CC BY
3
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 577.152.22, 547-305.2
Поиск ингибиторов транскетолазы из Mycobacterium tuberculosis в ряду сульфозамещенных соединений
И. В. Гущина1^, Д. К. Нилов2#, Т. А. Щербакова2, С. М. Балдин2, В. К. Швядас12*
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, факультет
биоинженерии и биоинформатики, Москва, 119991 Россия
2Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, НИИ
физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, Москва, 119991 Россия
'Авторы, внесшие равный вклад в представленную работу.
*E-mail: [email protected]
Поступило в редакцию 18.02.2023
Принято к печати 12.05.2023
DOI: 10.32607/actanaturae.15709
РЕФЕРАТ В результате компьютерного скрининга библиотеки сульфозамещенных соединений выявлены молекулы, способные связываться в активном центре транскетолазы из Mycobacterium tuberculosis. Осуществлена экспериментальная проверка ингибиторной активности наиболее перспективного соединения STK045765 в отношении высокоочищенного препарата рекомбинантного фермента. Показано, что молекула STK045765 конкурирует за участок связывания пирофосфатной группы кофактора тиа-миндифосфата и в микромолярных концентрациях способна подавлять активность микобактериальной транскетолазы. Обнаруженный фурансульфонатный скаффолд может служить основой для создания противотуберкулезных препаратов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА сульфонаты, сульфогруппа, ингибиторы, тиаминдифосфат, транскетолаза, микобак-терии.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ mbTK - транскетолаза микобактерий.
ВВЕДЕНИЕ
Лечение туберкулеза основано на продолжительной многокомпонентной химиотерапии и зачастую сопровождается развитием лекарственной устойчивости у Mycobacterium tuberculosis. В связи с этим чрезвычайно актуален поиск новых молекулярных мишеней и разработка препаратов, способных селективно подавлять развитие микобактерий. Анализ генома штамма H37Rv M. tuberculosis позволил установить метаболические пути, подавление которых может служить основой для разработки новых лекарственных средств. В частности, важное значение имеет пентозофосфатный путь и связанный с ним фермент транскетолаза ^ЬТК) [1, 2]. mbTK катализирует обратимый перенос двухугле-родного фрагмента субстрата-донора (кетосахар) на субстрат-акцептор (альдоза). Один из субстратов mbTK, рибозо-5-фосфат, используется для синтеза клеточной стенки микобактерий [3, 4]. В настоящей работе мы осуществили компьютерный скрининг способности сульфозамещенных соединений связываться в активном центре mbТК и эксперименталь-
ную проверку ингибиторных свойств отобранного наиболее перспективного кандидата.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Молекулярная модель mbТК для докинга была получена на основе кристаллической структуры 3rim [4]. Атомы водорода добавляли с учетом ионизационных свойств аминокислотных остатков в программе AmberTools 1.2, затем их координаты оптимизировали в пакете Amber 12 [5] с использованием алгоритмов наискорейшего спуска и сопряженных градиентов. Библиотека сульфозамещенных соединений для скрининга была сконструирована на основе коммерческого набора низкомолекулярных соединений Vitas-M (https://vitasmlab.biz) с использованием структурного поиска по сульфо-группе в программе ACD/SpectrusDB (https://www. acdlabs.com). Соединения докировали в активный центр модели mbТК с помощью Lead Finder 1.1.16 [6]. Область поиска охватывала участок связывания кофактора тиаминдифосфата и субстрата [7]. При докировании отбирали соединения, способные
к образованию электростатического взаимодействия с ионом Mg2+ (для этого использовали Perl-скрипт структурной фильтрации), а также других благоприятных контактов.
Рекомбинантный белок mbTK получали с использованием плазмиды pET-19b с геном Rv1449c и штамма Escherichia coli BL21(DE3). Выделение и очистку белка проводили как описано ранее [8, 9]. Активность mbTK измеряли по сопряженной реакции восстановления NAD+, катализируемой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой из мышц кролика [10]. Система для измерения активности содержала: глицил-глицин (50 мМ), ди-тиотреитол (3.2 мМ), арсенат натрия (10 мМ), хлорид магния (2.5 мМ), тиаминдифосфат (5 мкМ), ксилулозо-5-фосфат (140 мкМ), рибозо-5-фосфат (560 мкМ), NAD+ (370 мкМ), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (3 Е) и разные концентрации ингибитора STK045765 (0-1000 мкМ). Реакцию начинали добавлением раствора апоформы mbTK в реакционную смесь, инкубируемую в термостати-руемой ячейке при рН 7.6 и 25°С. Скорость реакции регистрировали по увеличению оптической плотности раствора при 340 нм с помощью спектрофотометра Shimadzu UV-1800.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В активном центре mbTK располагается кофактор тиаминдифосфат, а также ион Mg2+ [4]. Взаимодействие пирофосфатной группы с Mg2+ вносит существенный вклад в энергию связывания тиа-миндифосфата и имеет важное значение для дизайна ингибиторов транскетолаз, которые для mbTK до проведения наших исследований не были известны.
В качестве возможного структурного мимети-ка пирофосфатной группы, способного образовать электростатическое взаимодействие с ионами металлов, была выбрана сульфогруппа. Из библиотеки коммерчески доступных низкомолекулярных веществ извлечено 320 молекул с концевой (отрицательно заряженной) сульфогруппой и 563 молекулы с этерифицированной сульфогруппой. В результате докинга определены позиции связывающихся соединений этого класса в активном центре mbTK; полученные результаты были подвергнуты структурной фильтрации, учитывающей наличие прямого электростатического взаимодействия сульфогруппы с Mg2+. При экспертном анализе позиций отобранных соединений идентифицированы пять соединений с концевой сульфогруппой (рис. 1), эффективно взаимодействующих с Mg2+ и окружающими остатками активного центра mbTK. Менее эффективные взаимодействия этерифицированных сульфонатов
У
v
STK045765
-NH
STK330556
о
V
о
6. II
-о
он
STK332172
STK386918
STK396682
Рис. 1. Химические структуры потенциальных ингибиторов mbТК, отобранных в результате компьютерного скрининга
V
His85
sj
Mg2+
Phe464
Рис. 2. Модель фермент-ингибиторного комплекса mbТК и STK045765. Сульфогруппа способна взаимодействовать с ионом Mg2+ и образовать водородную связь с остатком His85, гидрофобный бициклический структурный фрагмент комплементарен участку, сформированному остатками ^211, Leu402 и Phe464. Рисунок подготовлен с использованием VMD 1.9.2 [11]
указывают на то, что для связывания ингибиторов в активном центре тЬТК необходима отрицательно заряженная группа.
Для экспериментального тестирования ин-гибиторных свойств была отобрана молекула STK045765, образующая наиболее благоприятные связи и контакты при моделировании фермент-ингибиторных комплексов. В данной молекуле фу-рансульфонатный и нафталиновый фрагменты соединены гидразидным линкером. Отрицательно заряженная сульфогруппа STK045765 способна взаимодействовать с ионом Mg2+ и боковой цепью His85 (рис. 2) подобно пирофосфатной группе кофактора. Наряду с этим имеют место выгодные гидрофобные контакты бициклического структурного фрагмента STK045765 с боковыми цепями Пе211, Leu402 и Phe464. Экспериментальная проверка подтвердила
82 | ACTA NATURAE | ТОМ 15 № 2 (57) 2023
0 0.25 0.5 1.0
Концентрация STK045765, мМ
Рис. 3. Влияние ингибитора STK045765 на каталитическую активность тЬТК
выводы молекулярного моделирования. При добавлении ингибитора в реакционную смесь обнаружено подавление активности тЬТК: так в присутствии STK045765 в концентрации 1 мМ остаточная активность составила 27% (рис. 3).
ВЫВОДЫ
Компьютерный скрининг библиотеки сульфозамещенных соединений позволил идентифицировать потенциальные ингибиторы, способные связываться в активном центре mbTK и конкурировать с кофактором тиаминдифосфатом. Экспериментальная проверка одного из кандидатов (STK045765, содержащего фурансульфонатную группу) в отношении высокоочищенного препарата mbTK подтвердила, что соединения данного класса способны подавлять ферментативную активность. В результате проведенного исследования обнаружен первый (в своем классе) ингибитор mbTK, структура которого может стать основой для разработки более эффективных ингибиторов - прототипов противотуберкулезных препаратов. •
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 15-14-00069-П).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Cole S.T., Brosch R., Parkhill J., Garnier T., Churcher C., Harris D., Gordon S.V., Eiglmeier K., Gas S., Barry C.E., 3rd, et al. // Nature. 1998. V. 393. P. 537-544.
2. Kolly G.S., Sala C., Vocat A., Cole S.T. // FEMS Microbiol. Lett. 2014. V. 358. P. 30-35.
3. Wolucka B.A. // FEBS J. 2008. V. 275. P. 2691-2711.
4. Fullam E., Pojer F., Bergfors T., Jones T.A., Cole S.T. // Open Biol. 2012. V. 2. P. 110026.
5. Case D.A., Darden T.A., Cheatham T.E., 3rd, Simmerling C.L., Wang J., Duke R.E., Luo R., Walker R.C., Zhang W., Merz K.M., et al. AMBER 12. San Francisco: University of California, 2012.
6. Stroganov O.V., Novikov F.N., Stroylov V.S., Kulkov V., Chilov G.G. // J. Chem. Inf. Model. 2008. V. 48. P. 2371-2385.
7. Lüdtke S., Neumann P., Erixon K.M., Leeper F., Kluger R., Ficner R., Tittmann K. // Nat. Chem. 2013. V. 5. P. 762-767.
8. Щербакова Т.А., Балдин С.М., Шумков М.С., Гущина И.В., Нилов Д.К., Швядас В.К. // Acta Naturae. 2022. Т. 14. № 2. С. 93-97.
9. Мешалкина Л.Е., Соловьева О.Н., Ходак Ю.А., Друца В.Л., Кочетов Г.А. // Биохимия. 2010. Т. 75. С. 992-1000.
10. Kochetov G.A. // Methods Enzymol. 1982. V. 90. P. 209-223.
11. Humphrey W., Dalke A., Schulten K. // J. Mol. Graph. 1996. V. 14. P. 33-38.
