CC BY
86
Е. И. Шишацкая, Т.Г. Волова
Полигидроксиалканоаты как матрикс в клеточных технологиях
Институт биофизики СО РАН,
Красноярск, Россия shishatskaya@inbox.ru
E.I. Schischatskaya, T.G. Volova Polihidroxyalcanoates as a scaffolds in cell technologies
Необходимость адекватного носителя для клеток для реализации стратегий тканевой инженерии не вызывает сомнений. Материалами для создания таких носителей могут быть металлы, натуральные и синтетические кальций-фосфаты, керамики, полимеры, а так же их различные композиции. Особенности строения стромы каждой воспроизводимой ткани или органа диктуют свои требования к материалу, из которого готовится такой каркас — строма — «scaffold». Фи-зико-механичекие свойства сырья должны позволять обрабатывать его определенным образом и получать конструкции с заданной геометрией, эластичностью, гибкостью, прочностью и др. Полимерные материалы благодаря своим свойствам занимают здесь заслуженное место. Однако полимеры, претендующие на роль искусственного внеклеточного матрикса, обязаны соответствовать ему и по биологическим свойствам — быть биосовместимыми, и в идеале, биодеградируемыми — что бы по прошествии необходимого периода времени уступить место новообразованным живым тканям.
Для этой цели мы изучили возможность использования полигидроксиалканоатов (ПГА) — линейных полиэфиров микробного происхождения, российского производства, имеющих торговую марку «БИОПЛАС-ТОТАН» — аналогов зарубежных Biopol®, Biopol™, Mirel™, TephaFLEX™, DegraPol/btc®, Nodax™. Это новый класс термостабильных, механически прочных, биосовместимых и биорезорбируемых полиэфиров.
Материал и методы. Исследованы образцы ПГА, полученные в Институте биофизики СО РАН. Полимеры синтезированы бактериями Ralstonia eutropha В5786. Исследованы полимер р-гидроксимасляной кислоты (полигидроксибутират, ПГБ) молекулярная масса 340 кДа, кристалличность 72%, температура плавления 170°С) и сополимеры полигидроксибути-рата и полигидроксивалерата (ПГВ) с включением ПГВ 5^30 мол%, молекулярная масса 120^240 кДа, кристалличность 56^64%, температура плавления 152^ 160°С. Химическую структуру образцов и наличие микропримесей определяли после предварительного метанолиза проб по метиловым эфирам ЖК на хрома-томасс-спектрометре GCD plus (Hewlett Packard, США). Плоские пленочные матриксы получали методом полива раствора полимеров. Пористые пленки (мембраны) получали с использованием техники выщелачивания. Ультратонкие волокна получены методом электростатического формования, с источником постоянного высокого напряжения до 30 кВ. Определяли толщину и поверхностные характеристики пленок. Объемные плотные и пористые матриксы конструировали из собственно ПГА и в композиции с другими материалами, прямым холодным прессованием под давлением до 127,2 кгс/см2, коллагеновой губки пропитывали полимерными растворами. Микроструктуру всех матриксов анализировали с использованием сканирующей электронной микроскопии.
Оценку биосовместимости разработанных конструкций проводили с использованием стандарта ИСО 10 993. Цитотоксичность исследовали а фиброблас-тах мыши NIH ЗТЗ, первичных культурах гепатоцитов и эндотелиоцитах печени мыши, а также культуре остеобластоподобных клеток, полученных ведением ММСК костного мозга крыс в остеогенной среде. Оценивали морфологию клеток, их жизнеспособность, пролиферативную активность по тесту-МТТ (Sigma, США) и по включению меченого радионуклидами предшественника синтеза ДНК, 3Н-тимидина. Для изучения пригодности матрикса для костной ткани проведены тесты с остеобластоподобными клетками in vitro и эксперименты in vivo с использованием объемных матриксов из ПГБ, ПГБ/ГАП, ПГБ/коллаген, засеянных остеобластоподобными клетками. После 10 сут. культивирования проводили ММТ-тест и определяли активность щелочной фосфатазы (ЩФ) в реакции с пара-нитрофенолфосфатом. В тесте сегментарной остеотомии с заполнением дефектов имплантатами разных типов, изготовленных из ПГБ, композита ПГБ-80%/гидроксиапатит-20%, и ПГБ с рекомбинантным костным морфогенетическим белком человека (rhBMP-2, ProSpec-Tany TechnoGene Ltd, Израиль). Состояние тканей оценивали при окрашивании препаратов гематоксилином и эозином, проводили морфо-метрию с применением поляризационного микроскопа проходящего света Axioskop 40 Pol. (Karl Zeiss) с AxioCam MRc-5. В качестве материалов сравнения использовали коммерческие композит «гидроксиапа-тит/коллаген» и препарат аллокости.
Результаты. Исследования полученных матриксов в виде пленок и мембран показало, что они обладают высокой биосовместимостью по отношению к культивируемым клеткам. Фибробласты мыши линии NIH ЗТЗ хорошо адгезировались к поверхности полимерных матриксов из ПГБ и сополимеров. Количество клеток, адгезированных на поверхности матриксов после стерилизации, также было сопоставимо с контролем (стекло, полистерин). Морфология культивируемых клеток не отличалась от таковой в контроле. Оценка жизнеспособности клеток по прижизненному окрашиванию трипановым синим показала, что 99,8+0,2% клеток при прямом контакте с ПГБ и ПГБ/ПГВ не включали краситель, то есть сохраняли жизнеспособность. При анализе синтеза ДНК клетками в эксперименте и контроле, не обнаружено снижения включения 3Н-ти-мидина ядрами всех типов клеток, соответственно, ингибирования синтеза (фибробластов, гепатоцитов и клеток эндотелия) по сравнению с контролем. Культивирование фибробластов и гепатоцитов в течение 3 сут. на поверхности данных матриксов не влияло на время генерации клеток и синтез белка. Отмечено, что количество пролиферирующих остеобластоподобных клеток на экспериментальных матриксах, сравнимо с контролем (полистерин), и было достоверно выше на всех образцах композита ПГБ/ГАП по сравнению с чистым ПГБ. Наибольший прирост клеток зафиксирован на образцах композита с содержанием гидроксиапа-тита 10 и 20%, соответственно, 240^260x108. Та же тенденция была характерна для активности щелочной
x
Результаты опыта сегментарной остеотомии показали, что в присутствии имплантатов из ПГА происходит новообразование костной ткани в порах матрикса на фоне его постепенной резорбции, а «качество» ткани во многом оценено как лучшее по сравнению с конт-
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, 1У< 3, 2010
рольными материалами, по структуре и организации. Этот факт объясняется хорошими барьерными свойствами экспериментальных матриксов, препятствующих прорастанию в зону дефекта рыхлой соединительной ткани, что способствовало костеобразованию, а также хорошими биосовместимыми свойствами материалов по отношению к остеобластам клеткам.
Исследованный биоматериал обладает выраженными остеопластическими свойствами, медленно, адекватно росту новой костной ткани деградирует in vivo, постепенно замещается ею, обеспечивая нормальное протекание репаративного остеогенеза. Показана возможность получения плоских и трехмерных матриксов разных типов и их пригодность для выращивания клеток in vitro. Таким образом, мы можем заключить, что «БИОПЛАСТОТАН» может быть использован в качестве клеточного носителя в современных восстановительных технологиях.
Е.А. Щепкина 1 3, П.В. Кругляков а, Л.Н. Соломин 1,
А.Ю. Зарицкий 3, В.А. Назаров 1, Р.М. Тихилов 1,
Д.Г. Полынцев а
Возможности оптимизации репаративного остеогенеза путем трансплантации аутогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на деминерализованном костном матриксе при лечении ложных суставов трубчатых костей (результаты ограниченных клинических исследований)
1 ФГУ «РНИИТО им. P.P. Вредена Росмедтехнологий», Санкт-Петербург, Россия
2 ООО «Транс-Технологии», Санкт-Петербург, Россия
3 ГОУ ВПО «СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова Росздрава», Санкт-Петербург, Россия reposition@yandex.ru
Е.А. Shchepkina, P.V. Kruglyakov, L.N. Solomin, A.Yu. Zaritsky, V.A. Nazarov, R.M. Tythylov, D.G. Polyntsev Opportunities of reparative osteogenesis optimization by transplantation of autologous mesenchymal stem cells on demineralized bone matrix in long-bone non-unions treatment (results of limited clinical studies)
Потенциальные возможности мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) к остеогенной дифференцировке определяют высокий интерес к исследованиям по их применению для оптимизации репаративных процессов в костной ткани. На основе экспериментальных исследований (Кругляков П.В. и соавт., 2005), в которых было получено костеобразование в заселенном сингенными мезенхимальными стволовыми клетками деминерализованном костном трансплантате при замещении костных дефектов, нами разработан способ лечения ложных суставов (патент РФ № 2309756).
Целью клинического исследования являлось сравнение процессов костной репарации при лечении ложных суставов бедренной и большеберцовой костей предложенным способом и при использовании деминерализованного костного трансплантата (контрольная группа).
Аутогенные ММСК выделяли из костного мозга пациента. Путем пункции подвздошной кости забирали 15^30 мл костного мозга, фракционировали методом центрифугирования на фиколле. Отобранную мононук-леарную фракцию отмывали питательной средой DMEM.
После центрифугирования клеточный осадок помещали в среду культивирования, содержащую ОМЕМ и 20% сыворотки эмбрионов коров. Клетки культивировали в монослое, пересевая каждые 7 сут., охаракте-ризовывали по фенотипу С034~, С045~, СС)44 + , С090+, С0105+, С0106 + . Фенотипирование проводили после второго пересева культуры и перед подготовкой биотрансплантата. При подготовке биотрансплантата ММСК заселяли на деминерализованные костные аллотрансплантаты (ДКТ) с плотностью 7^ 10 млн на 1 см3. Подготовленные трансплантаты использовали для костной пластики после резекции ложного сустава и открытой адаптации фрагментов. Во всех случаях применяли чрескостный остеосинтез. Аппараты внешней фиксации демонтировали после проведения клинической пробы при рентгенологической картине консолидации. Дополнительной иммобилизации после демонтажа аппаратов внешней фиксации не применяли. По предложенному методу оперировано 15 пациентов в возрасте от 25 до 59 лет с ложными суставами бедренной и большеберцовой костей. Сравнение процессов костной репарации и результатов лечения проведено в 2-х группах больных: 10 пациентов лечились по предложенному методу, и у 10 больных произведена костная пластика деминерализованным костным трансплантатом без заселения МСК. Рентгенографию и компьютерную томографию (КТ) выполняли раз в месяц.
Сроки демонтажа аппарата внешней фиксации в основной группе соответствовали срокам сращения переломов (18,9+4,7 нед. (р<5%) и были в 1,7 раза меньше, чем в контрольной группе (32,85+2,03 нед. (р<2,3%). При анализе данных рентгенологического исследования и компьютерной томографии в случаях применения трансплантатов, заселенных аутогенными ММСК, отмечены следующие особенности: сращение происходило преимущественно через костный трансплантат, в котором быстрее происходило образование компактной кости; в трансплантате отмечено формирование очагов остеогенеза с последующим их слиянием; отсутствовала выраженная периостальная мозоль; выявлено формирование костномозгового канала на всем протяжении костной мозоли и области костной пластики в сроки от 6 мес. до 4 лет; плотность трансплантатов сохранялась более высокой, чем в прилежащих участках костных фрагментов в отдаленном периоде. В контрольной группе рентгенография и компьютерная томография показали постепенное замещение трансплантата костной тканью со стороны костных фрагментов; отмечено формирование выраженного периостального компонента костной мозоли, которая сохраняется и в отдаленном периоде; восстановления костномозгового канала не отмечено в сроке до 4-х лет.
Заселенный ММСК деминерализованный костный аллотрансплантат проявляет как остеоиндуктивные, так и остеокондуктивные свойства, в нем формируются самостоятельные очаги остеогенеза, в более ранние сроки начинает восстанавливаться структура кости как органа с формированием костномозгового канала. Сокращение сроков фиксации, соответствующих достижению консолидации в области ложного сустава, по сравнению с контрольной группой в 1,7 раза свидетельствует о целесообразности дальнейших исследований по применению ММСК на деминерализованном костном матриксе при лечении ложных суставов с последующим внедрением в клиническую практику.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 3, 2010
