CC BY
26
ПОИСК НОВЫХ АНТИАГРЕГАЦИОННЫХ СРЕДСТВ
В РЯДУ ПРОИЗВОДНЫХ З-АМИНОФУРАЗАН-4-КАРБОКСАМИДОКСИМА
А.Г. Муляр, С.Н. Кириллов,
О.В. Румеева, Е.А. Муляр
Кафедра фармакологии МГМСУ Делегатская ул., 20/1, Москва, Россия, 127473
А.Б. Шереметев, Н.К. Лагутина, Т.Р. Тухбатшин
ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН Ленинский просп., 47, Москва, Россия, 119991
В работе представлены новые вещества, способные продуцировать оксид азота (NO). Показано, что одно из изученных веществ эффективно подавляет агрегацию тромбоцитов; полученные данные позволяют рекомендовать его для исследования по показаниям безопасности для дальнейшего внедрения в клиническую практику в качестве антитромботического лекарственного препарата.
Ключевые слова: оксид азота, тромбоциты, агрегация.
В последние полтора десятилетия в биологии произошли события, повлекшие за собой значительные изменения представлений о функционировании самых различных биологических систем. Было обнаружено, что такое низкомолекулярное соединение, как оксид азота (NO), является одним из универсальных и необходимых регуляторов функций клеточного метаболизма [2].
Оказалось, что газообразное соединение, молекула которого является к тому же свободным радикалом, короткоживущим и легко подвергающимся химическим трансформациям, непрерывно ферментативно продуцируется в организме млекопитающих, оказывая ключевое воздействие на разнообразные физиологические и патофизиологические процессы. NO участвует в регуляции тонуса кровеносных сосудов, функционирует в центральной и вегетативной нервной системе, регулируя деятельноять органов дыхания, желудочно-кишечного тракта и мочеполовой системы [1, 5].
В то же время NO известен как мощный ингибитор агрегации тромбоцитов [3]. Его эффект, благодаря торможению тромбогенеза, способствует сохранению текучести крови. Факторы, регулирующие возникновение и утилизацию NO в эндогенных условиях, обеспечивают, во многом, нормальное функционирование сердечно-сосудистой системы.
Возможным источником создания антиагрегационных лекарственных препаратов могут служить новые дериваты NO, к которым относятся соединения, про-
являющие свойства доноров N0, содержащие Б-, О-, С-нитрозо- и нитро-группы, некоторые оксимы, диазениумдиолаты, N-окиси фуразанов, АО-металло-комплексы и др. [2].
Интересным объектами исследования являются вещества (потенциальные про-лекарственные соединения), включающие в свою структуру несколько различных функциональных групп, способных продуцировать N0.
В настоящей работе представлены результаты нашего первичного изучения производных фуразана, несущих амидоксимный фрагмент, которые, по-видимому, через генерацию N0 могут угнетать агрегационную способность тромбоцитов.
Материалы и методы исследования. Для определения взаимосвязи «структура-свойство» была синтезирована серия соединений, отличающихся типом и положением заместителей на базовом остове молекулы (рис. 1). Реакция хлороксима 1 с аминами является удобным методом синтеза амидоксимов L19-3, имеющих заместитель Я при атоме азота аминогруппы амидоксимного фрагмента. При нагревании амидоксимов L19-3 в щелочной среде протекает моноядерная гетероциклическая перегруппировка, приводящая к образованию изомерных ами-доксимов L19-4, где заместитель Я находится при атоме азота аминогруппы, связанной с фуразановым циклом.
R = А1к, циклопропил, СН^', ОСН^' ^ = Аг, Не^, Аг Рис. 1. Синтез амидоксимов L19-3 и L19-4
Агрегационная активность тромбоцитов изучалась методом Борна [4], принцип которого заключается в регистрации степени изменения оптической плотности плазмы, обогащенной тромбоцитами, под влиянием активатора процесса агрегации. В качестве такового использовалась аденозиндифосфорная кислота (АДФ) в концентрации 10-5 М. За АДФ признана роль эндогенного фактора агрегации, который, высвобождаясь из тромбоцитов на начальных этапах тромбоцитарного свертывания, приводит к образованию необратимого конгломерата кровяных пластинок. АДФ является одним из интеграторов различных путей увеличения способности тромбоцитов к агрегации (фосфоинозитольный путь, высвобождение кальция, образование циклических мононуклеотидов, активация каскада арахидоновой кислоты, вовлечение кальмодулина и др.). Для получения плазмы, богатой тромбоцитами, кровь центрифугировали при 200 g (1000 об/мин) в течение 10 минут. Верхний надосадочный слой, обогащенный тромбоцитами, отбирали пипеткой с пластиковым наконечником и хранили во время эксперимента при 37 °С в закрытой силиконовой пробирке. Изучаемые вещества в различных количествах добавляли к плазме за 5 минут до внесения индуцирующего агента.
Исследование агрегации тромбоцитов проводилось на агрегометре фирмы «Chrono-log» (США).
При графической регистрации процесса агрегации тромбоцитов получали кривые, отражающие изменения оптической плотности богатой тромбоцитами плазмы (принимали за 100%), по сравнению с оптической плотностью бестром-боцитарной плазмы (0%).
Изучаемые вещества в различных концентрациях в виде водного раствора ДМСО добавляли к плазме за 5 минут до внесения индуцирующего агента — АДФ (in vitro) или через определенные промежутки времени (60, 120, 240 минут) после перорального введения животным (in vivo). При анализе кривых учитывали степень изменения оптической плотности плазмы в опытах по сравнению с контролем.
В качестве лекарственного препарата сравнения использовалась ацетилсалициловая кислота, которая наиболее часто применяется в противотромботической терапии (как антиагрегант). Полученные данные обрабатывались методом вариационной статистики. Достоверность полученных результатов оценивалась с использованием критерия Стьюдента—Фишера. В работе был принят уровень вероятности p < 0,05.
Полученные результаты. В результате проведенных исследований было установлено, что изученные изомерные амидоксимы в разной степени угнетали АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов. Соединения группы L19-3 оказались активны. Внутри одной группы активность меняется в зависимости от типа заместителя R. На рис. 2 представлена диаграмма, демонстрирующая антиагрега-ционную активности соединений L19-3, при переходе от одного заместителя R к другому.
25
20
10
15
5
О
□ 10"3М
□ 10"4М
□ 10"5М
L19-3-a
2
L19-3-b
3
L19-3-C
Рис. 2. Изменение оптической плотности плазмы обогащенной тромбоцитами, под влиянием L19-3-a, L19-3-b и L19-3-c
(в % по отношению к контролю)
Как видно из рис. 2, соединение L19-3-b (Я = бензил) обладало выраженной способностью подавлять основную функцию тромбоцитов. Для него показатель агрегации (процент падения оптической плотности плазмы, обогащенной тромбоцитами) снижался на 23% по сравнению с контролем при концентрации 10-3 М. Однако при других концентрациях антиагрегационный эффект соединения L19-3-b не проявлялся.
Следует заметить, что ацетилсалициловая кислота, изученная в широком диапазоне разведения, также подавляла основную функцию тромбоцитов (на 23%) только в одной концентрации (10-7 М).
При изучении вещества L19-3-a (Я = циклопропил) в концентрации 10-3 М способность АДФ склеивать тромбоциты ослаблялась на 17%. При снижении концентрации на порядок (10-4 М) антиагрегационный эффект вещества L19-3-a сохранялся на том же уровне. Однако при еще более низкой концентрации (10-5 М) это вещество не оказывало эффекта.
Вещество L19-3-c (Я = пирид-3-ил) в концентрации 10-3 М подавляло активность тромбоцитов на 18% по сравнению с действием одного АДФ. Эффект незначительно ослабевал (13%) при снижении концентрации до 10-4 М. Дальнейшее разведение раствора соединения L19-3-c еще в десять раз (10-5 М) приводило к значительному возрастанию эффекта: подавлению агрегации на 24%, что сопоставимо с аналогичным эффектом ацетилсалициловой кислоты (10-7 М). Более низкие концентрации вещества L19-3-c не влияли на действие индуктора агрегации.
Изомеры L19-4-a и L19-4-b подавления агрегации тромбоцитов не вызывали.
Таким образом, показано что соединение L19-3-c наиболее активно оказывало антиагрегационное действие в диапазоне концентраций от 10-5 до 10-3 М, и оно далее было изучено в условиях перорального введения животным (кролики) в течение 240 минут.
При пероральном введении кроликам в дозе 6 мг/кг вещество L19-3-c достоверно снижало агрегацию тромбоцитов через 120 мин. после введения. При этом отмечалось ингибирование тромбоцитарного взаимодействия в 1,4 раза по сравнению с исходным уровнем. Спустя 4 часа после начала эксперимента происходило полное восстановление агрегационной способности тромбоцитов (табл. 1).
Таблица 1
Влияние вещества L19-3-C (6 мг/кг per os) на агрегацию тромбоцитов кролика in vivo, индуцированную АДФ (10- М)
Действие АДФ (контроль) Через 60 мин после введения L19-3-c Через 120 мин после введения L19-3-c Через 240 мин после введения L19-3-c
49,4 ± 0,7 44,5 ± 2,5 35,9 ± 5,4 р < 0,05 47,7 ± 1,6
При использовании вещества L19-3-c в более высокой дозе (12 мг/кг) снижение агрегационной активности тромбоцитов (на 27,3% по сравнению с конт-
ролем) наступало через 120 мин. после введения. Как и в предыдущем случае тромбоцитарная агрегация полностью восстанавливалась через 240 мин. после начала опытов (табл. 2).
Таблица 2
Влияние вещества L19-3-C (12 мг/кг per os) на агрегацию тромбоцитов кролика in vivo, индуцированную АДФ (10- М)
Действие АДФ (контроль) Через 60 мин. после введения L19-3-c Через 120 мин. после введения L19-3-c Через 240 мин. после введения L19-3-c
50,7 ± 1,5 45,8 ± 3,9 33,6 ± 3,9 Р < 0,05 48,3 ± 1,3
Как видно из представленных данных, пероральное введение кроликам вещества L19-3-C в дозах 6 мг/кг и 12 мг/кг приводит к эффективному ингибиро-ванию АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов.
Другие изученные дозы соединения L19-3-C эффекта не оказывали. Таким образом, полученные результаты позволяют сделать заключение о возможности рекомендовать вещество L19-3-C в качестве объекта доклинических исследований по параметрам безопасности в соответствии с требованиями МЗ и СР РФ и, скорее всего, после их завершения должно стать предметом клинических испытаний как противотромботическое средство (ингибитор агрегации тромбоцитов).
Отдельные этапы работы выполнены при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 07-03-00403) и Российской академии наук (программа фундаментальных исследований Президиума РАН).
ЛИТЕРАТУРА
[1] Граник В.Г. Основы медицинской химии. — М., 2001. — 384 с.
[2] Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота (NO). — М., 2004.
[3] Ванин А.Ф. Оксид азота — универсальный регулятор биологических процессов // Материалы научно-практической конференции «NO-терапия: теоретические аспекты, клинический опыт и проблемы применения экзогенного оксида азота в медицине». — М., 2001. — С. 22—27.
[4] Born G.V.R., Cross M.J. Aggregation of blood platelets // J. Physiol. — 1963. — P. 168, 178—195.
[5] Rang N.P., Dale M.M., Ritter J.M. Nitric oxide // Pharmacology. — 1999. — P. 188—197.
THE SEARCH OF NEW ANTIAGGREGATIVE SUBSTANCES AMONG 3-AMINOFURAZAN-4-CARBOXAMIDOXIME DERIVATES
A.G. Mulyar, S.N. Kirillov, O.V. Rumeeva, E.A. Mulyar
Department of pharmacology of MGMSU Delegatskaya str., 20/1, Moscow, Russia, 127473
А.B. Sheremetev, N.K. Lagutina, T.R. Tukhbatshin
Zelinsky Institute of Organic Chemistry, RAS Leninskyprosp., 47, Moscow, Russia, 119991
The synthesis of new compounds capable to produce nitric oxide are described. It is shown that one of the studied substances suppresses platelet aggregation. The obtained data allows to recommend the given connection for research under indications of safety for the further introduction in clinical practice as antiaggregative medical product.
Keywords: nitric oxide, platelets, aggregation.
СПЕКТРАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ БАВ, ПРОИЗВОДНОГО АРИЛОКСИЭТАНАМИНА
Е.А. Непогодина, Л.А. Чекрышкина
Кафедра фармацевтической химии ФДПО и ФЗО ГОУ ВПО Росздрава «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» ул. Ленина, 48, Пермь, Россия, 614990
В рамках доклинического изучения нового биологически активного вещества (БАВ) производного арилоксиэтанамина-Ы-2(2'-метилфенокси)-этилморфолина гидрохлорид, показавшего, согласно данным фармацевтических испытаний на кошках, высокую степень снижения артериального давления, проведен комплекс исследований с целью разработки критериев стандартизации субстанции и лекарственных форм на ее основе. Изучены УФ-, ИК-, :Н-ЯМР-спектры, масс-спектр, а также выполнен дифференциально-термический и термогравиметрический анализ исследуемого БАВ. Рекомендовано использование полученных результатов на стадии синтеза и для контроля качества субстанции и полученных на ее основе лекарственных форм.
Ключевые слова: биологически активное соединение — производное арилоксиэтанамина, идентификация, методы УФ-, ИК-, :Н-ЯМР-, масс-спектрометрия, дифференциально-термический и термогравиметрический анализ.
