]. В качестве поли© C. Н. Куликов - канд. биол. наук, доц. кафедры технологии пищевых производств КНИТУ; н.с. кафедры микробиологии К(П)ФУ; в.н.с. лаб. иммунологии и разработки аллергенов Казанского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора, [email protected].
© S. N. Kulikov - Cand. Biol. Sci., associate professor, Department of Technology of Food Production KNRTU; scientific researcher of Department of Microbiology KFU; Leading researcher, Kazan Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology at Rospotrebnadzor, [email protected].
мерных матриц может быть использован и производное хитина - хитозан, который интенсивно используется в биотехнологии в последние два десятилетия [7, 8].
Таким образом, проведённые исследования позволили создать простой способ определения IgG-протеиназной активности методом иммунофермент-ного анализа, характеризующегося хорошей воспроизводимостью результатов, высокой чувствительностью, отсутствием необходимости использовать белковые антигены, малым расходом субстрата, удобством за счёт проведения реакции непосредственно в лунках микропланшета, осуществление реакции и детекции результатов реакции в одной и той же лунке.
Работа выполнена за счёт средств субсидии, выделенной в рамках государственной поддержки Казанского (Приволжского) федерального университета в целях повышения его конкурентоспособности среди ведущих мировых научно-образовательных центров.
Литература
1. Aubaid, A.H. Partial purification and kinetic studies of exocellular proteinase from Trichophyton mentagrophytes var. Erinacei / A.H. Aubaid, T.M. Muhsin. Mycoses. -1998. - V. 41. № 3-4. - P. 163-168.
2. Brinkworth, R.I. Structural analysis of the catalytic site of AcCP-1, a cy steine proteinase secreted by the hookworm Ancylostoma caninum / R.I. Brinkworth, P.J. Brindley, S.A. Harrop. Biochim. Biophys. Acta. - 1996. - V. 1298. - № 1. -P. 4-8.
3. Зинкевич, О.Д. Клинико-диагностическое значение оценки активности IgG-протеаз у детей с дисбактерио-зом кишечника / О.Д. Зинкевич, В.М. Бондаренко, Ю.А. Тюрин, Н.А. Сафина, В.А. Анохин Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. - 2004. - № 3. - С. 73-77.
4. Пат. РФ 2373538 (2009).
5. Куликов, С.Н. Полимерные хитиновые матрицы как лиганды для пероксидаз / С.Н. Куликов, Р.М. Хайрул-лин, Р.З. Хайруллин Вестник Казанского технологического университета, - 2013. - № 7. - С. 161-163.
6. Пат. РФ 2519071 (2014).
7. Куликов, С.Н. Роль структуры в биологической активности хитозана / С.Н. Куликов, Ю.А. Тюрин, Д.А. Дол-бин, Р.З. Хайруллин Вестник Казанского технологического университета, - 2007. - № 6. - С. 10-14.
8. Хитозан / Под. ред. К.Г. Скрябина, С.Н. Михайлова, В.П. Варламова. Центр «Биоинженерия» РАН, Москва, 2013. 593 с.
