CC BY
13Тематический номер «Генетика и племенное дело»
www.agroyug.ru
УДК 575.162
Ларкина Т. А., кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики
Митрофанова О. В., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики
Дементьева Н. В., кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики, ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных — филиал ФГБНУ ФНЦ животноводства — ВИЖ имени академика Л. К. Эрнста
ПОИСК МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ГЕННОЙ СЕЛЕКЦИИ БРОЙЛЕРОВ, С ЦЕЛЬЮ УМЕНЬШЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ АБДОМИНАЛЬНОГО ЖИРА В ТУШКЕ
В мясном птицеводстве используют специально отобранные линии бройлеров с максимальными темпами набора веса. Птиц кормят высококалорийной, но с пониженным содержанием белка, пищей. Содержание бройлеров клеточное, что приводит к плохой подвижности, в итоге цыплята активно накапливают жир. Основную массу жира в тушке обеспечивают абдоминальное депо, которое порой достигает 2,5-3,5% от массы тушки. При этом потребителям не нравится покупать мясо бройлеров, имеющих значительный объем брюшного жира. Поэтому на этапе разделки тушек этот жир приходится выбрасывать, что ведёт к значительным экономическим потерям.
Доказано, что отложение жира снижено у бройлеров, в рационе которых полиненасыщенных жирных кислот больше, чем насыщенных или мононенасыщенных. Условия содержания, такие как температура, способы размещения и режимы освещения, могут также влиять на содержание жира. Хотя температура, при которой содержатся птица, самый значительный фактор из перечисленных,
но его влияние на отложение жира мало по сравнению с условиями питания и генетическими факторами [1]. Различия по жирности между породами и линиями внутри породы иллюстрируют важность генетических факторов в этом процессе. Жирность достаточно хорошо наследуется у птиц, коэффициент наследуемости (Ь2) варьирует от 0,5 до 0,8 [2]. Для борьбы с излишней жирностью тушки птиц требуется пристальное изучение факторов, участвующих в депонировании жира и разработка методик, ослабляющих этот процесс. Поиск полиморфизмов в генах, участвующих в липидном обмене, важная задача на сегодняшний день для многих ученых передовых стран.
Дженен с соавторами в 2004 году в нидерландском научно-исследовательском центре селекции провел картирование хромосом бройлеров. Было использовано три поколения бройлеров породы белый плимутрок. В каждом поколении насчитывалось около 1800 голов. Оценивались такие признаки как масса тела и содержание висцерального жира в возрасте 7, 9 и 10 недель. Генотипы по 410 маркерам картировались на 25 хромосомах. Для этих двух признаков было
ЭФФЕКТИВНОЕ июнь
ЖИВОТНОВОДСТВО
найдено 26 ОН (локусы количественных признаков) в 18 районах 12 хромосом. Один район ОН, ассоциированный с депонированием брюшного жира на 10-й неделе (241сМ), был обнаружен на 1 хромосоме (маркеры MCW0058 и MCW0101). А другой район ОН — на 13 хромосоме (9сМ) (маркеры MCW0322 и MCW0110). Результаты, полученные Джененом и соавторами, говорят о том, что определенные районы хромосом 1, 2, 4, 13, 15, и 18 содержат гены, влияющие на депонирование абдоминального жира у бройлеров. Тогда как в хромосомах 3, 7, 10, 11, 14, и 27 не нашлось ни одного локуса количественного признака ОН [3]. В 2007 году селекционерами в Китае исследовалась экспрессия генов, вовлеченных в липидный обмен, брали от 13234 до 16858 проб, изучали жировую ткань 7 — дневных бройлеров. Высокая экспрессия и достоверная корреляция была получена у таких генов, как РДВР — это цитоплазматические белки, связывающие жирные кислоты, БроШ — гормон щитовидной железы, 1_Р1_ — фермент липаза, ^РВР7 — белок, который связывает инсулиноподобный фактор роста, MHC — главный комплекс гистосовместимости. У генов, таких как рецептор лептина, БРЕБР1 — протеин, связывающий регулирующие элементы стерола, апо-липопротеин В (ДроВ) и инсулиноподобный фактор роста 2 (^Р2), не выявлено достоверной связи экспрессии с отложением абдоминального жира, хотя эти гены активно участвуют в метаболизме липидов, передаче сигнала, энергетическом обмене, тумороге-незе, и иммунитете [4].
Цель исследования. Целью данной работы является изучение экспрессии генов-кандидатов, участвующих в метаболизме липидов в организме, выявление полиморфных сайтов в этих генах и изучение их связи с содержанием абдоминального жира у кур мясного направления.
Научная новизна работы. Впервые создан банк мРНК и разработана тест-система, позволяющая определять уровень экспрессии генов РДВР1, РДВР2, РДВР3, HMGA1, РРДРв, MC4R, РРАРваД, РС^С РТРМ в разных тканях бройлеров кросса «Иза Хаббард Ф-15». Методом секвенирования выявлено три сайта мононуклеотидного полиморфизма (БЫР) гена PPARG в пределах регуляторной последовательности. С помощью аллелеспецифической полимеразной цепной реакции выявлена связь ряда БЫР (4855561А>С, 4856011Т>С, 4857001Т^) с содержанием абдоминального жира у кур. Установлены статистически значимые различия в группах кур с высоким, средним и низким содержанием абдоминального жира с учетом их генотипов по исследуемым ДНК-маркерам.
Материалы и методы. В экспериментах использовали бройлеров кросса «Иза Хаббард Ф-15» в возрасте 35 дней (50% петухи и 50% курочки) из
экспериментального хозяйства ФБГНУ ВНИИГРЖ и частного фермерского хозяйства, условия содержания двух выборок идентичны.
Для проведения исследования применялись следующие методы: дизайн олигонуклеотидных прай-меров с помощью оп-Ипе программы Рптег_3; выделение тотальной матричной РНК из абдоминальной жировой ткани, головного мозга, печени, толстого кишечника и мышц от 10 особей домашней курицы с высоким уровнем абдоминального жира и десяти особей с низким уровнем; синтез кДНК с помощью обратной транскриптазы; определение профиля экспрессии генов-кандидатов в пяти тканях с помощью количественной ПЦР; амплификация ДНК при помощи ПЦР; выявление сайтов однонуклеотидного полиморфизма (БЫР) в пределах регуляторной и кодирующей областей PPARG, путем секвенирования его последовательностей. С целью изучения распространения мутаций в генах-кандидатах для выделения геномной ДНК использовали образцы печени 150 бройлеров обоих полов в возрасте 35 дней. ДНК выделяли по стандартной методике фенолом. Для генотипиро-вания кур по аллелям БЫР гена PPARG были использованы аллелеспецифические праймеры.
Статистическую обработку результатов проводили при помощи программного обеспечения AtteБtat12.0.5.(http://www.twirpx.com/file/166961/) и !п$1а1+у3.37 (http://www.obnovisoft1.ru/instat).
Результаты. Обнаружены достоверные различия экспрессии гена HMGД1 в печени с высоким и низким содержанием жира у бройлеров. Отношение средних значений уровней экспрессии в двух группах составляет 2,90 (Р < 0,01). Уровень экспрессии этого гена коррелирует с содержанием абдоминального жира (г=0,70, Р < 0,01) и массой абдоминального жира (г=0,70, Р < 0,01). Уровень экспрессии гена PPARG в печени достоверно различается в группах с различным содержанием и массой абдоминального жира. Отношение средних значений уровней экспрессии составляет 3,34 (Р < 0,01). Уровень экспрессии этого гена коррелирует с содержанием абдоминального жира (г=0,55, Р < 0,01) и массой абдоминального жира (г=0,57, Р < 0,01) [5]. Путем секвенирования в пределах последовательности гена PPARG выявлено три сайта мононукле-^ отидного полиморфизма БЫР (4855561А>С, 4857001Т^, 4856011Т>С) в регуляторной области. На рисунке 1 наглядно продемонстрирована связь определенных генотипов с признаком депонирование абдоминального жира по гену PPARG замена (4857001Т^).
Тематический номер «Генетика и племенное дело»
www.agroyug.ru
Рисунок 1. Ассоциация генотипов ТТ, ТС и Об гена РРЛЯС с признаком содержание абдоминального жира
га О.
си
X
га
£ 01
и
Генотипы
TG GG
Примечание: при P<0,001.
В таблице 1 представлены частоты генотипов по всем трем обнаруженным нами заменам в регуля-торной области гена РРДКС.
В таблице 2 представлены частоты аллелей по всем трем обнаруженным нами заменам в регуля-торной области гена РРДКС.
Использование ПЦР с аллелеспецифическими праймерами позволило установить наличие статистически значимых ассоциаций полиморфных сайтов гена РРДКС в группах бройлеров с низким, средним и высоким содержанием абдоминального жира. Это свидетельствует о связи генотипов по этим полиморфным сайтам с изучаемым признаком. По результатам исследований 150 бройлеров
кросса «Иза Хаббард Ф-15» по гену РРДКС частота встречаемости аллеля А (4855561А>С), аллеля С (4856011Т>С) и аллеля Т (4857001Т>ф составила 57%, 47% и 57%, соответственно. Установлено статистически значимое влияние генотипов ДД (4855561А>С), СС (4856011Т>С), ТТ (4857001Т>ф по гену РРДКС на содержание абдоминального жира в экспериментальных группах кур.
Заключение. Соответственно, можно рекомендовать молекулярные маркеры гена РРДКС при отборе родительских линий для получения отечественных кроссов кур мясного направления. Данный подход направлен на снижение количества абдоминального жира в тушке, что экономически оправдано и ведет к повышению рентабельности отрасли мясного птицеводства.
Исследования выполнены при финансовой поддержке ФАНО (тема госзадания АААА-А18-118021590138-1).
Таблица 1. Частота встречаемости генотипов в группах бройлеров, отличающихся содержанием абдоминального жира
Содержание абдоминального жира(%) Высокое 1,5±0,03 Среднее 1,11±0,03 Низкое 0,63±0,02
Генотипы СС* ТС* GG* AC* TT* TG* AA* CC* TT*
Частота генотипов 20% 24% 19% 45% 41% 48% 35% 35% 33%
*при P<0,001
Таблица 2. Частота встречаемости аллелей SNP's гена PPARG
SNP 4855561А>С 4856011Т>С 4857001T>G
Генотип АА АС СС ТТ тс СС ТТ TG GG
Частота аллеля A 57%
Частота аллеля C 43% 47%
Частота аллеля T 53% 57%
Частота аллеля G 43%
Литература:
1. Le Bihan-Duval, E. Estimation of the genetic parameters of meat characteristics and of their genetic correlations with growth and body composition in an experimental broiler line / E. Le Bihan-Duval, C. Berri, E. Baeza, N. Millet, C. Beaumont // Poult. Sci. — 2001. — V.80 — P. 839-843.
2. Laurent, V. Heart-type Fatty Acid-binding Protein Is Essential for Efficient Brown Adipose Tissue Fatty Acid Oxidation and Cold Tolerance. / V. Laurent, R. Chin, S. Young, K. Reue // J Biol Chem. — 2011. — V.7. — P. 380-390.
3. Jennen, D. A comparative map of chicken chromosome 24 and human chromosome 11 / D. Jennen, R. Crooijmans, B. Kamps, R. A^ar, A. Veenendaal, J. Poel, M. Groenen // Anim. Genet. — 2002. — V.33. — P. 205-210.
4. Wang, H. Profiling of chicken adipose tissue gene expression by genome array / H. Wang, Q. Wang, X. Zhang, S. Wang, Y. Wang, X. Wang, L. Hui // BMC Genomics. — 2007. — V. 8. — P.193-207.
5. Larkina, T.A. HMG1A and PPARG are differently expressed in liver of fat and lean broilers / T.A. Larkina, A.L. Sazanova, K.A. Fomichev, O.Y. Barkova, T. Malewski, K. Jaszczak, A.A. Sazanov // J. Appl. Genetics, 2011. — V.52. — P. 225-228.
