CC BY
95
НОВЫЕ МЕТОДЫ И ИНСТРУМЕНТЫ
УДК 616.72—089.845—002.1—022—07
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ В ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИЙ ПРИ ЭНДОПРОТЕЗИРОВАНИИ СУСТАВОВ
И.И. Кузьмин, И.Ф. Ахтямов, Р.И. Кузьмин, М.П. Исаева
Кафедра травматологии, ортопедии и хирургии экстремальных ситуаций (зав. — проф. И. Ф. Ахтямов) Казанского государственного университета, Приморская краевая клиническая больница, г. Владивосток, Тихоокеанский институт биоорганической
химии ДВО РАН, г. Владивосток
Имплантат-ассоциированные инфекции представляют собой серьезную проблему в ортопедической хирургии в связи с трудностью идентификации возбудителя инфекции, сложностью лечения и тяжестью последствий, которые в большинстве случаев приводят к нестабильности и удалению протеза. Выбор оптимальной стратегии лечения практически полностью определяется постановкой точного диагноза инфекционного агента, который вызвал данное инфекционное осложнение [25]. Существуют два основных источника инфицирования эндопротеза - экзогенный путь колонизации микроорганизмами поверхности имплантата во время проведения операции и эндогенный, или гематогенный, который возникает главным образом в позднем послеоперационном периоде в результате транзиторной бактериемии. Несмотря на антибиотикопрофилак-тику и улучшенную стерильную технику, частота возникновения инфекций при эндопротезирова-нии крупных суставов составляет около 1% для тазобедренного сустава и 2% для коленного сустава [19]. Тем не менее, по данным некоторых авторов [6, 21], показатели инфицирования могут быть выше за счет отсутствия чувствительных методов диагностики, что особенно касается случаев так называемого асептического расшатывания протеза.
Применение в ортопедической практике методов молекулярной биологии может значительно улучшить диагностику инфекций при эндо-протезировании и способствовать профилактике операционных осложнений или адекватному их лечению. В последнее время одним из перспективных методов молекулярной диагностики стала полимеразная цепная реакция (ПЦР). Этот метод позволяет быстро идентифицировать любых возбудителей инфекции на основании выявления специфичных для них участков генома и определять их возможную антибиотикоустойчи-вость [7, 9, 23].
Данная статья посвящена обзору методологических подходов использования ПЦР для диагностики инфекционных осложнений при эндо-протезировании тазобедренного и коленного суставов.
Принцип метода ПЦР. В основе метода лежит репликация генетического материала. С помощью пары синтетических праймеров (олигонуклеоти-дов) и фермента Taq-полимеразы происходит воспроизведение специфического фрагмента ДНК, который в последующих циклах будет служить матрицей для синтеза новых нитей ДНК. Каждый цикл состоит из трех последовательных стадий - денатурации или плавления двухцепо-чечной ДНК, отжига праймеров и комплементарного достраивания обеих цепей ДНК. В результате нескольких десятков таких циклов исходный генетический материал может быть увеличен до
детектируемого уровня, например с помощью электрофореза [17].
Постановка ПЦР состоит из нескольких этапов - пробоподготовки, амплификации и детекции продуктов амплификации. Для проведения каждого из этих этапов существует множество подходов. Выбор их определяется как биологическим субстратом, из которого должен быть выделен генетический материал, так и самим генетическим материалом - ДНК или РНК, а также клиническими задачами, стоящими перед врачом (качественный или количественный анализ, детекция и/или идентификация патогена и др.).
Преимущества ПЦР-диагностики. По сравнению с традиционными методами исследований ПЦР имеет ряд преимуществ [5, 12]. Во-первых, ПЦР характеризуется высокой чувствительностью, что позволяет выполнять анализ непосредственно на клиническом образце без предварительного культивирования микроорганизма. Чувствительность анализа составляет несколько молекул матрицы в образце. Метод позволяет "увидеть" детектируемый организм до того, как проявятся фенотипические признаки или клинические симптомы заболевания, особенно это касается патогенов с низкой скоростью роста. Во-вторых, он обладает высокой специфичностью (до 100%), поскольку объектом анализа является генотип организма. В этом случае степень специфичности будет определяться только наличием разработанных видоспецифических праймеров или возможностью проведения дополнительных молекулярных исследований (nested ПЦР, гибридизация, секвенирование). В-третьих, ПЦР отличается высокой оперативностью и возможностью полной автоматизации процесса. Скорость выявления инфекционного агента может составлять в среднем 1,5 часа. В-четвертых, ПЦР достаточно универсален и его можно проводить независимо от характера исходного материала и наличия различных возбудителей.
Несмотря на большие преимущества ПЦР перед другими методами детекции и идентификации микроорганизмов, она еще недостаточно широко используется в клинической практике, особенно в рутинных и скрининговых исследованиях [10]. В первую очередь это объясняется высокой чувствительностью анализа и, следовательно, возможностью получения ложноположитель-ных результатов. Однако данная проблема успешно преодолевается при использовании одноразового материала для забора и подготовки образца, путем внедрения флуоресцентных методов детекции продуктов ПЦР, постановки всех положительных и отрицательных контролей, хорошим качеством тест-систем, полной автоматизацией процесса.
Казанский медицинский журнал, 2004 г., том 85, № 1.
Применение метода ПЦР в эндопротезирова-нии суставов. Для эндопротезирования специфичны инфекции, связанные с колонизацией микроорганизмами имплантата, независимо от пути проникновения возбудителя, времени возникновения и выраженности клинических проявлений [1]. Эти инфекции являются наиболее сложными для диагностики и лечения, что обусловлено прежде всего патогенетическими особенностями инфекционного процесса, протекающего в анаэробных условиях при наличии абиогенного (им-плантат) и биогенного (костная ткань) материалов [2]. В связи с рядом факторов, предрасполагающих к развитию инфекции у пациентов с эн-допротезированием суставов, в частности локальной иммуносупрессии на инородное тело, показано, что основное значение приобретают условно-патогенная флора и сапрофиты [18]. Видовой состав микрофлоры при инфекционных осложнениях представлен главным образом грамполо-жительными кокками (Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis), которые составляют от 50 до 80% случаев. Около 20% случаев приходится на грамотрицательные бациллы (E.coli, Enterobacter, Serratia), а оставшиеся несколько процентов - на иную флору [20]. Эти бактерии способны колонизировать абиогенный материал, прикрепляясь к субстрату и продуцируя защитную биопленку [8]. Кроме того, они часто образуют сообщества, причем чем "старше" сообщество, тем оно разнороднее [4]. Следовательно, бактериальная популяция, находящаяся на поверх-нос-ти имплантата, является гетерогенной не только по видовому составу, но и по свойствам. Установлено, что после адгезии микроорганизмы характеризуются низкой скоростью роста, повышенной генетической нестабильностью, что вызывает появление и распространение антиби-отикорезистентности [18]. Отсюда большое значение придается профилактическим мероприятиям и методам диагностики инфекции на всех ее этапах.
Считается [21], что традиционные методы детекции бактерий, применяемые при эндопроте-зировании, не позволяют выявлять инфекцию. Это объясняется следующими специфическими причинами: во-первых, колонизацией бактериями имплантированного биоматериала в виде адгезивных пленок с крайне низкой скоростью роста популяции (в среднем выделение патогена происходит только в 2—5% случаев); во-вторых, невозможностью выделения изолятов на фоне приема антибиотиков; в-третьих, срочностью получения результатов анализа, которые могут существенно повлиять на тактику операции и лечение больного; в-четвертых, проблемами, связанными с ложноположительными результатами и контаминацией выделяемой культуры при куль-туральных методах исследования.
Скрытая инфекция является основной причиной хирургических неудач, поэтому насущной задачей стало внедрение быстрых, современных методов диагностики в эту область хирургии. Наиболее подходящим методом для детекции инфекционных агентов стал метод ПЦР. Однако главной проблемой внедрения ПЦР в ортопедическую практика была пробоподготовка - выделение генетического материала из образцов синовиальной жидкости. Высокое содержание протео-гликанов и белковых комплексов, обусловливающих вязкость данного биологического субстрата, и наличие компонентов, ингибирующих Taq-полимеразу, сильно снижали чувствительность ПЦР. Mariani et al. [14] был предложен про-
токол выделения генетического материала из синовиальной жидкости с использованием неионного детергента и кратковременным прогреванием образца, в результате которого происходили эффективный лизис клеток и денатурация белковых комплексов. Дальнейшая инкубация образца с ионообменной смолой способствовала связыванию компонентов, ингибирующих ПЦР.
Этими же авторами [15, 16] были проведены исследования синовиальной жидкости 50 пациентов с полной заменой коленного сустава методом ПЦР с применением универсальных прай-меров к 16S rRNA. Целью данного исследования было определение пределов чувствительности метода ПЦР и возможности его использования для детекции бактериальной инфекции. Для этого продукты ПЦР анализировали блотгибридиза-цией по Суазерну с ДНК пробой, содержащей участок гена 16S rRNA E.coli.
Чувствительность реакции определяли путем инокуляции в синовиальную жидкость известных концентраций 6 патогенов (Staph. aureus, E.coli, Staph. epidermidi, Streptococcus bovis, Streptococcus cigcilciclicie и Enterococcus feacalis), имеющих важное значение в ортопедической практике. Концентрационный предел составил 100 бактерий на 1 мл образца, что было достаточным для детекции ампликона электрофорезом в агарозном геле. Результаты на присутствие 16S rRNA оказались положительными у 32 пациентов, что составило 64%, при этом специфичность - 92%. В дальнейшем ретроспективно были проанализированы клинические данные этих 50 пациентов, находившихся на длительном диспансерном учете (1—2 года) после артропластики, с данными ПЦР-анализа образцов, взятых до оперативного вмешательства. Показано, что из всех ПЦР положительных пациентов у 72% обследованных были клинические симптомы инфицирования до операции, у 16% — во время операции и, следовательно, получивших соответствующее лечение. Оставшиеся 12% ПЦР положительных пациентов не имели никаких признаков инфекции, однако впоследствии у 3/4 из них развились инфекционные осложнения, которые, как предполагают авторы, явились следствием нераспознанной инфекции.
Невыявленная инфекция может стать "бомбой замедленного действия", манифестацию которой в будущем невозможно предугадать. Она же является причиной от 2 до 15 % всех операционных ревизий. Кроме того, 40% неудачных ревизий сустава — также результат инфекции [6]. Считается, что такой высокий процент обусловлен нераспознанной инфекцией при первичной ревизии, которая имеет свои патогенетические особенности, обусловленные, в первую очередь, колонизацией бактериями поверхности имплан-тата в виде биопленки. В таком состоянии бактерии, как известно, характеризуются медленным ростом и, следовательно, редко выявляются классическими методами культивирования при изъятии протеза.
Tunney et al. [22] использовали обработку ультразвуком изъятых образцов, взятых во время хирургической операции, что значительно повысило вероятность изоляции бактерий за счет разрушения адгезивной бактериальной пленки. С помощью этого подхода авторы исследовали изъятые имплантаты от 120 пациентов с тотальной ревизией тазобедренного сустава путем сравнения культивируемых (посевы) и некультиви-руемых (ПЦР и иммунофлюоресцентная микроскопия) методов. При взятии и подготовке об-
Казанский медицинский журнал, 2004 г., том S5, № 1.
разцов соблюдались асептические и анаэробные условия в сочетании с ультразвуковой обработкой имплантированного материала. Методами культивирования в анаэробных условиях удалось выделить возбудитель в 22% наблюдений, хотя обычно в таких случаях этот показатель составлял только 2—5%. Результаты ПЦР и иммунофлю-оресцентной микроскопии были положительными в 73% случаев для первого метода и в 63% случаев - для второго. При сочетании этих двух методов процент положительных результатов достигал 87,5%. Кроме того, важным результатом данной работы было выявление роли анаэробных бактерий в инфекционных осложнениях при эндопротезировании, в частности Propionibacterium acnes [22].
Определение генов 16S rRNA как индикатора присутствия бактерий служит способом выявлен-ния как патогенных, так и непатогенных бактерии. Поскольку эти гены являются мультикопий-ными, которые содержат консервативные и уникальные участки, позволяющие дифференцировать бактерии на роды и виды, они представляют собой идеальный инструмент для детекции и идентификации бактерий [13, 23]. Однако проблема использования универсальных 16S rRNA праймеров заключается, во-первых, в том, что существует вероятность получения ложноположи-тельных результатов от самих ПЦР-реактивов, в частности Taq-полимеразы, которая имеет бактериальное происхождение и может быть загрязнена ДНК E.coli. Во-вторых, для идентификации патогена необходимо дальнейшее секвенирование полученного ПЦР продукта, что далеко не всегда возможно в рамках клинической лаборатории. С этой целью Hoffel et al. [11] были разработаны специфические праймеры к небольшой подгруппе грамположительных бактерий, которые чаще всего являются причиной инфицирования имп-лантата. С помощью данных праймеров были обследованы 10 пациентов, от которых был приготовлен 21 образец. Чувствительность ПЦР по сравнению с таковой культуральных методов составила 91%, а специфичность - 100%. Однако когда обследованная группа была расширена до 63 пациентов с полной ревизией, включавшей 108 образцов, чувствительность снизилась до 71 %, а специфичность — до 49%.
Основываясь на полученных результатах, авторы посчитали метод ПЦР недостаточно чувствительным и специфичным для имплантат-ассоции-рованных и мышечно-скелетных инфекций. Однако мы полагаем, что причина заключается не в самом методе, а в выборе праймеров, которые были использованы в данной работе. Известно, что не все эти инфекции вызываются грамполо-жительными кокками, как минимум пятая их часть обусловлена грамотрицательными бактериями. Кроме того, велика роль анаэробных бактерий и грибов.
Весьма интересной является работа авторов [3], которые предлагают использовать метод ПЦР для детекции стафилококковых штаммов, продуцирующих полисахарид для образования биопленки. Следует отметить, что ПЦР может быть методом выбора при предоперационном исследовании синовиальной жидкости у больных на фоне приема антибиотиков [24].
Перспективы метода ПЦР. В последние несколько лет метод ПЦР начинает занимать одно из ведущих мест в современной лабораторной практике, что связано с его большими преимуществами: быстротой, простотой исполнения, высокой чувствительностью и специфичностью.
Этот метод успешно применяется для определения генетических маркеров антибиотикорезистент-ности. Ахиллесовой пятой ПЦP является ее высокая чувствительность, что способствует появлению ложноположительных результатов. Тем не менее в связи с бурным развитием метода ПЦP появляются его модификации, позволяющие учитывать результаты реакции с помощью флюоресцентных зондов и праймеров. Благодаря современным технологиям можно не только полностью автоматизировать этот процесс, но и проводить количественную оценку ампликона для расчета исходного количества матрицы в образце (ПЦP в реальном времени). Следовательно, с помощью данного метода можно будет осуществлять мониторинг инфекции на предоперационном, во время операции и послеоперационном этапах ведения больного, а также отслеживать процесс лечения. Своевременное выявление инфекции позволяет предупредить генерализацию процесса и развитие сепсиса, который особенно остро протекает при нозокоминальной грамот-рицательной микрофлоре, а также предотвратить развитие нагноений при таких сложных операциях, как эндопротезирование крупных суставов.
ËÈTEPATÔPA
1. Емельянов В.Г., Денисов Ф.Г., Куляба Т.Л. Съезд травматологов-ортопедов Poссии, 6-й: Тез. докл. - Н. Новгород, 1997. - С. 485.
2. Кузьмин И.И. // Вестн.травматол. и ортопед. - 2000. -№. 4. - С. 67—71.
3. Arciola C.R., Collamati S. et al.// Diagn. Mol. Pathol. -2001. - Vol. 10. - P. 130—137.
4. Bayers R.J., Cox A.J., Freemann A. // J. Curr. Orthop. -2000. - Vol. l4. - P. 243 - 249.
5. Cha R.S., Thilly W.G. // PCR Methods Applied. - 1993.— Vol. 3. - P. 18—29.
6. Dupont J.A.//Clinical Orthop.-1986 —Vol 211.-P. 122—127.
Z. Fluit A.D„ Visser M.R., Schmitz F-J.// Clin.Microbiol.
Rev.— 2001. - Vol. 14. - P. 836—871.
8. Gristina A.G. // Science. - 1987. - Vol. 237. - P. 1588—1595.
9. Gurtler V., Stanisich V.A. // Microbiology. - 1996. -Vol. 142. - P. 3—16.
IG. Harrison T.J.//Clin. Pathol.—1998.—Vol. 51.—P. 491—492.
11. Hoffel D.P., Hinrichs S.H., Garvin K.L.// Clin. Orthop. and Rel. Res. - 1999. - Vol. 360. - P. 37—46.
12. Klapper P.E., Jungkind D.L. // Clin. Chemist.. - 1998.— Vol.44.—P. 1737—1739.
13. Marchesi J.R., Sato T. et al.// Appl. Environ.Microbiol.— 1998. - Vol. 64. - P. 795—799.
14. Mariani B.D., Levine V.J. et al.// Mol. Biotechnol. -1995. - Vol. 4. — P. 227—237.
15. Mariani B.D., Martin D.S. et al.// Clin. Orthoped. and Rel. Res. - 1996. - Vol. 331. - P. 11- 22.
16. Mariani B.D., Tuan R.S. // Mol. Med. Today. - 1998. -P. 207—213.
I Z. Sambrook J., Russell D. W. // Mol. Clon. A Laborat. Man.— N.- Y., 2001. - Vol. 2.- P. 8.1—8.126.
18. Schierholz J.M., Beuth J.// J. of Hospital Infect.— 2001. -Vol. 49. - P. 87—93.
19. Spangehl M.J., Younger A.S.// Instruct. Course Lecture. -
1998. - Vol. 47. - P. 285—295.
2G. Tattevin P., Cremieux A.C. et al.// Clin. Infect. Dis. -
1999. - Vol. 29. - P. 292— 295.
21. Tunney M.M., Patrick S. et al. // Methods in Enzymol. -1999. - Vol.l0. - P. 566—576.
22. Tunney M.M., Patrick S. et al.// J. of Clin. Microbiol. -1999. - Vol. 37. - P. 3281—3290.
23. Wilson K.H., Blitchington R.B., Greene R.C.// J. Clin. Microbiol. - 1990. - Vol. 28. - P. 1942— 1946.
24. Yin C., Jiranek W., Cardea J. 47th Annual Meeting Orthopedic Research Society.- San Francisco, 2001. - P. 1065.
25. Zimmerli W., Ochsner P.E.//Infection. - 2003. - Vol. 31. -P. 99—108.
Поступила 09.01.03.19.
