CC BY
24
Зверков О.А.1, Рубанов Л.И. 2 Селиверстов А.В. 3
Институт проблем передачи информации им. А.А. Харкевича РАН, г. Москва
1 н.с., zverkov@iitp.ru 2 в.н.с., rubanov@iitp.ru 3 в.н.с., slvstv@iitp.ru
Поиск ультраконсервативных элементов у простейших типа Apicomplexa
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА
Ультраконсервативный элемент, простейшие, Apicomplexa, кластер.
АННОТАЦИЯ
В статье обсуждается кластеризация последовательностей и представлены результаты поиска на её основе ультраконсервативных элементов у простейших типа Apicomplexa.
В 2004 г. в геномах позвоночных были открыты ультраконсервативные элементы, сначала как точные повторы, затем как повторы, которые могут незначительно отличаться [1]. Первоначально был выделен 481 такой участок с сохранением синтении. Функциональная роль таких элементов до сих пор не определена, но их очень высокая консервативность, сложность и специфическое расположение в геноме указывают на вероятную роль в регуляции экспрессии генов эукариот. Ультраконсервативные элементы рассматриваются как новые источники филогенетической информации в геномах: они многочисленны, консервативны и соотнесены у далёких видов, они позиционно не пересекаются с большинством генных семейств с большим числом паралогов, редко содержат вставки мобильных элементов. Подобные характеристики указывают на их наследование от общего предка, жёсткий характер стабилизирующего отбора и функциональную значимость геномного контекста. С увеличением размера генома и сложности его организации, от дрожжей к позвоночным, увеличивается и доля ультраконсервативных элементов, приходящихся на некодирующую (возможно, регуляторную) часть генома. Например, найдено более 5000 уникальных ультраконсервативных элементов у птиц и рептилий [2], более 2000 - у мух и позвоночных [3]. Ультраконсервативные последовательности описаны у дрозофилид и у позвоночных животных с близким уровнем филогенетического расхождения видов, измеренного по кодирующим белки областям. Как длины, так и числа ультраконсервативных элементов оказались больше у позвоночных. Однако у простейших такие элементы до
сих пор не исследовались.
Причины консервативности остаются неизвестными. Возможно, часть из них является результатом горизонтального переноса от симбионтов или паразитирующих видов с широким распространением. Примером возбудителя протозойных инфекций, имеющего всесветное распространение служит Toxoplasma gondii, который относится к наиболее важным для медицины и ветеринарии представителям типа Apicomplexa. Церебральный токсоплазмоз, как оппортунистический паразитоз, занимает третье место в структуре летальных исходов при ВИЧ-инфекции.
Описание ультраконсервативных участков позволяет получать новые сведения о распространении возбудителей инфекций и путях заражения. В свою очередь это позволит целенаправленно проводить противоэпидемиологические мероприятия.
С другой стороны, такие участки могут служить маркёрами (зондами) для определения филогенетического положения малоизученных видов беспозвоночных животных. Это особенно актуально для видов, составляющих зоопланктон и в значительной степени определяющих продуктивность водных экосистем.
За последнее время значительно увеличилось число секвенированных геномов простейших, включая представителей типа Apicomplexa.
Геномные данные брались из базы данных Eukaryotic Pathogen Database Resources (http://eupathdb.org/). Нами выполнен широкомасштабный поиск ультраконсервативных элементов длиной от 90 п.н. и выше. Для этого из совокупности консервативных участков ДНК для анализа отобраны участки, полностью совпадающие у Toxoplasma gondii ME49 и Neospora caninum.
Найдено 30 таких участков, но подавляющее большинство из них перекрывает кодирующие области. Соответствующие гены были определены парным выравниванием ДНК против ДНК [4]. Наиболее длинные фрагменты (до 697 п.н.) расположены целиком в кодирующей области гена 28S рРНК на хромосоме IX или в гомологичных генах на хромосомах IX и Ia. Последние, возможно, представляют собой результаты недавних дупликаций генов рРНК.
Менее длинные консервативные участки перекрывают кодирующие области генов TGME49_245620 (рибосомный белок RPS27A), TGME49_301250 (гипотетический белок), TGME49_237130 (цитохром b), TGME49_237120 (гипотетический белок), TGME49_295710 (гипотетический белок), TGME49_242340 (рибосомный белок RPS29), TGME49_210690 (рибосомный белок RPS6), TGME49_254915 (гипотетический белок), TGME49_296010 (фосфатидалинозитол-3-4-киназа), TGME49_296000 (гипотетический белок), TGME49_266785 (белок, содержащий мотив zinc finger типа CCCH), TGME49_286090 (фактор инициации трансляции SUI1), TGME49_248480 (рибосомный белок RPS9) и TGME49_231140 (рибосомный
белок RPS25).
Пять ультраконсервативных участков из Toxoplasma gondii ME49 с длинами 166, 158, 143, 112 и 90 п.н. не перекрывают известные гены и являются кандидатами на роль ультраконсервативных некодирующих элементов. Координаты этих участков TGME49_chrV:2898396..2898561, TGME49_chrV:2898399..2898556, TGME49_chrVIIb:3224157..3224299,
TGME49_chrIII:999998..1000109 и TGME49_chrVOa:371446..371535.
Первый из них наиболее консервативен среди видов типа Apicomplexa. Точное совпадение наблюдается у штаммов T. gondii FOU, p89, VAND, TgCATBr9, RUB, GAB2-2007-GAL-DOM2, CtCo5, GT1, ME49, VEG, а также у видов N. caninum Liverpool и Hammondia hammondi H.H.34. Этот элемент, но уже с тремя заменами нуклеотидов представлен у Sarcocystis neurona SN3. Близкие последовательности, но с большим числом замен, найдены у кокцидий Eimeria maxima Weybridge и E. praecox Houghton и у пироплазмид: Babesia microti RI, B. bovis T2Bo, Theileria equi WA, Th. orientalis Shintoku, Th. parva Muguga, Th. annulata Ankara. Этот элемент с ещё большими отличиями (по сравнению с T. gondii) наблюдаются у Cryptosporidium hominis TU502, C. parvum Iowa II и C. muris RN66. Последовательности этого элемента с одной делецией выравниваются у Plasmodium gallinaceum 8A, Pl. vivax Sal-1, Pl. cynomolgi B, Pl. knowlesi H, Pl. falciparum 3D7, Pl. falciparum IT, Pl. chabaudi chabaudi, Pl. berghei ANKA, Pl. yoelii yoelii 17XNL и Pl. yoelii yoelii YM. У Plasmodium spp. эти последовательности хорошо выравниваются друг с другом.
Также найдены последовательности этого ультраконсервативного элемента с одной делецией у различных видов эймерий: Eimeria tenella strain Houghton, E. maxima Weybridge, E. brunetti Houghton, E. necatrix Houghton, E. falciformis Bayer Haberkorn 1970, E. mitis Houghton, E. acervulina Houghton. Пример выравнивания показан на рис. 1.
Т: 4 аа t taaac t taee t ggc a ggege teggggtggc tcaegc atcaccctg t eg tag t tegga 6 3
in им 1111 и [ till и i [ mn м л i m 111 и i mi и 11 in mm
Б: 24 3&7 aattaaacttacctggcaggegeteggggtggctcgtccateaccctgtcgtagteegga 24336 T; 64 gcagggcactgcactctgctg^ctgtgatgagctatgggctcccaatcgggggtgccaac 122
MM MM I II I M I MM MM III I I M I I M I Ml M I I Ml I M M
El 24 337 geagageactgeactcagctgtetgtaatgggctatgggccteeatatgggggtgceaae 24 27B T : 12 3 tgc agaa 11 te tg gt ag-c ggcagg t tgeg t tegege 153
I I I M M I M I i E 1 I ! I 1 I M I[jj II I II I M I E: 24277 tgcagaatttctgatagcggcatgttgcgttcgcgc 24242
Рис.1. Выравнивание ультраконсервативных элементов из Toxoplasma gondii ME49 и Eimeria acervulina Houghton (локус HG670352). Длина выравнивания 156 из 166 поданных на вход программы blast. Совпадает 89% нуклеотидов (140/156), делеция состоит из
одного нуклеотида
Другие найденные ультраконсервативные элементы также имеют близкие по последовательности участки в большинстве видов типа Apicomplexa. Количество нуклеотидных замен не более 11%.
Для анализа найденных консервативных элементов был проведён
поиск соответствий по базе данных Rfam [5]. Три из рассмотренных пяти консервативных элементов в T.gondii ME49 (два перекрывающихся элемента на хромосоме V и ещё один на хромосоме VIIb) гомологичны РНК U1, участвующей в сплайсинге и регулирующей разнообразие изоформ [67]. Четвёртый элемент (на хромосоме III) гомологичен РНК U6, также участвующей в сплайсинге [8-11]. Самый короткий элемент, который расположен на хромосоме VIIa, не имеет значительного сходства с известными образцами из базы Rfam. Результаты поиска в базе Rfam приведены в таблице._
Длина Позиции в геноме T.qondii ME49 Rfam Bits score
166 TGME49_chrV:2898396..2898561 U1 89.8
158 TGME49_chrV:2898399..2898556 U1 80.9
143 TGME49 chrVIIb:3224157..3224299 U1 69.6
112 TGME49_chrIII:999998..1000109 U6 102.4
90 TGME49_chrVIIa:371446..371535 N/A
Отметим, что пять перечисленных ультраконсервативных элементов специфичны для типа Apicomplexa и не обнаружены у других простейших. Поэтому они могут служить филогенетическими маркёрами для установления принадлежности видов таксономическим группам.
В биоинформатике часто рассматривают взвешенные многодольные графы, у которых вес каждого ребра отражает сходство последовательностей, приписанных его концам. Доли соответствуют видам. Ультраконсервативным элементам соответствуют такие m-плотные подграфы взвешенного многодольного графа, которые содержат рёбра большого веса. Последние условия предполагают заданными некоторые пороги. Такие подграфы называют кластерами.
На этой основе проведён поиск ультраконсервативных элементов для списка из 10 хорошо собранных геномов споровиков: Toxoplasma gondii ME49, Neospora caninum Liverpool, Sarcocystis neurona SN3, Eimeria tenella Houghton, Cryptosporidium parvum Iowa II, Plasmodium falciparum 3D7, Babesia bovis T2Bo, Theileria parva Muguga, Th. annulata Ankara и Gregarina niphandrodes. Из них учитывались только контиги длиной 500 п.н. и более.
При попарном выравнивании участков длиной не менее 150 п.н. допускалась величина штрафа не более 20 (при штрафе за несовпадение 1 и постоянном штрафе за делецию 5.1). Практически во всех подходящих парах встречалось не более 3 делеций. Кроме того, участки отбирались по сложности (коэффициент сжатия не более 2.5). Всего подходящих пар, т.е. рёбер предварительного графа, нашлось 23887.
Далее проводилась склейка вершин из одного вида, участвующих в различных ребрах, исходя из величины перекрытия соответствующих участков генома (например, 120).
Если требовать, чтобы каждая вершина кластера в графе была смежна с 6 или более долями (когда параметр алгоритма поиска кластеров m=7), то ответом является пустое множество (нет ни одного кластера).
Если же ослабить это требование, то найдутся кластеры с представителями всех 10 долей. Наиболее интересен вариант т=3, в котором найдено 3 кластера с 10 видами, по одному с 9 и 8 видами, 6 кластеров с 7 видами, 3 кластера с 6 видами, 5 кластеров с 5 видами, 1 кластер с 4 видами и 7 кластеров с 3 видами. Однако среди соответствующих последовательностей встречаются участки большой субъединицы рибосомной РНК.
Дальнейшее изучение ультраконсервативных элементов предполагает одновременное изучение последовательностей фланкирующих их локусов сегментов некодирующей ДНК в геномах. Анализ полногеномных данных позволяет изучать редкие явления или сочетания явлений, которые проливают свет на различные аспекты межгенных взаимодействий. Идея анализа в следующем: синергический эпистаз между вредными мутациями в пределах одного генотипа должен приводить к изменениям в распределении числа таких мутаций на генотип. Конкретно, поскольку синергический эпистаз на приспособленность приводит к избирательному действию отбора против особей, несущих большое число вредных мутаций, он должен снижать дисперсию числа вредных мутаций на генотип по сравнению с ожидаемой в отсутствие эпистаза. Другими словами, при эпистазе особи, несущие вредные мутации сразу во многих локусах, должны быть более редки в популяции, чем ожидается.
Это теоретическое предсказание можно проверить, используя данные по генетической изменчивости в природных популяциях. Поскольку для подсчета числа вредных аллелей в генотипе требуются полные генотипы, а для обнаружения сигнала эпистаза - анализ больших выборок генотипов, данные, необходимые для подобного исследования, начали появляться только недавно. А именно нужно рассматривать различные классы полиморфизмов, против которых ожидается действие отбора разной силы: от максимального (например, нонсенс-мутации, радикальные миссенс-мутации в консервативных аминокислотных сайтах, мутации в ультраконсервативных некодирующих позициях) до минимального (синонимические мутации). Отклонение распределения числа вредных аллелей на геном от ожидаемого будет означать действие синергического эпистаза против вредных мутаций на уровне всего генома.
Помимо глобального, в геноме также может действовать локальный эпистаз между мутациями в пределах одного функционального элемента (гена, ультраконсервативного некодирующего элемента, сайта связывания фактора транскрипции и т.п.). Свойства локального и глобального эпистаза, по-видимому, радикально различаются: локальный эпистаз определяется необходимостью действия функционального элемента как целого.
Взаимодействия между вредными аллелями в пределах функционального элемента могут быть как синергическими, так и антагонистическими. Антагонистический (положительный) эпистаз можно ожидать для мутаций большого эффекта: например, в ситуации, когда одна
замена в ключевой позиции сайта посадки транскрипционного фактора может полностью «выключать» функцию такого сайта, так что дальнейшее накопление мутаций в этом сайте будет лишь очень слабо вредным или даже нейтральным. С другой стороны, слабовредные мутации малого эффекта могут взаимодействовать синергически, так что приобретение одной мутации делает более вредными мутации, накапливающиеся после неё. На отдельных функциональных элементах наблюдался как синергический, так и антагонистический эпистаз; однако понимание вклада того и другого фактора в изменчивость можно получить только полногеномным анализом.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке РФФИ (проект 13-04-40196-Н).
Литература
1. Bejerano G.., Pheasant M., Makunin I., Stephen S., Kent W.J., Mattick J.S., Haussler D. Ultraconserved elements in the human genome // Science. - 2004. - V. 304 (5675). - P. 1321-13254.
2. Faircloth B.C., McCormack J.E., Crawford N.G.., Harvey M.G.., Brumfield R.T., Glenn T.C. Ultraconserved elements anchor thousands of genetic markers spanning multiple evolutionary timescales // Systematic biology. - 2012. - V. 61(5). - P. 717-726.
3. Makunin I.V., Shloma V.V, Stephen S.J., Pheasant M., Belyakin S.N. Comparison of Ultra-Conserved Elements in Drosophilids and Vertebrates // PloS one - 2013. - V 8(12), e82362.
4. Altschul S.F., Madden TL., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. -1997. - V25. - P.3389-3402.
5. Burge S.W., Daub J., Eberhardt R., Tate J., Barquist L., Nawrocki E.P., Eddy S.R., Gardner P.P., Bateman A. Rfam 11.0: 10 years of RNA families // Nucleic Acids Research. - 2012. - doi: 10.1093/nar/gks1005.
6. Zwieb C. The uRNA database // Nucleic Acids Research. - 1997. - V. 25 (1). - P. 102-103.
7. Berg M.G., Singh L.N., Younis I., Liu Q., Pinto A.M., Kaida D., Zhang Z., Cho S., Sherrill-Mix S., Wan L., Dreyfuss G. U1 snRNP determines mRNA length and regulates isoform expression // Cell. - 2012. - V 150 (1) - P. 53-64.
8. Brow D.A., Guthrie C. Spliceosomal RNA U6 is remarkably conserved from yeast to mammals // Nature. - 1988. - V 334 (6179). - P. 213-218.
9. Marz M., Kirsten T, Stadler P.F. Evolution of spliceosomal snRNA genes in metazoan animals // J. Mol. Evol. - 2008. - V. 67 (6). - P. 594-607.
10. Butcher S.E., Brow D.A. Towards understanding the catalytic core structure of the spliceosome // Biochem. Soc. Trans. - 2005. - V. 33 (Pt 3). - P. 447-449.
11. Karaduman R., Dube P., Stark H., Fabrizio P., Kastner B., Luhrmann R. Structure of yeast U6 snRNPs: arrangement of Prp24p and the LSm complex as revealed by electron microscopy // RNA. - 2008. - V 14 (12). - P. 2528-2537.
