CC BY
7УДК 633.521:581.4:604.6
Е. В. Гузенко, М. В. Богданова, В. И. Сакович, В. А. Лемеш
ПОИСК МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ДЛИТЕЛЬНОСТЬЮ ФАЗ РАЗВИТИЯ ПРИ ПОНИЖЕННОЙ ВЛАГООБЕСПЕЧЕННОСТИ, У ЛЬНА МАСЛИЧНОГО (LINUM USITATISSIMUM L.)
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: e.guzenko@igc.by
Представлены результаты применения методов поиска ассоциаций в анализе коллекции льна масличного различного географического происхождения (23 страны). С помощью микросателлитных маркеров установлена значительная генетическая гетерогенность коллекции. Значение коэффициента полиморфизма (PIC) в среднем составило 0,362 на локус, частота встречаемости большинства аллелей — менее 50%. Суммарно из 168 аллелей, выявленных в 12 SSR-локусах, 36 были уникальными. В зависимости от локуса, число уникальных аллелей варьировало от одного (локусы Lu10, Lu13) до семи (Lu25, Lu4). Для анализа ассоциаций использовано программное обеспечение TASSEL 2.1. Идентифицировано два SSR-локуса, которые ассоциированы с продолжительностью фаз развития льна масличного на значительном уровне достоверности: Lu13 с фазами «всходы - елочка» (Р < 0,01) и «ранняя желтая спелость - желтая спелость» (Р < 0,001), Lu66 с фазой «бутонизация - цветение» (Р < 0,001). Засуха в указанные фазы вегетативного развития является лимитирующим фактором получения гарантированного урожая льна масличного. Установленные положительные и отрицательные значения коэффициента регрессии указывают на возможность отбора растений как с продолжительным периодом указанных фаз развития, так и с коротким периодом, что должно учитываться при выведении устойчивых к засухе сортов льна масличного для различных агроклиматических условий.
Ключевые слова: лен масличный, фазы развития, устойчивость к засухе, генетическая гетерогенность, SSR-маркеры.
Введение
Абиотические стрессы являются лимитирующими факторами роста сельскохозяйственного производства и основной причиной потери урожая во всем мире. В ответ на неблагоприятные экологические факторы (засуха, затопление, экстремальная температура, засоление и др.) в растениях происходят структурные и метаболические перестройки, которые препятствуют стрессу. Различные стрессовые сигналы изменяют генную экспрессию в направлении индуцирования или угнетения синтеза специфических метаболитов, прежде всего, структурных белков или ферментов специфических метаболических путей. При морфологическом анализе растений можно обнаружить лишь те изменения, которые имеют фенотипическое проявление. Анализ генетических ресурсов
растений с использованием молекулярных маркеров позволяет выявлять скрытую изменчивость и тем самым целенаправленно подходить к более точной дифференциации и идентификации образцов, в том числе и к выявлению ценных генотипов [1].
Идентификация генов и аллелей, контролирующих разнообразие сложных признаков, является важной теоретической и прикладной задачей генетики. Информация об этих генах позволяет получить новые знания о биологических системах, участвующих в формировании таких признаков. Кроме того, знание конкретных аллельных вариантов, контролирующих сложные признаки, позволяет вести направленную эффективную селекцию.
Существует несколько подходов к идентификации генов и аллелей [2]. Одним из
методов установленияи ассоциации между ДНК-маркерами и сельскохозяйственными признаками является GWAS (genome-wide association study, или полногеномный анализ ассоциаций — ПГАА, или ассоциативное картирование) [3]. В данном методе используется принцип неравновесного сцепления (linkage disequilibrium) (или ассоциации). Метод анализа ассоциаций обнаруживает локусы количественных признаков, которые отвечают за гораздо меньший процент вариативности, чем позволяет анализ обычного сцепления, и предполагает сравнение аллелей гена-кандидата у индивидов, обладающих интересующим исследователей признаком, и индивидов, не обладающих данным признаком. В отличие от метода двуродительского картирования, в ассоциативном картировании используется генетически разнообразная обширная коллекция, что дает возможность увеличения мощности разрешения картирования локусов количественных признаков и идентификации большего количества значимых аллелей [4].
Первые исследования по ассоциативному картированию у растений были проведены на овсе [5] и рисе [6]. Позже ассоциативное картирование было применено на таких культурах, как свекла, ячмень, кукуруза, пшеница, картофель и арабидопсис. В работе M. Hansen et al. сообщалось об ассоциации AFLP-маркеров с генами раннего цветения у свеклы [7]. У ячменя урожайность, время цветения, высота растений, устойчивость к бурой ржавчине и некоторые другие признаки были ассоциированы с разными типами молекулярных маркеров [8-11]. У кукурузы SSR- и SNP-маркеры использовали для выявления ассоциаций между временем цветения и высотой растения [12, 13]. F. You et al. генотипировали канадскую коллекцию льна масличного с помощью панелей, включающих 1,7 миллионов однонуклеотидных полиморфизмов и выявили связь пятидесяти SNPs с урожайностью [14].
Методы ассоциативного картирования применяются также для поиска генетических детерминант урожайности — ключевой характеристики любой сельскохозяйственной культуры. Формирование отдельных элементов структуры урожая протекает в разные ста-
дии развития растения. Периоды онтогенеза существенно различаются как по отношению растений к факторам внешней среды, так и по степени влияния этих факторов на качество урожая. Анализ многолетних наблюдений за фенологическими фазами развития льна масличного показал, что время наступления фаз развития льна масличного и их продолжительность в значительной степени связаны с сортовыми особенностями и влиянием погодных условий [15]. Сухая жаркая погода в период цветения способствует более дружному прохождению фазы «бутонизация -цветение». Однако для льна нежелательно как очень дружное, так и затяжное цветение. При коротком периоде цветения образуются укороченные соцветия с меньшим числом коробочек, что отрицательно влияет на урожай семян, продолжительное цветение затягивает созревание и создает трудности для уборки, увеличивая потери урожая [16].
Помимо внешних факторов, лимитирующих урожайность, большое значение имеют генетические особенности, обусловливающие приспособительные характеристики растений, в т. ч. эффективность прохождения различных фаз развития под действием среды. Для успешного прохождения растением той или иной стадии развития необходим определенный комплекс внешних условий, в том числе влагообеспеченность. Лен масличный является культурой достаточно требовательной к влаге. Особенно отрицательно ее недостаток отражается на периоде от посева до ранней желтой спелости. Наибольшая потребность во влаге отмечается в период быстрого роста, бутонизации и цветения. Обеспеченность влагой является одним из важнейших условий формирования высокого урожая хорошего качества. Однако избыточное увлажнение посевов после цветения во время созревания приводит к полеганию льна и способствует развитию различных грибных болезней [17].
Таким образом, особенности генотипа в сочетании с благоприятными условиями окружающей среды позволяют растению быстро и эффективно проходить стадии развития, что приводит к накоплению вегетативной массы растения и увеличению семенной продуктивности.
Целью данной работы являлся поиск ассоциаций между полиморфизмом микросател-
литных локусов и длительностью фаз вегетативного развития льна масличного в условиях пониженной влагообеспеченности.
Материалы и методы
Материалом для исследований служила коллекция льна масличного, которая состояла из 88 образцов различного географического происхождения (табл. 1).
Все образцы были высеяны в естественных условиях на экспериментальном участке Центрального ботанического сада НАН Беларуси (г. Минск) в оптимальные сроки
с соблюдением норм высева: 1м2 — 8 рядков, 60 штук семян на погонный метр. Проведены наблюдения за продолжительностью межфазных периодов развития растений: «посев - всходы», «всходы - елочка», «елочка - бутонизация», «бутонизация - цветение», «цветение - зеленая спелость», «зеленая спелость - ранняя желтая спелость», «ранняя желтая спелость - желтая спелость», «вегетационный период».
Для молекулярно-генетического анализа ДНК выделяли из листьев (50-100 мг). Растительный материал измельчали с помощью TissueLyser
№ Страна происхождения Образцы льна масличного
1 Австралия Glenelg
2 Аргентина Фландес
3 Беларусь К-5990, К-5991, К-604, К-603, К-5992, ЛМ-2, Сонечны
4 Великобритания Crown, Blue Chip
5 Венгрия Endress Olajlen
6 Германия Лирина
7 Индия Nameless К 1341, NF-115, Nameless K-180
8 Италия Nameless К-1210
9 Иран Nameless K-999
10 Канада Sel.of Clli-1856, Gold Flax, ASM Duff, McGregor, Somme, Л-6582, K-6570, Lightning, AC Carnduff, CDC Normabdy, AC Linora, Norlin, Cree, Stormont Gossamert
11 Китай K-2398
12 Марокко Maroccan, 4-oZ 7 (ex 196-12), Maracian
13 Нидерланды SU-6-15, Deep Pink
14 Польша Шафир, R/135 (INF-877), Gold Merchant, Eole (INF-878), Oliver, Циан
15 Россия Ручеек, Небесный, Славный 82, LM-98, 3871, Спартак, Воронежский, K-5627, K-5621, Воронежский (2), № 3896
16 Румыния Raluca, Deta
17 США Maritime, Bison, Koto, Linota, Wirona Sel, Rio, Redwing Sel, Minn, Linota (2), Omega, SU-1-10, Leona, Culbert, М-25-330
18 Таджикистан Памир (бел)
19 Узбекистан Nameless К-71, Nameless К-72, Бахмальский-1056
20 Уругвай K-5827
21 Франция Michail, Antares, Atalante. Mivast, Alaska ERA, Ocean
22 Чехия Lola (INF-843), Амон, Al-340, Sandra
23 Эфиопия Abyssinian
Таблица 1
Перечень образцов льна масличного, использованных в исследовании
Таблица 2
Условные обозначения фаз вегетативного развития льна масличного
Фаза развития Название фазы Условное обозначение
I посев - всходы SS
II всходы - елочка SFIR
III елочка - бутонизация FIRB
IV бутонизация - цветение BFL
V цветение - зеленая спелость FGR
VI зеленая спелость - ранняя желтая спелость GREY
VII ранняя желтая спелость - желтая спелость EYY
вегетационный период VEG
II (Qiagen, Германия), помещали в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки и ресуспендировали в 200 мкл ТЕ буфера (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA). Далее использовали Genomic DNA Purification Kit (#K0512) (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию ДНК измеряли с помощью спектрофотометра NanoPhotometer N (Implen, Германия).
Анализ полиморфизма микросателлитных повторов ДНК проводили с использованием флуоресцентно-меченых праймеров (табл. 3) [16, 17]. Реакционная смесь включала 20 нг геномной ДНК, по 0,25 мкМ прямого и обратного праймера, 200 мкМ каждого dATP, dCTP, dGTP и dTTP, от 1,5 до 2,5 мМ MgCl2 и 1 единицу Taq-полимеразы в инкубационном буфере.
ПЦР проводили в термоциклере MyCycler™ (BioRad, США) в следующих условиях: 94 °С в течение 5 мин, 25 циклов с параметрами: денатурация при температуре 94 °С в течение 30 с, отжиг праймеров в течение 45 с (температура отжига подбиралась в зависимости от праймера), элонгация при 72 °С в течение 40 с. Конечная элонгация при 72 °С 5 мин.
Продукты амплификации денатурировали формамидом и разделяли методом капиллярного электрофореза на генетическом анализаторе ABI Prism 3500 (Applied Biosystems, США). Определение размеров аллелей осуществляли при помощи программного обеспечения GeneMapper v4.1. (Applied Biosystem, США), используя внутренний стандарт высокой плотности для фрагментного анализа GeneScan™ 600 LIZ® (Thermo Fisher Scientific, США).
Информация об аллельном составе SSR-локусов исследуемых форм заносилась в электронную базу данных в формате Microsoft Excel-2003. Для расчета индекса информативности маркеров использовали надстройку для электронной таблицы MS Excel — GenAlEx 6.41 [20].
Филогенетические отношения между исследуемыми формами были изучены путем расчета парных генетических расстояний Nei [21] с использованием GenAlEx 6.41 [20]. Кластерный анализ проведен с помощью программы DARwin5 (версия 6.0.018) [22] и STRUCTURE 2.3.4 [23]. Данная программа использует методы Монте Карло по схеме марковской цепи (Markov Chain Monte Carlo, MCMC), что позволяет минимизировать неравновесие Харди-Вайн-берга и неравенство по сцеплению локусов в кластерном анализе индивидов. Количество кластеров (К) находилось в диапазоне от 1 до 10. Для визуализации результатов, их математического подтверждения методами Evanno [24] была использована веб-программа STRUCTURE Harvester [25]. Данная web-программа применена для детекции подходящего количества кластеров путем их индивидуального перебора.
Для анализа ассоциаций использовали программное обеспечение TASSEL 2.1 на основе модели MLM, включающее опции с матрицами Q и K [26].
Для корректной работы программы TASSEL 2.1 ввели условные обозначения для фаз вегетативного развития (табл. 2).
Таблица 3
Характеристика панели микросателлитных маркеров, использованных в анализе [18, 19]
№ Название олигонуклеотида Последовательность олигонуклеотида, 5' ^ 3' Метка 5'
1 LU 1_F TCATTCATCTCCTTCCACTAAAA FAM
2 LU1_R TTGAAAGCCCTAGTAGACACCA
3 LU 7_F CATCCAACAAAGGGTGGTG R6G
4 LU 7_R GGAACAAAGGGTAGCCATGA
5 LU 25_F TCTACAGAGTTCAATTCCCGTAA R6G
6 LU 25_R GTTGGACCTTACAAGACTCACTG
7 LU8_F TCCCGTAATATTCTATGTTCTTCC TAMRA
8 LU8_R TGAGTTGGACCTTACAAGACTCA
9 LU10_F GCCTAAAGCTGATGCGTTTC R6G
10 LU10_R TGTCAGGCTCCTTCTTTTGC
11 LU11_F ATGGCAGGTTCTGCTGTTTC R6G
12 LU11_R TTGCGTGATTATCTGCTTCG
13 LM-66_F TTATTATTAATTCAACCACAACGC FAM
14 LM-66_R CGATGAAGCTTGTGATGCTG
15 LU 3_F GCTCGTGATCTCCTTCATCC FAM
16 LU 3_R AAAACCACGTCCAGATGCTC
17 LU 4_F TTATTTCCGGACCCTTTCAA FAM
18 LU 4_R AAACTACCGCCGGTGATGAT
19 LU13_F AAGATGACGTCGGTGGTGAT TAMRA
20 LU13_R CGGAACCTTCCATTTTCCTC
21 LU15_F TGGACGACGATGAAGATGAA TAMRA
22 LU15_R CCGCCGGGTACACTACTACT
23 LU38_F GATCTTGTTGCCTGGGAAAG TAMRA
24 LU38_R TTCGTTTGCAATACGTCAGC
Результаты и обсуждение
В настоящее время лен масличный входит в число десяти основных масличных культур с широким ареалом возделывания. Традиционно в Беларуси возделывается лен-долгунец, а малочисленность посевов льна масличного, несмотря на возрастающую потребность различных отраслей промышленности в льняном масле, объясняется ограниченным числом районированных отечественных сортов. С целью создания новых высокоурожайных сортов льна масличного, адаптированных к условиям изменяющегося климата, необходимо изучать генетическое разнообразие мирового генофонда.
В нашем исследовании мы анализировали коллекцию из 88 форм льна масличного (табл. 1) из различных регионов мира с характерными особенностями климата. Большинство образцов коллекции представлено формами из стран европейской части (45), вторая по численности группа образцов из Северной Америки (28), 9 форм стран Азии, малочисленная группа образцов из Африки (4), Южной Америки (1), Австралии (1). В анализе использовано 12 полиморфных микросател-литных маркеров (SSR-маркеры) (табл. 4).
Аллельный состав микросателлитных ло-кусов для каждого образца льна масличного, включенного в исследование, определяли по
набору индивидуальных фрагментов ДНК, амплифицированных парой праймеров, специфичных к последовательностям, фланкирующим определенный микросателлитный повтор ДНК. Размер и количество аллелей, обнаруженных для каждого локуса, а также расчетные показатели, отражающие генетическое разнообразие сортов, приведены в таблице 4. В целом выявлено 168 аллелей размером от 94 до 265 п. н. Число аллелей на локус в изученной выборке варьировало от 2 (локус Lu38) до 33 (локус Lu25), при этом среднее значение составило 14,0. Значения коэффициента полиморфизма (PIC) варьировали от 0,102 (локус Lu3) до 0,608 (локус Lu11), в среднем 0,362 на локус. Частота встречаемости различных аллелей 12-ти микросателлитных локусов в изученной выборке варьировала от 16,7% до 100%. При этом подавляющее большинство аллелей встречалось с частотой менее 50%.
Оценивая полиморфизм SSR-локусов, мы отдельно учитывали частоту встречаемости уникальных аллелей, которые характеризуют оригинальность генофонда. Суммарно из 168 аллелей, выявленных в 12 SSR-локусах, 36 были уникальными. В зависимости от локуса число уни-
кальных аллелей варьировало от одного (локусы Lu10, Lu13) до семи (Lu25, Lu4). Максимальное число уникальных аллелей было зафиксировано у сорта Sel.of Clli-1856 (Канада) — 4 алле-ля, по 3 уникальных аллеля найдено у образцов К-5827 (Уругвай) и Воронежский (Россия), по 2 уникальных аллеля выявлено у образцов Лири-на (Германия), Al-340 (Чехия), Amon (Чехия) и K-2398 (Китай) (табл. 5).
По результатам исследования полиморфизма SSR-локусов выполнен кластерный анализ с помощью программы STRUCTURE 2.3.4 [24]. В данной программе для микросателлитных данных основное допущение состоит в том, что предполагаемые популяции находятся в относительном равновесии Харди-Вайнберга в равновесии по сцеплению. Оценку дисперсии выборки для анализа структуры популяции проводили на основе пяти независимых прогонов для каждого k-элемента выборки. В программе STRUCTURE реализован байесовский алгоритм кластеризации генотипов в K кластерах с учетом априорной информации о географическом положении рассматриваемых популяций. Для выбора оптимального K, где 1 < K > 10, использовался логарифм правдо-
Таблица 4
Показатели полиморфизма SSR-локусов льна масличного
Локус Количество аллелей Размер аллелей (п. н.) PIC Количествово уникальных алеллей
Lu 1 10 129-155 0,454 3
Lu 7 21 133-199 0,405 4
Lu 25 33 119-265 0,486 7
Lu8 15 147-178 0,536 5
Lu10 12 135-173 0,501 1
Lu11 9 134-173 0,608 4
Lu66 6 141-152 0,102 0
Lu 3 25 142-203 0,256 2
Lu 4 22 94-165 0,458 7
Lu13 5 105-113 0,092 1
Lu15 8 108-126 0,223 2
Lu38 2 96-108 0,227 0
Итого 168 - - 36
Среднее на локус 14 - 0,362 3
Таблица 5
Уникальные аллели, характерные для изученных образцов льна масличного
Аллель Образец Аллель Образец
129 Sel.of Clli-1856 (Canada) Lu3 173 Koto (USA)
Lu1 143 Atalante (France) 194 Lola (INF-843) (Czech Republic)
155 Maritime (USA) 104 Voronezhskii (Russia)
Lu10 170 Marocian (Morocco) 110 Al-340 (Czech Republic)
136 Eole (INF-878) (Poland) 112 Al-340 (Czech Republic)
Lu11 159 Sel.of Clli-1856 (Canada) Lu4 124 Maroccan (Morocco)
170 Lirina (Germany) 156 K-604 (Belarus)
173 Lirina (Germany) 158 SU-1-10 (USA)
Lu13 109 Amon (Czech Republic) 165 K-5827 (Uruguay)
Lu15 118 Glenelg (Australia) 133 Sel.of Clli-1856 (Canada)
124 Ocean (France) Lu7 136 Sel.of Clli-1856 (Canada)
127 K-5827 (Uruguay) 190 Culbert (USA)
157 4-oZ 7 (ex 196-12) (Morocco) 197 Endress Olajlen (Hungary)
168 Voronezhskii (Russia) 152 Slavnyi 82 (Russia)
Lu25 172 K-2398 (China) 160 Amon (Czech Republic)
197 Wirona Sel (USA) Lu8 171 K-5827 (Uruguay)
224 Redwing Sel (USA) 174 Michail (France)
227 Voronezhskii (Russia) 176 K-2398 (China)
подобия LnPD с помощью on-line приложения к программе STRUCTURE Harvester [25], в котором для определения истинного количества генетических групп используется метод Эванно [24]. Пик на графике (рис. 1а) отражает наиболее вероятное число исходных кластеров равное трем при проведенном нами анализе.
Дендрограмма генетического подобия между изученными образцами была построена невзвешенным парно-групповым методом кластерного анализа с арифметическим усреднением (рис. 2). Анализ дендрограммы не выявил четкого группирования форм по географическому происхождению, обнаружено довольно равномерное распределение форм по ветвям дендрограммы генетического подобия. Следует отметить, что образцы из Беларуси, России, Польши, Чехии и США наиболее представлены в одной из ветвей, что может свидетельствовать об использовании сходного генетического материала в селекционных программах данных стран.
Одним из важнейших факторов успешного поиска ассоциаций является высокая генетическая гетерогенность выборки. Если при анализе не учитывать влияние структуры изучаемой популяции, то тестовая статистика может быть завышена, и, как следствие, будет затруднена статистическая интерпретация данных. Это, в свою очередь, может привести к ложнополо-жительным результатам (ложное утверждение о наличии «статистически значимой ассоциации» и, как следствие, «идентификации локу-са»). В результате проведенного генотипиро-вания установлена значительная генетическая гетерогенность 88 форм льна масличного, и данная популяция использована нами для поиска ассоциаций.
С целью измерения фенотипических характеристик, необходимых для поиска локусов, контролирующих количественные признаки, все формы были высеяны в естественных условиях для фиксации продолжительности фаз развития. Лен является влаголюбивой
а)
! H lltt lJ
1
б)
Рис. 1. Результаты обсчета данных анализа полиморфизма микросателлитных локусов 88 форм льна масличного
в STRUCTURE 2.3.4
а) значения функции AK (ось ординат) от возможного числа кластеров (ось абсцисс). Значение по оси ординат, соответствующее пику, указывает на истинное количество кластеров (в данном случае 3). Высота пика отражает
выраженность популяционной структуры
б) разные оттенки серого соответствуют трем кластерам и отображают вероятность принадлежности к ним исследованных форм, по вертикали - доля частот аллелей соответствующего кластера (апостериорная вероятность)
культурой. На образование единицы сухого вещества он расходует 400-430 единиц воды в течение вегетационного периода [17]. Особенно высока потребность в воде в период быстрого роста, бутонизации, цветения. Хорошая влаго-обеспеченность в это время способствует получению высокого урожая семян. При недостатке влаги уменьшается ветвление, задерживается образование бутонов, сокращается продолжительность периода цветения, формируется небольшое количество коробочек с мелкими семенами пониженной масличности.
По данным полевых наблюдений в 2018 и 2019 гг. критические для получения гаранти-
рованного урожая фазы развития льна масличного приходились на май - июнь. Средняя температура воздуха в эти месяцы составляла + 17,3 °С с отклонением от среднего многолетнего значения на +2,45 °С; количество осадков — 55,5 мм (на 25% ниже нормы). В условиях 2018 года длительность периода «всходы - елочка» - «бутонизация - цветение» в среднем составила 44,22 ± 0,55 дня, при этом наиболее продолжительный период — 50 дней — зафиксирован у сортов R/135 (Польша), Gold Merchant (Польша) и наименьший -40 дней — у сорта CDC Normabdy (Канада). В условиях 2019 года продолжительность
Рис. 2. Дендрограмма филогенетических взаимоотношений между сортами льна масличного, построенная на основании анализа полиморфизма микросателлит-ных локусов
периода «всходы - елочка» - «бутонизация -цветение» у исследуемых образцов в среднем составила 36,8 ± 0,24 дней, при этом наиболее длительный период — 42 дня — зафиксирован у сортов R/135 (Польша), Gold Merchant (Польша), Gold Flax (Канада), Ли-рина (Германия) и наименьший — 32 дня — у сорта К-604 (Беларусь).
В целом, погодные условия в мае - июне 2018 и 2019 гг. характеризовались как засушливые, отмечалась задержка в вегетативном развитии и пониженная продуктивность всех исследованных форм.
Анализ ассоциации между продолжительностью фаз развития и SSR-маркерами проводили с использованием программного обеспечения TASSEL 2.1 в смешанной линейной модели дисперсионного анализа (MLM).
Анализ ассоциаций показал, что каждая из восьми фаз вегетативного развития с разной степенью достоверности связана с одной и той же группой микросателлитных локусов Lui, Lu8, Lull, Lul3, Lul5, Lu38, Lu66 (7 из 12, взятых в исследование) (табл. 6).
По данным 2018 года было установлено, что с продолжительностью фазы развития «посев - всходы» (SS) статистически достоверно связаны SSR-локусы Lu15 (Р < 0,05) и Lu8 (Р < 0,001), с фазой «всходы - елочка» (SFIR) — локус Lu13 (Р < 0,05), с фазой «бутонизация -цветение» (BFL) — локус Lu66 (Р < 0,01), с фазой «цветение - зеленая спелость» (FGR) — локус Lu13 (Р < 0,05), с фазой «ранняя желтая спелость - желтая спелость» (EYY) — локусы Lu66 (Р < 0,05) и Lul3 (Р < 0,001) (табл. 6).
По данным 2019 года с фазой развития «всходы - елочка» (SFIR) статистически достоверно оказались связаны SSR-локусы Lu15 (Р < 0,001) и Lu 13 (Р < 0,01), с фазой «елочка - бутонизация» (FIRB) — локусы Lu 13 (Р < 0,01) и Lu66 (Р < 0,001), с фазой «бутонизация - цветение» (BFL) — локус Lu66 (Р < 0,001 ), с фазой «цветение - зеленая спелость» (FGR) — локус Lui5 (Р < 0,05), с фазой «зеленая спелость -ранняя желтая спелость» (GREY) — локус Lul5 (Р < 0,001), с фазой «ранняя желтая спелость - желтая спелость» (EYY) — локусы Lu13 (Р < 0,001) и Lu15 (Р < 0,001). Также локусы Lu66 (Р < 0,01) и Lu13 (Р < 0,01) показали связь с длиной вегетационного периода (VEG) (табл. 6).
Таблица 6
Микросателлитные локусы, ассоциированные с фазами развития масличного льна
Фаза развития Локус 2018 год 2019 год
Р г2, % Р г2, %
Lu38 0,6625 0,18% 0,5395 0,21%
Lu66 0,1073 2,41% 0,0051 3,11%
I посев - всходы Lu1 0,1057 5,87% 0,047 4,98%
Lu15 0,0017* 5,71% 0,0712 2,75%
Lu13 0,2103 1,78% 0,1381 1,45%
Lu11 0,1585 2,73% 0,4349 1,39%
Lu8 1,86х10-5*** 10,36% 0,0102 5,54%
Lu38 0,7697 0,14% 0,2277 0,47%
Lu66 0,8243 0,93% 0,053 2,04%
II ^Ж) всходы - елочка Lu1 0,1944 6,62% 0,2192 3,69%
Lu15 0,0073 6,23% 5,78х10-9*** 7,47%
Lu13 0,0038* 4,62% 2,17х10-4** 3,45%
Lu11 0,9982 0,47% 0,4148 1,42%
Lu8 0,0052 10,10% 0,0494 4,65%
Lu38 0,7626 0,15% 0,8851 0,06%
Lu66 0,0092 4,85% 1,21х10-8*** 9,79%
III ^ЖВ) елочка - бутонизация Lu1 0,4259 5,80% 0,5086 4,38%
Lu15 0,0155 6,06% 0,0506 4,05%
Lu13 0,6221 1,30% 2,88х10-4** 4,88%
Lu11 0,9953 0,62% 0,2649 2,41%
Lu8 0,4134 6,65% 0,2038 5,56%
Lu38 0,1175 0,80% 0,0083 2,25%
Lu66 3,53х10-4** 4,51% 1,35х10-7*** 9,40%
IV (ВБЪ) бутонизация - цветение Lu1 0,0086 6,42% 0,1624 6,08%
Lu15 0,1156 2,80% 0,1854 3,39%
Lu13 0,0261 2,31% 0,0131 3,51%
Lu11 0,7268 1,10% 0,9351 0,97%
Lu8 0,0167 5,91% 0,6567 4,80%
Lu38 0,7294 0,16% 0,9473 0,03%
Lu66 0,0588 3,35% 0,7556 1,10%
V (FGR) цветение - зеленая спелость Lu1 0,2807 6,14% 0,0217 8,98%
Lu15 0,5342 2,55% 0,0018* 7,32%
Lu13 0,0038* 4,49% 0,03 3,64%
Lu11 0,9292 1,09% 0,5642 2,26%
Lu8 0,6941 4,81% 0,9361 3,97%
Продолжение таблицы 6
Фаза развития Локус 2018 год 2019 год
Р г2, % Р г2, %
VI зеленая спелость - ранняя желтая спелость Lu38 0,4014 0,33% 0,9548 0,02%
Lu66 0,1335 1,92% 0,2138 1,95%
Lu1 0,3446 3,92% 0,0489 6,64%
Lu15 0,0126 3,99% 4,98х10-6*** 8,52%
Lu13 0,9748 0,27% 0,9009 0,56%
Lu11 0,2358 2,08% 0,0661 3,57%
Lu8 0,0264 6,17% 0,4039 5,62%
VII (EYY) ранняя желтая спелость -желтая спелость Lu38 0,7258 0,15% 0,777 0,10%
Lu66 0,0024* 4,65% 0,0527 2,47%
Lu1 0,0858 6,39% 0,1505 4,85%
Lu15 0,8449 1,46% 3,34х10-6*** 7,23%
Lu13 1,10х10-5*** 6,23% 2,83х10-5*** 4,95%
Lu11 0,7834 1,34% 0,1126 2,58%
Lu8 0,5562 4,52% 0,0317 6,12%
(УГ^) вегетационный период Lu38 0,9907 0,00% 0,4654 0,38%
Lu66 0,0023 4,95% 4,82х10-4** 6,04%
Lu1 0,7525 3,79% 0,2945 5,77%
Lu15 0,1687 3,52% 0,0385 4,91%
Lu13 0,0692 2,68% 3,51х10-4** 5,71%
Lu11 0,9049 1,12% 0,6194 1,98%
Lu8 0,1503 6,68% 0,2516 6,77%
Примечание. * — Р < 0,05; ** — Р < 0,01; *** — Р < 0,001; Р — величина вероятности ошибки при отклонении от нулевой гипотезы; г2 — коэффициент детерминации
По результатам анализа установлены два SSR-локуса, которые имели ассоциации с продолжительностью фаз развития на достоверном уровне одновременно в 2018 и 2019 гг.: Lu13 с фазами «всходы - елочка» (Р < 0,01) и «ранняя желтая спелость - желтая спелость» (Р < 0,001), Lu66 с фазой «бутонизация - цветение» (Р < 0,001) (табл. 6). Аддитивная (суммарная) доля влияния значимых локусов составила от 3,45% («всходы - елочка», Lu13) до 10,36% («посев - всходы», Lu8) общей изменчивости признаков (табл. 6). Значения коэффициентов регрессии имели как положительную, так и отрицательную величину.
Заключение
Дефицит влаги в период «всходы - елочка» -«бутонизация - цветение» является лимитирующим фактором получения гарантированного
урожая льна [27, 28]. В результате проведенного исследования нами установлены два молекулярных маркера ^и13, Lu66), которые ассоциированы с длительностью фаз вегетативного развития льна масличного «всходы - елочка», «бутонизация - цветение», «ранняя желтая спелость - желтая спелость» при пониженной влагообеспеченности. Установленные положительные и отрицательные значения коэффициента регрессии, полученные при анализе связи микросателлитного локуса с длительностью фазы развития, указывают на возможность отбора растений как с продолжительным периодом указанных фаз развития, так и с коротким периодом, что должно учитываться при выведении сортов льна масличного, устойчивых к дефициту влаги для определенного региона возделывания данной культуры.
Список использованных источников
1. Генетические основы селекции растений. В 4 т. Т. 4. Биотехнология в селекции растений. Геномика и генетическая инженерия / науч. ред. А. В. Кильчевский, Л. В. Хотылева. -Минск : Беларуская навука, 2014. - 653 с.
2. Чесноков, Ю. В. Ассоциативное картирование у растений / Ю. В. Чесноков, А. М. Артемьева // Сельскохозяйственная биология. -2011, № 5. - С. 3-16.
3. Contreras-Soto, R. I. Genome-Wide Association Study for Agronomic Traits in Soybean Using SNP Markers and SNP Based Haplotype Analysis / R. I. Contreras-Soto [et al.] // PLoS ONE. - 2017. - Vol.12, № 2. - P. 1-22.
4. Sehgal, D. Quantative trait Loci Mapping in Plants: Concepts and Approaches / D. Sehgal, R. Singh, V. R. Rajpal // Molecular Breeding for Sustainable Crop Improvement, Springer. -2016. - Chapter 2. - P. 31-59.
5. Association between molecular markers and quantitative traits in an oat germplasm pool: can we infer linkage? / Beer S. C. [et al.] // Journal of Agricultural Genomics. - 1997. - Vol. 3. -P. 197.
6. Predicting quantitative variation within rice germplasm using molecular markers / P. S. Virk [et al.] // Heredity. - 1996. - Vol. 76, № 3. -P. 296-304.
7. Linkage disequilibrium mapping of the bolting gene in sea beet using AFLp markers / M. Hansen [et al.] // Genet. Res. - 2001. -Vol. 77, № 1. - P. 61-66.
8. Linkage Disequilibrium Mapping of Yield and Yield Stability in Modern Spring Barley Cultivars / A. T. W. Kraakman [et al.] // Genetics. - 2004. - Vol. 168, № 1. - P. 435-446.
9. Linkage Disequilibrium Mapping of Morphological, Resistance, and Other Agronomi-cally Relevant Traits in Modern Spring Barley Cultivars / A.T.W. Kraakman [et al.] // Mol Breeding. - 2006. - Vol. 17, № 1. - P. 41-58.
10. RFLP markers associated with major genes controlling heading date evaluated in a barley germ plasm pool / E. Igartua [et al.] // Heredity. - 1999. - Vol. 83, № 5. - P. 551-559.
11. Associations of simple sequence repeats with quantitative trait variation including biotic and abiotic stress tolerance in Hordeum spon-taneum / V. Ivandic [et al.] // Plant Breeding. -2008. - Vol. 122. - P. 300-304.
12. Structure of linkage disequilibrium and phenotypic associations in the maize genome /
D. L. Remington [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2001. - Vol. 98, № 20. - P. 11479-11484.
13. Dwarf8 polymorphisms associate with variation in flowering time / J. M. Thornsberry [et al.] // Nat Genet. - 2001. - Vol. 28, № 3. -P. 286-289.
14. Genome-Wide Association Study and Selection Signatures Detect Genomic Regions Associated with Seed Yield and Oil Quality in Flax / F. You [et al.] // IJMS. - 2018. - Vol. 19, № 8. - P. 2303.
15. Дьяков, А. Б. Физиология и экология льна / А. Б. Дьяков. - Краснодар, 2006. - 224 с.
16. Фадеева, Т. М. Возрастные изменения растений льна в онтогенезе / Т. М. Фадеева,
E. Ф. Семенова // Научные ведомости. Естественные науки. - 2011, №9 (104) - С. 50-55.
17. Использование физиологических параметров растения льна масличного в селекции: рекомендации / Н. А. Дуктова [и др.] - Горки : БГСХА, 2014. - 44 с.
18. Characterization of novel genic SSR markers in Linum usitatissimum (L.) and their transferability across eleven Linum species / B. J. So-to-Cerda1, H. U. Saavedra, C. N. Navarro, P. M. Ortega // Electronic Journal of Biotechnology. doi: 10.2225/vol14-issue2-fulltext-6.
19. Deng, X. Isolation and characterization of polymorphic microsatellite markers from flax / X. Deng [et al.] // Afr. J. Biotech. - Vol. 10, № 5. - P. 734-739.
20. Peakall, R. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research—an update / R. Peakall, P. E. Smouse // Bioinformatics. - 2012. - Vol. 28, № 19. - P. 2537-2539.
21. Nei, M. Analysis of gene diversity in subdivided populations / M. Nei // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1973. - Vol. 70, № 12. -P. 3321-3323.
22. DARwin - Dissimilarity Analysis and Representation for Windows [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://darwin.cirad. fr/. - Дата доступа: 12.12.2018.
23. Pritchard, J. K. Inference of population structure using multilocus genotype data / J. K. Pritchard, M. Stephens, P. Donnelly // Genetics. - 2000. - Vol. 155, № 2. - P. 945-959.
24. Evanno, G. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study / G. Evanno, S. Reg-naut, J. Goudet // Mol. Ecol. - 2005. - Vol. 14, № 8. - P. 2611-2620.
25. Earl, D. A. STRUCTURE HARVESTER: a website and program for visualizing STRUCTURE output and implementing the Evanno method / D. A. Earl, B. M. vonHoldt // Conservation Genetics Resources. - 2012. - Vol. 4, № 2. - P. 359-361.
26. TASSEL: software for association mapping of complex traits in diverse samples / P. J. Bradbury [et al.] // Bioinformatics. - 2007. -Vol. 23, № 19. - P. 2633-2635.
27. Объедков М.Г. Лен-долгунец. М., 1979. -222 с.
28. Роль генофонда льна в селекции на адаптивность. / Т. А. Рожмина [и др.] // Успехи современной науки. - 2017. - Vol. 1, № 10. -P. 184-189.
E. V. Guzenko, M. V. Bogdanova, V. I. Sakovich, V. A. Lemesh
SEARCH FOR MICROSATELLITE LOCI ASSOCIATED WITH A PERIOD OF DEVELOPMENT PHASES UNDER THE CONDITIONS OF REDUCED WATER AVAILABILITY IN OIL FLAX (LINUM
USITA TISSIMUM L.)
State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27, Akademicheskaya Str., 220072 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: e.guzenko@igc.by
Results of associative mapping in the analysis of a collection of oil flax of different geographical origin (23 countries) are demonstrated. Using microsatellite markers, high genetic heterogeneity of the collection was established. The polymorphism information content (PIC) averaged 0.362 per locus, and the frequency of most alleles was less than 50%. In total, out of 168 alleles identified in 12 SSR loci, 36 were unique. Depending on the locus, the number of unique alleles varied from one (loci Lu10, Lu13) to seven (Lu25, Lu4). To analyze associations, the TASSEL 2.1 software was used. Two SSR loci associated with a period of oil flax development phases at a significant level of confidence: Lu13 with "seedlings - herringbone" (P < 0.01) and "early yellow ripeness - yellow ripeness" (P < 0.001) phases and Lu66 with the "budding - blooming" (P < 0.001) phase were identified. During these vegetative stages, drought is a limiting factor for a guaranteed yield of oil flax. The established positive and negative values of a regression effect of alleles indicate the possibility of selecting plants with both a long period of indicated development phases and a short period that should be taken into account when breeding drought-resistant oil flax varieties for various agroclimatic conditions.
Keywords: oil flax, development phases, drought resistance, genetic heterogeneity, SSR markers.
Дата поступления статьи: 25 сентября 2020 г.
