CC BY
22
УДК 616-001.17
ПОКАЗАТЕЛИ АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМЕ В УСЛОВИЯХ ПРИМЕНЕНИЯ ТРАНСДЕРМАЛЬНОЙ ПЛЕНКИ С ЭРИТРОПОЭТИНОМ
М.В. Осиков, Е.В. Симонян, О. Т. Саедгалина, Е.В. Листик, Е.Ю. Ванин
ФГБОУ ВО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Челябинск, Россия
Аннотация. Дисфункция локального и системного иммунитета при термической травме (ТТ) приводит к системным (сепсис, полиорганная недостаточность) и местным (присоединение инфекции, образование патологических рубцов и др.) осложнениям. Одним из механизмов иммунной дисфункции при ТТ может выступать гибель лимфоцитов. Особое внимание при ведении ожогов уделяется местному консервативному лечению под повязками, в состав которых могут входить различные группы веществ, в том числе с иммунокоррегирующим действием, например, эритропоэтин, плейотропные эффекты которого продемонстрированы при различной патологии. Цель работы - исследовать влияние применения трансдермальной пленки с ЭПО на количественный состав и показатели гибели лимфоцитов в периферической крови в динамике экспериментальной ТТ. Эксперимент выполнен на 60 белых нелинейных крысах массой 250±20 г. ТТ IIIA степени и площадью 4% моделировали погружением участка межлопаточной области крысы в воду с температурой 98-990 С на 12 с. Исследования проводили на 5 и 14 сутки. Количество лимфоцитов в крови определяли с помощью гематологического анализатора «Medonic - M 16» (Швеция). Маркеры гибели лимфоцитов определяли на проточном цитофлуориметре «Navios» («BeckmanCoulter», США). Установлено, что при ТТ количество лимфоцитов в крови значимо не изменяется на 5 сутки и снижается на 14 сутки эксперимента. Количество клеток с ранними признаками апоптоза увеличивается на 5 сутки эксперимента и статистически не изменяется на 14 сутки ТТ. Содержание лимфоцитов с поздними признаками апоптоза, признаками некроза увеличивается на 5 и 14 сутки эксперимента. Применение ТДП при ТТ не приводит к статистически значимым изменениям количества лимфоцитов в периферической крови на 5 и 14 сутки эксперимента. На 5 сутки количество интактных клеток, клеток с ранними признаками апоптоза, с поздними признаками апоптоза статистически значимо не изменяется, а на 14 сутки ТТ - снижается. Применение ТДП с ЭПО при ТТ не приводит к статистически значимому изменению количества лимфоцитов в периферической крови на 5 и 14 сутки. Количество клеток с ранними признаками апоптоза, с поздними признаками апоптоза не отличается от аналогичных показателей в группе животных с ТДП без ЭПО на 5 сутки ТТ и значительно снижается на 14 сутки.
Ключевые слова: термическая травма, лимфоцитопения, апоптоз, трансдермальная пленка, эритропоэтин
Ежегодно в мире от ожогов страдают более 6 млн. человек, 50% случаев приходится на термическую травму (ТТ). Некоторые патогенетические механизмы, лежащие в ее основе, приводят к развитию осложнений как системных (вторичный иммунодифицит, сепсис, септический шок, полиорганная недостаточность), так и местных
(инфицирование раневой поверхности, образование патологических рубцов, нарушение двигательных функций). Известно, что при ТТ наблюдается лимфоцитопения, это может являться важным фактором патогенеза иммунной дисфункции [1, 2]. В связи с этим, терапия ТТ должна включать как системное, так и местное воздействие. На сегодняшний день применение
раневых покрытии является одним из методов консервативного лечения ран. Основным их преимуществом является создание влажной среды в ране, которая способствует дифференцировке клеток, межклеточному взаимодействию и, как следствие, сокращению сроков лечения. [3]. В состав пленочных покрытий могут входить различные группы фармакологически активных веществ (антимикробные средства, антисептические средства, анальгетики и др.). Интерес в терапии ТТ представляют вещества, обладающие иммуномоделирующим действием. Ранее нами продемонстрированы плейотропные, в том числе иммунотропные, эффекты эритропоэтина (ЭПО) в клинических и в экспериментальных условиях при различной патологии [4, 5]. На сегодняшний день есть данные о системном применении ЭПО при термической травме (ТТ), которые свидетельствуют об его эффективности [6, 7]. Сведения о локальном применении ЭПО в составе трансдермальных пленок при ТТ в доступной литературе отсутствуют.
Цель работы. Исследовать влияние местного применения эритропоэтина в составе транс-дермальной пленки на количественный состав и апоптоз лимфоцитов в периферической крови в динамике экспериментальной ТТ.
Материалы и методы. Эксперимент выполнен на 60 белых нелинейных половозрелых крысах массой 250±20 г. при строгом соблюдении требований Европейской конвенции о защите позвоночных животных. Все животные случайным образом разделены на 4 группы: 1 - интакт-ные (n=10), 2 - животные с ТТ и асептической повязкой (n=20), 3 - животные с ТТ, которым на раневую поверхность наносили трансдермаль-ную пленку без ЭПО (n=20), 4 - животные с ТТ, которым наносили трансдермальную пленку с ЭПО (n=20). ТТ IIIA степени и площадью 4% моделировали путем погружения участка межлопаточной области крысы в очищенную воду 98-99оС на 12 с. Глубину ожога оценивали морфологическими методами. Трансдермальные пленки в группе 3 и 4 наносили сразу после ТТ, закрепляя асептической повязкой. Перевязку осуществляли ежедневно. Исследования проводили на 5 и 14 сутки ТТ. Количество лимфоцитов определяли с помощью гематологического анализатора «Medonic - M 16» (Швеция). На проточном цитофлуориметре «Navios» («BeckmanCoulter», США) определяли маркеры
гибели лимфоцитов при окрашивании клеток ан-нексином V и 7-аминоактиномицином D. Дифференцировали интактные клетки (Аппехт-5-FITC-/7-AAD-), клетки с ранними признаками апоптоза (Annexin-5-FITC+/7-AAD-), клетки с поздними признаками апоптоза, признаками некроза (Annexin-5-FITC+/7-AAD+). Результаты обрабатывали с использованием программы <^а^йса 10.0 forWmdows».
Результаты исследования и их обсуждения. Результаты представлены в таблице 1. Установлено, что при ТТ на 5 сутки количество лимфоцитов в крови статистически значимо не изменяется. На 14 сутки ТТ наблюдается снижение количества лимфоцитов. При исследовании гибели лимфоцитов в крови при ТТ выявлено, что количество клеток с ранними признаками апоптоза увеличивается на 5 сутки эксперимента и статистически не изменяется на 14 сутки. Содержание лимфоцитов с поздними признаками апоптоза, признаками некроза увеличивается на 5 и 14 сутки относительно группы интактных животных. Количество интактных клеток значительно снижается на 5 сутки ТТ, на 14 сутки эксперимента статистически значимых изменений не выявлено. Полагаем, что активация гибели лимфоцитов в крови при ТТ обеспечивается повышением концентрации проапоптогенных цитокинов (ТНФ-альфа), повышением экспрессии CD95 (АРО-1) на цитоплазматической мембране, свободными радикалами в условиях оксидативного стресса и другими факторами. Кроме того, механизм лимфоцитопении при ТТ может быть связан с миграцией лимфоцитов в очаг повреждения.
Применение трансдермальной пленки (ТДП) без ЭПО при ТТ не приводит к статистически значимым изменениям количества лимфоцитов в периферической крови на 5 и 14 сутки эксперимента относительно группы животных с ТТ. При исследовании маркеров гибели лимфоцитов в крови при ТТ в условиях применения ТДП без ЭПО установлено, что на 5 сутки количество ин-тактных клеток, клеток с ранними признаками апоптоза, с поздними признаками апоптоза статистически значимо не отличается от аналогичных показателей в группе с ТТ. На 14 сутки ТТ применение ТДП приводит к снижению количества клеток с ранними признаками апоптоза, с поздними признаками апоптоза, признаками некроза относительно группы сравнения. Как
следствие, наблюдается увеличение количества интактных клеток на 14 сутки эксперимента. Из экспериментальных данных видно, что «влажное» ведение раны под ТДП ограничивает гибель лимфоцитов в периферической крови по сравнению с «сухим» ведением ожога под асептической повязкой. Как известно, лечение ожогов во влажной среде способствует сокращению сроков лечения, улучшая межклеточное взаимодействие и дифференцировку клеток [3].
Применение ТДП с ЭПО не приводит к статистически значимому изменению количества лимфоцитов в периферической крови на 5 и 14 сутки ТТ относительно группы животных с ТДП без ЭПО. При исследовании маркеров гибели лимфоцитов в крови при ТТ в условиях применения ТДП с ЭПО установлено, что на 5 сутки количество интактных клеток, клеток с ранними признаками апоптоза, с поздними признаками апоптоза статистически значимо не отличается от аналогичных показателей в группе животных
с ТДП без ЭПО. На 14 сутки ТТ применение ТДП с ЭПО приводит к значительному снижению количества клеток с ранними признаками апоптоза, с поздними признаками апоптоза, признаками некроза, и как следствие - к увеличению количества интактных клеток относительно группы сравнения. Механизм иммунотропного действия ЭПО может быть связан с антиоксидантным эффектом ЭПО, ограничением пероксидации мембранных фосфолипидов и как следствие блокадой гибели лимфоцитов периферической крови путем апоптоза и некроза. По данным некоторых авторов, ЭПО взаимодействует с киназными рецепторами, активируя их, тем самым запуская процессы транскрипции [8]. Ограничение в условиях применения ЭПО зоны вторичной альтерации в очаге ТТ, а также стимуляция репаратив-ных процессов могут способствовать снижению генерации медиаторов воспаления, в том числе цитокинов с проапоптогенным эффектом.
Таблица 1
Количественный состав (109/л) и показатели гибели (%) лимфоцитов в периферической крови при экспериментальной термической травме в условиях применения трансдермальной пленки
с эритропоэтином (Ме ^25 ^75))
Группа животных п=10 Лимфоциты, •109/л Annexin-5 -FITC-/7-AAD-, % клеток Annexin-5-FITC+/7-AAD-, % клеток Annexin-5-FITC+/7-AAD+, % клеток
Группа 1 -Интакт-ные 2,55 (2,36-4,74) 91,9 (81,80-93,10) 7,80 (6,70-7,90) 0,10 (0,10-0,30)
Группа 2 - ТТ 5 сутки 3,00 (2,81-4,52) 83,45 (81,05-91,20) * 16,05 (8,45-18,10) * 0,50 (0,30-0,75) *
Группа 2 - ТТ 14 сутки 1,85 (1,62-1,90) * # 93,45 (89,35-96,90) 6,15 (2,75-9,75) 0,25 (0,10-0,55) *
Группа 3 -ТТ+ТДП пустая 5 сутки 4,04 (3,81-4,52) 81,35 (79,35-83,8) 15,80 (13,65-17,9) 2,50 (1,40-3,35)
Группа 3 -ТТ+ТДП пустая 14 сутки 1,89 (1,44-1,96) $ 98,70 (98,5-98,8) &, $ 1,00 (0,70-1,40) &, $ 0,50 (0,40-0,50) &, $
Группа 4 -ТТ+ТДП ЭПО 5 сутки 4,11 (1,95-4,48) $ 88,20 (74,80-90,10) $ 6,40 (6,20-21,40) $ 3,60 (2,20-3,60) $
Группа 4 -ТТ+ТДП ЭПО 14 сутки 2,15 (1,12-3,02) л 99,30 (99,2-99,4) §, л 0,60 (0,60-0,80) л 0,10 (0,00-0,10) §, л
Примечание. * - значимые (р<0,05) различия с группой интактных животных, #-с группой ТТ 5 сутки, &-с группой ТТ 14 сутки, $-с группой ТДП 5 сутки, §-с группой ТДП 14 сутки, Л -с группой ТДП ЭПО по критериям Манна - Уитни, Вальда - Вольфовитца, Краскела-Уоллиса.
Выводы. При ТТ количество лимфоцитов в крови значимо не изменяется на 5 сутки и снижается на 14 сутки эксперимента. Количество клеток с ранними признаками апоптоза увеличивается на 5 сутки эксперимента и статистически не изменяется на 14 сутки ТТ. Содержание лимфоцитов с поздними признаками апоптоза, признаками некроза увеличивается на 5 и 14 сутки эксперимента.
Применение ТДП при ТТ не приводит к статистически значимым изменениям количества лимфоцитов в периферической крови на 5 и 14 сутки эксперимента. На 5 сутки количество ин-тактных клеток, клеток с ранними признаками апоптоза, с поздними признаками апоптоза статистически значимо не изменяется, а на 14 сутки ТТ - снижается.
Применение ТДП с ЭПО при ТТ не приводит к статистически значимому изменению количества лимфоцитов в периферической крови на 5 и 14 сутки. Количество клеток с ранними признаками апоптоза, с поздними признаками апоптоза не отличается от аналогичных показателей в группе животных с ТДП без ЭПО на 5 сутки ТТ и значительно снижается на 14 сутки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Patenaude J. et al. Burn injury induces a change in T cell homeostasis affecting preferentially CD4+ T cells // Journal of leukocyte biology. 2005. vol. 77. № 2. pp. 141-150
2. Shalom A., Kramer E., Westreich M. Protective effect of human recombinant copper-zinc superoxide dis-mutase on zone of stasis survival in burns in rats // Ann plastsurg. 2011. vol. 66. № 6. pp. 607-609
3. Карякин Н. Н., Клеменова И. А. Технологии лечения ожогов в условиях влажной среды // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2015. №. 9-3. C. 495-499
4. Осиков, М.В. Роль эритропоэтина в реализации тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови при хронической почечной недостаточности / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, А.А. Федосов // Фундаментальные исследования. - 2012. - № 10-2. - С. 285289.
5. Осиков, М.В. Влияние эритропоэтина на функциональную активность тромбоцитов / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, А.А. Федосов и др. // Современные проблемы науки и образования. - 2012. - № 6.; URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=7450 (дата обращения: 26.03.2016).
6. Осиков М.В., Симонян Е.В., Саедгалина О.Т., Федосов А.А. Механизм влияния эритропоэтина на количественный состав лимфоцитов в крови при экспериментальной термической травме // Современные проблемы науки и образования. - 2016. - № 2.; URL: http://www.science-
education.ru/ru/article/view?id=24275 (дата обращения: 25.08.2016).
7. Sandhi A., Wardhana A. The effect of erythro-poietin administration in experimental burns wound healing: an animal study // Jurnal Plastik Rekonstruksi. 2016. vol. 3. № 1. pp. 1-8.
8. Irrera, N. Epoetin Alpha and Epoetin Zeta: A Comparative Study on Stimulation of Angiogenesis and Wound Repair in an Experimental Model of Burn Injury / Irrera N. et al. // Injury. - 2015. Vol. 11. - P. 12-20.
INDICATORS OF APOPTOSIS LYMPHOCYTES OF PERIPHERAL BLOOD IN EXPERIMENTAL THERMAL INJURY IN THE APPLICATION OF TRANSDERMAL FILMS WITH ERYTHROPOIETIN
M.V. Osikov, E.V. Simonyan, O.T. Saedgalina, E.V. Listik, E.Y. Vanin
South Ural State Medical University, Chelyabinsk, Russia
Annotation. Dysfunction of local and systemic immunity in thermal injury (TI) causes to systemic (sepsis, multiple organ failure) and local (the accession of infection, pathological scarring, etc.) complications. One of the mechanisms of immune dysfunction in the TI may be the death of lymphocytes. Special attention the conduct of burns is paid to local conservative treatment with bandages, which may involve various group of substances, including of substances with immunocorrective action, e.g. erythropoietin, whose pleiotropic effects demonstrated in different pathologies. The objective of this work is to investigate the effect of transdermal films with the EPO on the quantitative composition and indicators of death of lymphocytes in the peripheral blood in the dynamics of experimental TI. The experiment was done on 60 nonlinear white rats weighing 250±20 g. TI IIIA with an area of 4% was modeled by immersion of the interscapular region in rats into
water with a temperature of 98-99 C for 12 seconds. The study was performed at 5 and 14 days. The number of lymphocytes in the blood was determined using hematology analyzer «Medonic - M 16» (Sweden). Markers of death of lymphocytes was determined by flow cytometer "Navios" ("BeckmanCoulter, USA). It is established that the number of lymphocytes in the blood does not change significantly on day 5 and decreases at day 14 of the experiment at the TT. The number of cells with early signs apoptosis increased on day 5 of the experiment and statistically does not change at day 14 TI. The content of lymphocytes with late signs of apoptosis and signs of necrosis is increased by 5 and 14 day of the experiment. The application of TDF at the TI does not lead to statistically significant changes in the number of lymphocytes in the peripheral blood at 5 and 14 day of the experiment. On day 5, the number of intact cells, cells with early signs of apoptosis , late signs of apoptosis is statistically insignificant, and at day 14 experiment - reduced. The use of TDF with the EPO does not lead to significant change in the number of lymphocytes in peripheral blood at 5 and 14 days of the TI. The number of cells with early and late signs of apoptosis do not differ from similar indicators in the group of animals with TDF without EPO on day 5, and significantly reduced at day 14 of the TI.
Key words: thermal injury, lymphocytopenia, apoptosis, transdermal film, erythropoietin
REFERENCES
1. Patenaude J. et al. Burn injury induces a change in T cell homeostasis affecting preferentially CD4+ T cells // Journal of leukocyte biology. 2005. vol. 77. № 2. pp. 141-150
2. Shalom A., Kramer E., Westreich M. Protective effect of human recombinant copper-zinc superoxide dis-mutase on zone of stasis survival in burns in rats // Ann plastsurg. 2011. vol. 66. № 6. pp. 607-609
3. Karyakin N. N., Klemenova I. A. Tekhnologii lecheniya ozhogov v usloviyakh vlazhnoi sredy // Mezhdunarodnyi zhurnal prikladnykh i fundamental'nykh issledovanii. 2015. №. 9-3. C. 495-499
4. Osikov, M.V. Rol' eritropoetina v realizatsii trombotsitarno-kletochnykh vzaimodeistvii v krovi pri khronicheskoi pochechnoi nedostatochnosti / M.V. Osikov, T.A. Grigor'ev, A.A. Fedosov // Fundamental'nye is-sledovaniya. - 2012. - № 10-2. - S. 285-289.
5. Osikov, M.V. Vliyanie eritropoetina na funktsional'nuyu aktivnost' trombotsitov / M.V. Osikov, T.A. Grigor'ev, A.A. Fedosov i dr. // Sovremennye prob-lemy nauki i obrazovaniya. - 2012. - № 6.; URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=7450 (data obrashcheniya: 26.03.2016).
6. Osikov M.V., Simonyan E.V., Saedgalina O.T., Fedosov A.A. Mekhanizm vliyaniya eritropoetina na kolichestvennyi sostav limfotsitov v krovi pri eksperi-mental'noi termicheskoi travme // Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya. - 2016. - № 2.; URL: http://www.science-education.ru/ru/arti-cle/view?id=24275 (data obrashcheniya: 25.08.2016).
7. Sandhi A., Wardhana A. The effect of erythro-poietin administration in experimental burns wound healing: an animal study // Jurnal Plastik Rekonstruksi. 2016. vol. 3. № 1. pp. 1-8.
8. Irrera, N. Epoetin Alpha and Epoetin Zeta: A Comparative Study on Stimulation of Angiogenesis and Wound Repair in an Experimental Model of Burn Injury / Irrera N. et al. // Injury. - 2015. Vol. 11. - P. 12-20.
