CC BY
40
УДК 579.66:547.94
И.И. Хабибуллина1, А.В. Лукьянова1, Н.И. Петухова1, Л. В. Спирихин2, В.В. Зорин1
Поиск методов повышения активности биокатализаторов кинетического разделения рацемических смесей эфиров
вторичных спиртов
1 Уфимский государственный нефтяной технический университет 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел.: (3472) 43-19-35; Е-mail: bio@rusoil.net 2Институт органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук 450054, Уфа, пр. Октября, 71, факс: (3472)35-52-88, е-mail: chemorg@anrb.ru
Исследована возможность повышения активности ранее разработанных биокатализаторов кинетического разделения рацемических смесей эфиров вторичных спиртов на основе штаммов Bacillus sp.77-1 и Bacillus sp.79-54, путем обработки нативной биомассы различными органическими растворителями.
Ключевые слова: биокатализатор, органический растворитель, энатиоселективный гидролиз, втор-бутилацетат
В качестве синтонов многих низкомолекулярных биорегуляторов могут служить стерео-изомеры различных спиртов, оксиэфиров и сложных эфиров 1. Эффективным способом получения таких соединений являются методы энантиоселективной биотрансформации с помощью ферментов и клеток микроорганизмов 2. Такие ферменты не требуют дорогостоящих коферментов, могут проявлять высокую сте-реоселективность и широкую субстратную специфичность, и проявлять каталитическую активность, как в водной среде, так и в органическом растворителе.
Вместе с тем, промышленное применение препаратов липаз зачастую ограничивается их высокой стоимостью, значительным расходом, а также сложностью регенерации и повторного использования. В связи с этим в последние годы с целью удешевления биокатализаторов за рубежом активно проводятся работы по созданию клеточных катализаторов, представляющих собой рекомбинантные микроорганизмы, несущие гены известных высокоселективных внеклеточных липаз 3-5.
Из литературных данных известно, что для увеличения активности фермента предлагается обработка биомассы органическим растворителем, в частности, ацетоном, что позволяет повысить ее дисперсность и концентрацию в реакционной среде, при этом сохраняется естественная локализация фермента внутри или в переплазматическом пространстве клеток микроорганизмов 6. Дата поступления 20.02.06
Ранее нами были разработаны биокатализаторы на основе штаммов микроорганизмов Bacillus sp.77-1 и Bacillus sp.79-54. Клеточные биокатализаторы Bacillus sp.77-1 и Bacillus sp.79-54, предобработанные ацетоном в стандартных условиях осуществляли стерео-селективный гидролиз рацемической смеси втор.-бутилацетата, являющегося ценным синтоном в синтезе антибиотиков и различных
7
других лекарственных препаратов .
С целью поиска методов увеличения ферментативной активности и стабильности биокатализаторов нами осуществлено исследование биокатализаторов, полученных на основе биомассы, обработанной различными растворителями.
В работах 5'8 показано, что обработка ацетоном клеток микроорганизмов приводит к существенному увеличению их каталитической активности как в процессах гидролиза сложных эфиров, протекающих в водной среде, так и в процессах ацилирования спиртов, осуществляющихся в органических (предпочтительно неполярных) растворителях, а также повышает стабильность биокатализатора при хранении и повторном использовании 6'8.
При катализе процессов, протекающих в неполярных органических растворителях, увеличение активности обработанной ацетоном биомассы может объясняться ростом гидро-фобности клеточной поверхности вследствие ее обезвоживания. В случае процессов, реализуемых в водной фазе, увеличение активности биомассы в процессе гидролиза, вероятно, обусловлено пермеабилизацией поверхностных структур клеточного катализатора , что облегчает транспорт субстрата и продукта реакции через мембрану и клеточную стенку 10. Повышение стабильности клеточного катализатора при обработке клеток ацетоном, по-видимому, связано с подавлением синтеза проте-аз, разрушающих целевые ферменты в натив-ной биомассе, или снижения их активности.
В результате исследования действия органических растворителей (ацетона, толуола, изопропанола) и их смесей на клетки бактерий Bacillus sp. 77-1 и Bacillus sp.79-54, способных осуществлять кинетическое разделение рацемических смесей эфиров вторичных спиртов 11, было обнаружено, что предобработка биомассы микроорганизмов этими веществами увеличивает ее каталитическую активность в процессе гидролиза втор-бутилацетата (в 1.1 — 4.5 раза).
торов и позволяет получить (5)-(+)-втор-бута-нол и (И)-(-)-втор-бутилацетат с оптической чистотой 96—98 % ее. При этом также сохраняется возможность многократного использования биокатализаторов (по крайней мере, в течение трех циклов).
ОА-
Bacillusspp.77-1,79-54 Me^ ^Et Me OH
-С + С
H \>Ac H 4Et
(К)-(-)-Втор-бутилацетат (8)-(+)-Втор-бутанол
(К,8)-Втор-бутилацетат
Установлено, что в случае штамма Bacillus sp. 79-54 наиболее эффективной является предварительная обработка биомассы смесью растворителей изопропанол-толуол (1:1), увеличивающая активность нативного катализатора в 4.5 раза (рис. 1).
5
4 -
е
О О
я и К
Ё С
3 -
4,5
1,58 1,7 1,89 1,63
И
illlll
□ без обработки
□ изопропанол
□ ацетон-хлор офор м
□ изопропанол-толуол
□ ацетон
□ ацетон-толуол
□ изопр опанол-хлор офор м
Рис.1. Гидролитическая активность биокатализатора на основе штамма Bacillus sp. 79-54, обработанного различными растворителями
В случае штамма Bacillus sp. 77-1 наибольший эффект роста активности (в 1.7 раза) достигается при использовании смеси ацетон-толуол 1:1 (рис. 2).
Полученные результаты показывают, что использование смеси растворителей для обработки биомассы является более эффективным методом повышения активности биокатализатора, чем обработка ацетоном (в 1.6 раз для штамма Bacillus sp. 77-1 и 2.9 раза для Bacillus sp. 79-54). Показано, что предложенный способ интенсификации процесса гидролиза кинетического разделения рацемических смесей вторичных спиртов с помощью клеток Bacillus sp. 77-1 и Bacillus sp. 79-54 не снижает энантиоселективных свойств биокатализа-
Г1,5 -
<
0,5
□ без обработки
□ изопропанол
□ ацетон-хлор офор м
□ изопропанол-толуол
□ ацетон
□ ацетон-толуол
□ изопропанол-хлороформ
Рис.2. Гидролитическая активность биокатализатора на основе штамма Bacillus sp. 77-1, обработанного различными растворителями
Экспериментальная часть
Микроорганизмы выращивали на агари-зованном панкреатическом гидролизате рыбы в чашках Петри при 30 °С в течение 72 ч, затем трехсуточную биомассу собирали с поверхности среды, дважды промывали 0.05 М фосфатным буфером (рН 7.5) и затем обрабатывали органическими растворителями (ацетон, изоп-ропанол, хлороформ, толуол) (1:3) при перемешивании, затем центрифугировали при 6000g. Полученный порошок высушивали при комнатной температуре.
Трансформацию соединений гидролизом в водной среде обезвоженными органическими растворителями клетками микроорганизмов, в стандартных условиях, осуществляли в 0.05 М фосфатном буфере рН=7.0 при температуре 30 оС, при перемешивании в течение 3—5 ч. Концентрация биомассы исследуемых штаммов находилась на уровне 10—13 мг (асв)/мл. Субстрат вводили в концентрации 5 г/л, контролируя уровень его конверсии и накопления продукта методом ГЖХ. После того, как реакция прошла, биокатализатор отделяли от реакционной среды центрифугированием в течение 15 мин при 6000 об/мин.
Изменение концентрации субстрата и продукта реакции контролировали методом ГЖХ. Использовали хроматограф ЛХМ 8МД, снабженный пламенно-ионизационным детектором, трехметровую колонку (ё = 3 мм) с не-
2
1
2
1
1
0
подвижной фазой SE-30 (5%) на хроматоне AW, температура 80 оС и скорости газа-носителя (азот) — 10мл/мин.
Литература
1. Ohtani T., Nakatsukasa H., Kamezawa M., et al./ / J.Mol.Cat.B: Enz.- 1998.- № 4.- Р. 53.
2. Grogan G. J., Holland H. L. //J. Mol. Cat. B: Enz.- 2000.- V. 9.- P. 1.
3. Зорин В.В., Петухова Н.И., Халимова Л.Х. // Панорама современной химии России. Современный органический синтез: Сб. обзорных статей.- М.: Химия, 2003.- С. 439.
4. Коновалов A.A., Н.И. Петухова, Ишмуратов Г.Ю., Харисов Р.Л., Зорин В.В. // Баш. хим. ж.- 2000.- Т.7, №5.- С. 34.
5. Мубараков А.И., Гареев В.М., Петухова Н.И., Зорин В.В.//Баш. хим. ж.— 2000.— Т.7, №5.-С. 37.
6. K. Nakamura and T. Matsuda Asymmetric // J. Org. Chem.- 1998.- №. 63.- P. 8957.
7. Seung Hwan Lee, Jong Hyun Choi, Sang Hyun Park, Jong-il Choi, Sang Yup Lee // Enz. Micr. Techn.- 2004.- №. 35.- P. 429.
8. Коновалов А.А., Петухова Н.И., Зорин В.В. // Баш. хим. ж.- 2003.- Т. 10, №1.- С. 64.
9. Santaniello E., Ferraboschi P., Grisenti P., Manzocchi A.//Chem. Rev.-1992.-№ 92.-P. 1071.
10. Roberts S. M. // J. Chem. Soc., Perkin Trans.-2001.- V.1.- P.1475.
11. Коновалов А.А., Петухова Н.И., Зорин В.В. // Баш. хим. ж.- 2000.- Т. 7, №5.- С. 49.
