Полезный приспособительный результат деятельности нитроксидергической системы под влиянием фуроксанов Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Физиология

УДК 612.1 + 615.2

© 2011 Р.Г. Каримова, Т.В. Гарипов

ПОЛЕЗНЫЙ ПРИСПОСОБИТЕЛЬНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ НИТРОКСИДЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ПОД ВЛИЯНИЕМ ФУРОКСАНОВ

Изучен полезный приспособительный результат нитроксидергической системы у белых нелинейных крыс на нагрузку Ь - аргинином и препаратами фуроксаного ряда. Установлено, что фуроксаны в малых дозах повышают концентрацию метаболитов оксида азота в крови, а в больших - снижают.

Ключевые слова: оксид азота, нитроксидергическая система, фуроксаны

Нитроксидергическая система принимает участие в регуляции деятельности сердца, сосудов, иммунной системы, мышц и других структур организма. Полезным приспособительным результатом деятельности нитроксидергической системы является поддержание оптимальной для метаболизма концентрации оксида азота в крови и тканях органов. Оксид азота (N0) является молекулой с периодом полужизни не более 30 с. Установлено, что оксид азота может запасаться в двух разных клеточных депо: в форме динитрозильных комплексов железа и нитрозотиолов. N0 может высвобождаться из них с различной кинетикой в ответ на различные стимулы. Окисление же N0 кислородом приводит к образованию нитратов и нитритов, из которых оксид азота может восстанавливаться за счет нитритредуктазной реакциии [5, 6].

В связи с этим целью наших исследований являлось определение концентрации нитрозо-тиолов, а также нитратов и нитритов в плазме крови как показателя активности нитроксидер-гической системы животных.

Материалы и методы. Исследования проведены на 60 белых нелинейных крысах обоего пола живой массой 220-250 г. Исследования по изучению полезного приспособительного результата нитроксидергической системы проведены в три этапа. На первом этапе изучено состояние системы оксида азота в зависимости от пола и возраста животного. На втором этапе экспериментов установлена наиболее выраженная ответная реакция организма на нагрузку Ь-аргинином (физиологическим донором оксида азота) в дозах 20, 500, 1000 мг/кг. На третьем этапе изучена ответная реакция самцов и самок крыс на нагрузку соединениями фу-роксанового ряда: смеси 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана, 5,7-дихлор-6-

нитробензофуроксана и 5,7-дихлор-4-нитробензофуроксана (тримиксан); 4-хлор-6,7-фуроксанобензофуразана (хлофузан); 5,7-бис(4-гидроксифениламино) - 4,6-динитробензо-фуроксан (фениксан) в дозах 1, 5, 10 мг/кг.

Состояние нитроксидергической системы определяли через два часа после введения исследуемых соединений по количеству метаболитов оксида азота — нитратов и нитритов в

плазме крови [2]. Содержание активных метаболитов оксида азота оценивали по содержанию Б-нитрозотиолов. Статистическую обработку результатов эксперимента проводили с использованием критерия Стьюдента.

Результаты исследований и обсуждение. Суммарное количество нитрит- и нитрат-анионов в плазме крови половозрелых самок в 1,1 раза превышает таковое у половозрелых самцов (37,52±0,16 мкмоль/л против 34,41±0,21 мкмоль/л, Р<0,0001). В то же время у крыс в возрасте более 1,5 лет содержание метаболитов оксида азота достоверно ниже (в 1,2 раза) и составляет 30,02±0,52 мкмоль/л (Р<0,0001). Результаты наших исследований согласуются с сообщением Шимановского Н.Л., Гуревича К.С. (2000), установившими аналогичную разницу в содержании нитрит- и нитрат- анионов у людей, что связано с угнетением активности КО-синтаз с возрастом.

Количество нитрозотиолов в плазме крови белых крыс также зависит от пола и возраста животного. Так, этот показатель у самок белых крыс в 1,8 раз выше чем у самцов (3,43±0,26 мкмоль/л против 1,89±0,34 мкмоль/л, Р=0,007). В крови крыс старше 1,5 лет содержание нитрозотиолов составляет 0,85±0,04 мкмоль/л, что в 3,13 раза ниже (Р=0,002) среднего значения у половозрелых крыс и положительно коррелирует с содержанием нитрат и нитрит-анионов (г=1, р=0,00001). По-видимому, извлечение оксида азота из депо у старых животных осуществляется по нитрит- или нитратредуктазному механизму, поскольку депонирование в виде нитрозотиолов снижено в 3,13 раз, тогда как содержание нитратов и нитритов меньше только в 1,2 раза. Также можно сделать предположение о преобладании депонирования оксида азота в виде нитрозотиолов у самок в отличие от самцов, где разница в содержании нитрозотиолов составляет 44,9 %, а нитратов и нитритов - только 8,3 %.

Нагрузка Ь-аргинином в дозе 20 мг/кг сопровождается повышением концентрации метаболитов оксида азота с 35,28±0,62 мкмоль/л до 59,04±1,8 мкмоль/л (Р<0,00001). Концентрация нитрат и нитрит-анионов сохранялась на этом уровне в течение двух часов, а затем снижалась до исходного уровня. На Ь-аргинин в дозе 500 мг/кг организм проявляет тенденцию к увеличению продукции оксида азота, но достоверного изменения не возникает (38,83±1,85 мкмоль/л). На нагрузку Ь-аргинином в дозе 1000 мг/кг организм отвечает снижением концентрации нитрит и нитрат-анионов до 28,01±0,8 мкмоль/л (Р<0,0001).

Малые дозы Ь-аргинина (20 мг/кг) способствуют повышению образования оксида азота в организме, что проявляется повышением плазменной концентрации нитратов и нитритов, а высокие дозы (1000 мг/кг) оказывают обратный эффект. Снижение концентрации нитратов и нитритов при этом предположительно связано с увеличением концентрации асимметричного или симметричного диметиларгинина. Следовательно, образования N0 снижается или за счет конкурентной блокады КО-синтазы асимметричным диметиларгинином, или за счет ограничения транспорта Ь-аргинина как субстрата N0-синтазы в клетку симметричным диметиларгинином [3].

На нагрузку Ь-аргинином в дозе 20 мг/кг организм отвечает увеличением концентрации нитрозотиолов с 2,66±0,40 мкмоль/л до 15,1±0,4 мкмоль/л (Р<0,00001), в дозе 500 мг/кг проявляется тенденция к увеличению продукции оксида азота, без достоверного изменения (1,89±0,34 мкмоль/л). Увеличение нагрузки в 2 раза (1000 мг/кг) вызывает обратный эффект — снижается концентрация нитрозотиолов до 0,78±0,02 мкмоль/л (Р=0,01).

Малые дозы Ь-аргинина (20 мг/кг) способствуют повышению содержания нитрозотиолов в 5,67 раз, тогда как концентрация нитратов и нитритов повышается только в 1,67 раз. Этот факт свидетельствует о депонировании образовавшегося оксида азота путем реакции N0 с цистеиновыми остатками субъединиц гемоглобина или же N0 с другими тиолсодержащими молекулами (цистеин, глутатион) [1].

Поступление в организм Ь-аргинина в высоких дозах (1000 мг/кг) способствует снижению концентрации нитрозотиолов в большей степени, чем нитратов и нитритов. Так, содержание нитрозотиолов снижается в 3,41 раза (Р=0,01), а суммарное количество нитрит- и нитрат-анионов - в 1,26 раз (Р<0,00001). Это объясняется снижением количества депонированного оксида азота при угнетении активности N0-^^^.

Нагрузка организма крыс соединениями фуроксанового ряда сопровождалась дозозависимым изменением функциональной активности системы оксида азота. При введении исследуемых соединений в дозе 10 мг/кг содержание нитрат и нитрит-анионов в плазме крови снижается, а введение фуроксанов в дозе 5 и 1 мг/кг способствует повышению концентрации метаболитов оксида азота.

Нагрузка тримиксаном в дозе 10 мг/кг сопровождалась снижением продукции оксида азота в 1,2 раза по сравнению с исходным уровнем (30,09±0,67 мкмоль/л против 36,19±0,21 мкмоль/л, Р<0,0001), нагрузка хлофузаном в аналогичной дозе снижала концентрацию нитратов и нитритов в плазме крови в 1,1 раза (31,77±1,01 мкмоль/л против 35,54±0,21 мкмоль/л, Р<0,05), а нагрузка фениксаном - в 1,2 раза (29,96±1,36 мкмоль/л против 35,02±0,53 мкмоль/л, Р<0,01). Суммарное количество нитрат- и нитрит-анионов возвращалось в норму через 4 часа после введения исследуемых соединений.

Нагрузка тримиксаном в дозе 5 мг/кг сопровождалась повышением концентрации метаболитов оксида азота в плазме крови крыс в 1,1 раза (39,56±0,9 мкмоль/л против 35,67±0,48 мкмоль/л, Р<0,0001). Внутрижелудочное введение фениксана в аналогичной дозе повышает концентрацию оксида азота в 1,7 раза (59,06±0,72 мкмоль/л против 34,71±1,12 мкмоль/л, Р<0,000001), а введение хлофузана не вызывает достоверных изменений в содержании N0 в плазме крови белых крыс (36,88±2,12 мкмоль/л против 35,8±1,82 мкмоль/л). Возвращение концентрации оксида азота к исходному уровню происходит через 4 часа при нагрузке тримиксаном и через 6 часов при нагрузке фениксаном.

Нагрузка тримиксаном в дозе 1 мг/кг сопровождалась повышением продукции оксида азота в 1,6 раз (57,61±2,57 мкмоль/л против 36,19±0,36 мкмоль/л, Р<0,0001) по сравнению с исходным уровнем, нагрузка хлофузаном в аналогичной дозе увеличила количество нитратов и нитритов в плазме крови в 1,1 раза (39,69±1,57 мкмоль/л против 35,54±0,59 мкмоль/л, Р<0,05), а нагрузка фениксаном - в 2,7 раз (95,003±1,306 мкмоль/л против 35,02±0,53 мкмоль/л, Р<0,0000001).

Концентрация метаболитов оксида азота в плазме крови через 4 часа после поступления хлофузана в дозе 1 мг/кг в желудок составляет 36,66±1,37 мкмоль/л, что свидетельствует о возвращении активности системы оксида азота на исходный уровень. Содержание нитратов и нитритов в крови через 4 часа после поступления в организм фениксана в дозе 1 мг/кг — 59,04±1,8 мкмоль/л, через 6 часов — 46,4±1,17 мкмоль/л, через 8 часов — 35,67±0,48 мкмоль/л. Следовательно, повышенная концентрация оксида азота после введения фениксана в желудок белых крыс сохраняется в плазме крови в течение 6 часов.

Поступление тримиксана в дозе 1 мг/кг в организм оказывает стимулирующее влияние на систему оксида азота на том же уровне, что и Ь-аргинин, но носит более длительный характер. Фениксан (1 мг/кг) оказывает более высокий стимулирующий эффект на систему оксида азота, чем Ь-аргинин и этот эффект сохраняется более длительное время.

Содержание нитрозотиолов в плазме крови крыс после нагрузки соединениями фурокса-нового ряда изменяется в зависимости от дозы: снижается при введении высоких доз соединений (10 мг/кг) и повышается при поступлении в организм низких доз соединений (1 мг/кг).

После введения тримиксана в дозе 10 мг/кг отмечается тенденция к снижению продукции оксида азота по сравнению с исходным уровнем (1,68±0,41 мкмоль/л против 2,66±0,4 мкмоль/л), нагрузка хлофузаном в аналогичной дозе снижала концентрацию нитрозотиолов в плазме крови в 3,28 раза (0,81±0,01 мкмоль/л против 2,66±0,4 мкмоль/л, Р=0,001), а нагрузка фениксаном - в 1,77 раза (1,5±0,26 мкмоль/л против 2,66±0,4 мкмоль/л, Р<0,05). Возвращение концентрации нитрозотиолов в норму отмечалось через 4 часа после введения исследуемых соединений (рис. 1).

с? 4 "

§.5 « £

0,5 -----------1---------1---------1---------1----------1

® 1 Время после введения соединений, ч *

Рис. 1. Содержание нитрозотиолов в плазме крови белых крыс при поступлении в организм фуроксанов в дозе 10 мг/кг:

1- тримиксан, 2 - хлофузан, 3 - фениксан

При нагрузке тримиксаном и фениксаном в дозе 5 мг/кг концентрация нитрозотиолов в плазме крови крыс достоверно не изменялась, отмечалась лишь тенденция к повышению ее (с 2,47±0,43 мкмоль/л до 3,04±0,52 мкмоль/л и с 2,47±0,43 мкмоль/л до 2,66±0,4 мкмоль/л соответственно). Введение в организм хлофузана сопровождалось повышением содержания нитрозотиолов плазмы крови в 1,54 раза (3,81 ±0,47 мкмоль/л против с 2,47±0,43 мкмоль/л до введения).

Восстановление концентрации нитрозотиолов происходит через 4 часа при нагрузке тримиксаном (2,85±0,34 мкмоль/л) и фениксаном (2,47±0,26 мкмоль/л) и через 6 часов при нагрузке хлофузаном (2,66±0,4 мкмоль/л). Через 4 часа после введения хлофузана содержание нитрозотиолов достоверно выше в 1,38 раз по сравнению с исходным (3,42±0,26 мколь/л против 2,47±0,43 мкмоль/л, Р<0,05).

1=} нр 5 1 ч

п о

нн 4

а сз

& ей

н о

X с

<и !=Г к 2 Р Л з

о о п $

м о Он

1—1 1

5 1,5

0 1 2 3 4 5 6 7

Время после введения соединений, ч

Рис. 2. Содержание нитрозотиолов в плазме крови белых крыс при поступлении в организм фуроксанов в дозе 5 мг/кг:

1- тримиксан, 2 - хлофузан, 3 - фениксан

Нагрузка тримиксаном в дозе 1 мг/кг сопровождалась повышением депонированного оксида азота в 2,22 раза (5,91±0,4 мкмоль/л против 2,66±0,4 мкмоль/л, Р<0,0005) по сравнению с исходным уровнем, нагрузка хлофузаном в аналогичной дозе увеличило количество нитрозотиолов в плазме крови в 2,87 раза (7,63±0,58 мкмоль/л против 2,66±0,4 мкмоль/л, Р=0,0001), а нагрузка фениксаном - в 1,72 раза (4,57±0,4 мкмоль/л против 2,66±0,4 мкмоль/л, Р<0,01).

Концентрация нитрозотиолов в плазме крови через 4 часа после поступления хлофузана в дозе 1 мг/кг в желудок составляет 4,19±0,8 мкмоль/л, а через 6 часов - 2,66±0,4 ч мкмоль/л, что свидетельствует о возвращении активности системы оксида азота на исходный уровень. Содержание нитрозотиолов в крови через 4 часа после поступления в организм фениксана в дозе 1 мг/кг составляет 3,04±0,52 мкмоль/л, через 6 часов — 2,47±0,26 мкмоль/л.

^ 0 1 2 3 4 5 6 7

Время после введения соединений, ч

Рис. 3. Содержание нитрозотиолов в плазме крови белых крыс при поступлении в организм фуроксанов в дозе 1 мг/кг:

1- тримиксан, 2 - хлофузан, 3 - фениксан

Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что все изученные соединения (в дозе 1 мг/кг) способствуют повышению концентрации нитратов и нитритов в плазме крови, а, следовательно, и образованию оксида азота в организме. Следовательно, они являются экзогенными спонтанными донорами оксида азота, т. е. для выделения NO не требуется взаимодействие с ферментами. Известно, что фуроксаны генерируют NO при реакции с тио-лами (Feelisch et al., 1992; Medana et al., 1994) или другими нуклеофилами (Sorba et al., 1997), причем важную роль в активации продукции NO играют внутриклеточные тиолы. Первым этапом деградации фуроксанов является атака тиолят-анионом по положениям 3 и (или) 4, приводящая к дезароматизации цикла, что обеспечивает возможность его раскрытия с последующим высвобождением оксида азота [4]. Наибольшую NO-донорскую активность проявляет фениксан, что предположительно связано с наличием нитро- и гидрокси-групп в молекуле соединения. Хлофузан и тримиксан являются хлорзамещенными бензофуроксана и активируют нитроксидергическую систему в меньшей степени, причем наименьшую NO-донорскую активность проявляет хлофузан, который содержит только одну фуроксановую группу и не содержит нитрогруппы в молекуле в отличие от тримиксана, где присутствуют NO2 группы. Следовательно, нитрозамещенные бензофуроксана активируют нитроксидерги-ческую систему в большей степени, чем хлорзамещенные. Такая же зависимость была выявлена и при введении в организм изучаемых соединений в дозе 5 мг/кг.

Высокие дозы фуроксанов вызывали обратный эффект - аналогичный высоким дозам L-аргинина - снижали концентрацию нитратов и нитритов в плазме крови. Это говорит о том, что активность нитроксидергической системы саморегулируется и фактором регуляции служит NO. Повышение концентрации оксида азота снижает активность NO-синтаз предположительно за счет синтеза конкурентного ингибитора - АДМА. При этом не отмечается зависимость ответной реакции нитроксидергической системы от вида вводимого соединения (плазменная концентрация нитратов и нитритов снижалась в 1,1-1,2 раза).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ванин А.Ф. Динитрозильные комплексы железа и S-нитрозотиолы - две возможные формы стабилизации и транспорта оксида азота в биосистемах // Биохимия. 1998. T.63. Вып. 7. C. 924-938.

2. Веремей И.С. Восстановление NO3 в NO2 цинковой пылью в присутствии аммиачного комплекса сульфата меди. / И.С. Веремей, А.П. Солодков // Сборник научных трудов. Витебск, 1999. С. 274-277.

3. Гилинский М. А. Эндогенная регуляция биодоступности оксида азота. Клинические корреляты и подходы к анализу / М. А. Гилинский, Е. Ю. Брусенцев // Бюллетень Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук. 2007. №3. С.109-115.

4. Граник В.Г. Кислород- и серусодержащие гетероциклические соединения - доноры оксида азота и ингибиторы NO-синтаз / Химия и биологическая активность синтетических и природных соединений, «Кислород- и серусодержащие гетероциклы», Т. 1 / Под ред. д-ра хим. наук В.Г. Карцева. М.: IBS PRES, 2003. 500 с.

5. Реутов В.П. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих / В.П. Реутов [и др.]. М., 1997.

6. Evans R.G. Nitric oxide and superoxide in the renal medulla: a delicate balancing act / R.G Evans, S.M. Fitzgerald / Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2005. Т. 14. Р.9-15.