CC BY
0
ISSN pr. 2412-608Х, ISSN on. 2412-6098 Масличные культуры. Вып. 2 (198). 2024
Научная статья
УДК 633.853.52:631.522
DOI: 10.25230/2412-608Х-2024-2-198-10-15
Поиск информативных SSR-маркеров для паспортизации сортов сои
Виолетта Георгиевна Савиченко Светлана Алекеевна Рамазанова Саида Заурбиевна Гучетль
ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК
Россия, 350038, г. Краснодар, ул. им. Филатова, д. 17 psld.leta@mail.ru
Реферат. Соя является важной культурой в обеспечении продовольственной безопасности страны. Создание новых сортов сои и включение их в Госреестр будет сопровождаться генетической паспортизацией. Целью исследования стал поиск информативных SSR-локусов для дополнения существующей системы ДНК-маркеров для паспортизации сои. Из базы данных SoyBase с помощью онлайн инструмента Primer-BLAST отобрали 27 SSR-локусов. Информативность мик-росателлитных локусов была оценена на 20 сортах сои. ПЦР-продукты разделяли в ПААГ в денатурирующих условиях. Из 27 отобранных in silico микросателлитных локусов были выбраны 13 высокоинформативных (PIC 0,50-0,72) и пять информативных (PIC 0,44-0,49). Отобранные в результате настоящего исследования микросател-литные локусы могут быть использованы для ге-нотипирования и, совместно с апробированными нами ранее ДНК-маркерами, для паспортизации сортов сои.
Ключевые слова: соя, Glycine max (L.), идентификация, паспортизация, ДНК-маркеры, микросателлиты, SSR
Для цитирования: Савиченко В.Г., Рамазанова С.А., Гучетль С.З. Поиск информативных SSR-маркеров для паспортизации сортов сои // Масличные культуры. 2024. Вып. 2 (198). С. 10-15.
UDC 633.853.52:631.522
Search of informative SSR-markers for soybean cultivars passportization Savichenko V.G., junior researcher Ramazanova S.A., leading researcher, PhD in biology Guchetl S.Z., head of the lab., leading researcher, PhD in biology
V.S. Pustovoit All-Russian Research Institute of Oil Crops
17 Filatova str., Krasnodar, 350038, Russia psld.leta@mail.ru
Abstract. Soybean is one of the important crop contributing to food security. The development of new soybean cultivars and their including into the State Register will be confirmed by genetic passportization. The purpose of the research was a search of informative SSR-loci too add the existing system of DNA-markers for soybean passportization. We selected 27 SSR-loci from SoyBase using an online instrument Primer-BLAST. The information capacity of microsatellite loci was estimated in 20 soybean cultivars. PCR-products were divided in PAAG in denaturing conditions. We allocated 13 highly informative (PIC 0.50-0.72) and five informative (PIC 0.44-0.49) microsatellite loci from 27 ones selected in silico. Selected in the research loci can be used for genotyping and jointly with tested earlier DNA-markers for soybean passportization.
Key words: soybean, Glycine max (L.), identification, passportization, DNA-markers, microsatellites, SSR
Введение. По данным SoyStats [1], около 60 % мирового производства масличных культур приходится на сою. Это связано с ее уникальным биохимическим составом, благодаря которому культура получила широкие возможности использования. Увеличение производства сои наблюдается и в Российской Федерации [2]. Этому способствует создание новых высокоурожайных сортов, устойчивых к различным биотическим и абиотическим факторам.
В последние годы в селекции сельскохозяйственных культур эффективно применяют методы молекулярно-гене-тического анализа. Их используют при оценке селекционного материала, паспортизации и идентификации генотипов. В связи с изменениями в законе «О семеноводстве» [3] генетическая паспортизация станет обязательной для сортов и гибридов сельскохозяйственных растений, включенных в утвержденный перечень, в том числе и для сои. Общепринятая методика генетической паспортизации отсутствует. Поэтому необходимы исследо-
вания по разработке таких методик, специфичных для каждой культуры.
Эффективность использования микро-сателлитных (SSR) маркеров для геноти-пирования сои и других культур была показана разными исследованиями [4; 5; 6; 7; 8]. Данный тип маркеров имеет высокий уровень полиморфизма, кодоми-нантный тип наследования, высокую воспроизводимость результатов анализа, относительную простоту детекции. Это делает их пригодными для многих задач: составления генетических карт, изучения генетического разнообразия, идентификации и паспортизации сортов и гибридов сельскохозяйственных культур [9].
Ранее нами были отобраны микроса-теллитные локусы, которые используются в настоящее время в качестве ДНК-маркеров для генетической идентификации новых сортов сои селекции ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК. Наши исследования показали высокий уровень информативности применяемых SSR-локусов, однако этого оказалось недостаточно для различия некоторых сортов [10; 11]. Поэтому целью настоящего исследования стал поиск информативных SSR-локусов для дополнения существующей системы ДНК-маркеров для паспортизации сортов сои.
Материалы и методы. Для исследования были выбраны 20 сортов сои разного происхождения, полученные с Армавирской опытной станции и центральной экспериментальной базы ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК (T-25, Ходсон, Витязь 50, Сибириада, Локус, Кубанская 4958, Кубань, Уника, ВНИИМК 3895, ВНИИМК 9186, Элана, Дельта, Дока, За-ра, Весточка, Пума, Саяна, Триада), а также из коллекции генетических ресурсов растений ВИР (Williams 82, Lee). ДНК выделяли из смеси осевых органов зародышей 10 семян каждого сорта набором реагентов DiamondDNA Plant (ООО АВТ, РФ) согласно прилагаемой инструкции. Оценку качества и количества выделенной ДНК проводили с помощью
микроспектрофотометра Nano-300 (Allsheng, КНР).
Поиск микросателлитных локусов и фланкирующих последовательностей осуществляли в базе данных SoyBase [12]. Проверку специфичности отжига прайме-ров, температур их плавления и размера ожидаемого фрагмента проводили in silico с помощью онлайн инструмента Primer-BLAST [13; 14].
Для подбора оптимальной температуры отжига праймеров с каждой парой проводили экспериментальные ПЦР в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2,5 мкл 10х ПЦР-буфера, 1,5-3,0 мМ MgCl2 (НПО «СибЭнзим», РФ), 200 мкМ каждого dNTP («Евроген», РФ), 0,5 мкМ каждого праймера, 0,1 мкл SynTaq ДНК полимеразы (ООО «Синтол», РФ), 4050 нг геномной ДНК и деионизированную воду. Амплификацию осуществляли при следующих температурно-временных режимах: начальная денатурация при 96 °С в течение 2 мин; затем 35 циклов: денатурация при 94 °С - 30 сек, отжиг при 5065 °С - 40 сек, элонгация при 70 °С -
1 мин, финальная элонгация при 70 °С -
2 мин в термоциклере MiniAmp Plus (Thermo Fisher, США) в независимых температурных блоках (Veriflex) с изменением температуры отжига на 2-3 °С. ПЦР-продукты разделяли в 2%-ом ага-розном геле, окрашенном бромистым этидием, в камере горизонтального электрофореза SE-2 (Хеликон, РФ) при силе тока 90 mA и напряжении 180 V в течение 30 мин. Визуализация результатов электрофореза обеспечивалась с помощью гель-документирующей системы GenoSens Touch 2200 (Clinx Science Instruments, КНР) в УФ-лучах.
Далее ПЦР с каждой парой праймеров проводили по вышеописанному протоколу при подобранной оптимальной температуре отжига. Полученные ПЦР-продукты разделяли в 8%-ом полиакри-ламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях в камере для вертикального электрофореза VE-20 (Хеликон, РФ) при
параметрах силы тока и напряжения -200 mA, 800 V, предварительно денатурируя пробы. Гели окрашивали нитратом серебра и документировали на приборе GenoSens Touch 2200 на экране белого света.
Информативность микросателлитных локусов оценивали по следующим показателям: наблюдаемое (na) и эффективное число аллелей (ne), индекс полиморфного информационного содержания (PIC).
Результаты и обсуждение. Для идентификации сортов сои в дополнение к ранее изученным микросателлитам из базы данных SoyBase отбирали локусы, содержащие три- и тетрануклеотидные микро-сателлитные повторы. Динуклеотидные микросателлитные локусы в исследование не включали, поскольку при их амплификации чаще образуются дополнительные ПЦР-продукты, отличающиеся на 1-2 повтора (статтеры), которые затрудняют интерпретацию результатов фрагментного анализа.
Последовательности праймеров, фланкирующих локусы, отобранные на первом этапе, проверяли с помощью онлайн инструмента Primer-BLAST на референсном геноме сои Glycine_max_v4.0 (Williams 82). Проверку осуществляли по следующим параметрам: отсутствие неспецифического связывания с ДНК матрицей; низкая вариабельность температуры плавления между праймерами (не более 3 °С); размер ожидаемого ПЦР-продукта (от 100 до 500 п.н.). Маркеры, не отвечающие вышеперечисленным параметрам, исключались из дальнейшего исследования. В результате проведенной работы in silico было отобрано 27 микро-сателлитных локусов (табл. 1).
Следующим этапом работы стала оптимизация температуры отжига прайме-ров. За основу были взяты данные температур плавления (Tm) из Primer-BLAST, но поскольку значения температуры плавления отличаются от значений
температуры отжига (Та), требуется их экспериментальная оптимизация. Для этого с каждой парой праймеров проводили ПЦР, изменяя в протоколе амплификации температуру отжига на 2-3 °С.
Таблица 1
Характеристика микросателлитных локусов ДНК сои на основе данных сборки генома Glycine_max_v4.0
№ Локус Хромосома Мотив Размер фрамен-та, п.н.
1 SATT631 3 (ATT)16 152
2 SATT549 3 (TAT)21 244
3 SATT257 3 (ATA)10 251
4 SATT713 4 (TTAT)3 254
5 AW277661 4 (TAT)23 250
6 SATT684 5 (ATA)17 188
7 SATT471 5 (TAT)18 241
8 CSSR531 7 (TAA)13 245
9 SATT636 7 (ATT)22 172
10 SATT207 8 (ATA)24 239
11 SATT333 8 (TAT)22 191
12 SATT500 10 (TAA)21 308
13 SATT633 10 (TAA)12 131
14 SATT638 11 (ATA)13 174
15 SATT359 11 (TAT)15 178
16 SATT635 12 (ATA)7 172
17 SATT353 12 (TTA)17 170
18 SATT304 14 (TAA)30 225
19 SATT168 14 (ATA)17 226
20 SATT651 15 (ATA)10 169
21 SATT263 15 (TTA)19 222
22 SATT287 16 (ATA)18 228
23 SAT222 17 (TTCT)3 168
24 SATT311 17 (AAT)13 181
25 SATT398 19 (ATTA)3 184
26 SATT292 20 (ATA)16 236
27 SATT614 20 (TTA)38 309
Выбор оптимального значения температуры отжига основывался на полученных спектрах ДНК в результате электрофоретического разделения ПЦР-продуктов в агарозном геле. Оптимальной считалась температура отжига, при которой были получены четкие профили ДНК, находящиеся в характерном для каждого локуса диапазоне размера фрагментов, неспецифичные фрагменты отсутствовали. Полученные значения температуры отжига в сравнении с расчетной температурой плавления представлены в таблице 2.
Таблица 2
Оптимизация температуры отжига праймеров микросателлитных локусов ДНК сои
№ Локус T °С Ta, °С
1 8ай631 62,0 58,0
2 Satt549 62,0 60,0
3 Satt257 59,0 60,0
4 Satt713 60,0 60,0
5 AW277661 59,5 64,0
6 Satt684 57,0 60,0
7 Satt471 59,5 60,0
8 CSSR531 54,0 60,0
9 Satt636 59,0 60,0
10 Satt207 58,5 58,0
11 Satt333 61,5 64,0
12 Satt500 59,0 60,0
13 Satt633 60,5 64,0
14 Satt638 61,0 60,0
15 Satt359 57,5 58,0
16 Satt635 58,5 58,0
17 Satt353 61,5 64,0
18 Satt304 58,5 60,0
19 Satt168 55,5 58,0
20 Satt651 61,0 60,0
21 Satt263 55,5 60,0
22 Satt287 59,5 60,0
23 Sat222 63,0 64,0
24 Satt311 59,5 60,0
25 Satt398 62,5 60,0
26 Satt292 59,0 60,0
27 Satt614 58,5 60,0
Tm - температура плавления праймеров из Primer-BLAST;
Та - температура отжига праймеров экспериментально подобранная
Как видно из таблицы 2, значения температуры отжига отличались от расчетных температур плавления у всех праймеров. Температура отжига праймеров разных локусов варьировала от 58 до 64 °С. Для создания технологии геноти-пирования сортов сои на основе SSR-маркеров необходимо учитывать, что при проведении мультиплексной ПЦР прай-меры должны гибридизоваться при одинаковой температуре. Соответственно, праймеры из разных температурных групп не могут входить в состав мультиплексной реакции, поскольку это снизит их специфичность или вовсе исключит амплификацию.
Информативность изучаемых локусов определяли на 20 сортах сои разного происхождения. Продукты ПЦР разделяли в ПААГ в денатурирующих условиях. По полученным электрофореграммам уста-
навливали наличие/отсутствие специфичных и неспецифичных фракций, полиморфизм выявленных фрагментов ДНК (аллелей). В ходе исследования локусы Satt311 и Satt398 были исключены, поскольку результаты амплификации с ними были нестабильны. При анализе локуса Sаtt631 были выявлены неспецифичные фракции, а локусов Satt257 и Satt713 - нулевые аллели, поэтому данные локусы также были исключены из дальнейшего исследования.
Для оценки уровня информативности микросателлитных локусов рассчитывали эффективное число аллелей (ne) и индекс полиморфного информационного содержания (PIC). Результаты расчетов представлены в таблице 3.
Таблица 3
Основные показатели информативности микросателлитных локусов ДНК сои
№ Локус na Пе PIC
1 8ай631 - - -
2 Satt549 3 2,38 0,49
3 Satt257 - - -
4 Satt713 - - -
5 AW277661 4 2,63 0,54
6 Satt684 4 2,78 0,58
7 Satt471 2 1,72 0,33
8 CSSR531 4 2,40 0,56
9 Satt636 4 2,45 0,50
10 Satt207 4 2,86 0,56
11 Satt333 4 2,17 0,49
12 Satt500 3 2,33 0,48
13 Satt633 2 2,00 0,38
14 Satt638 2 1,35 0,22
15 Satt359 3 2,17 0,47
16 Satt635 4 3,23 0,63
17 Satt353 3 2,22 0,44
18 Satt304 2 1,47 0,27
19 Satt168 5 4,00 0,71
20 Satt651 4 2,90 0,66
21 Satt263 3 2,78 0,56
22 Satt287 4 2,50 0,55
23 Sat222 3 2,50 0,53
24 Satt311 - - -
25 Satt398 - - -
26 Satt292 4 4,00 0,70
27 Satt614 5 4,17 0,72
Па - наблюдаемое число аллелей;
ne - эффективное число аллелей;
PIC - индекс полиморфного информационного
содержания
По анализируемым локусам было выявлено от 2 до 5 аллелей. При этом эффективное число аллелей варьировало от 1,35 (Satt638) до 4,17 (Satt614), а индекс полиморфного информационного содержания - от 0,22 до 0,72 у этих же локусов. Для идентификации сортов и гибридов сельскохозяйственных культур предпочтительнее использовать маркеры, выявляющие три и более аллельных варианта. Поэтому локусы Satt471, Satt633, Satt638 и Satt304 были исключены (na = 2). К высокоинформативным (PIC > 0,5) в нашем исследовании можно отнести большинство микросателлитных локусов: Satt614, Satt168, Satt292, Satt651, Satt635, Satt684, CSSR531, Satt207, Satt263, Satt287, AW277661, Sat222, Satt636. Поскольку паспортизацию планируется проводить с помощью метода капиллярного электрофореза, разрешающая способность и точность которого выше применяемого в настоящем исследовании метода, оценка информативности является предварительной. Поэтому локусы, обладающие меньшим уровнем полиморфизма (со значением PIC от 0,44 до 0,49), не исключаются из дальнейшего исследования и также могут быть использованы для паспортизации сортов сои.
Заключение. В результате исследования in silico было отобрано 27 микроса-теллитных локусов, отвечающих заданным параметрам. Экспериментально подобрана температура отжига праймеров для проведения ПЦР с ними. По данным нашего исследования 13 SSR-локусов оказались высокоинформативными (PIC > 0,5), еще пять обладали меньшим уровнем полиморфизма, но также были информативны (PIC 0,44-0,49). Отобранные в результате настоящего исследования микросателлитные локусы могут быть использованы для генотипирования и, совместно с апробированными нами ранее ДНК-маркерами, для паспортизации сортов сои.
Список литературы
1. SoyStats: [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://soystats.com/international-world-oilseed-production/ (дата обращения: 13.02.2024).
2. FAOSTAT: [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.fao.org/faostat/ru/ (дата обращения: 13.02.2024).
3. Федеральный закон от 30.12.2021 (в ред. 04.08.2023) № 454-ФЗ «О семеноводстве» // Собрание законодательства РФ (ч. I). - 03.01.2022. -№ 1. ст. 23.
4. Zatybekov A., Yermagambetova M., Genievs-kaya Y., Didorenko S., Abugalieva S. Genetic diversity analysis of soybean collection using simple sequence repeat markers // Plants. - 2023. - 12. - 3445. DOI: 10.3390/plants12193445.
5. Gupta S.K., Manjaya J.G. Genetic diversity and population structure of Indian soybean [Glycine max (L.) Merr.] revealed by simple sequence repeat markers // Journal of Crop Science and Biotechnology. -2017. - No 20. - P. 221-231. DOI: 10.1007/s12892-017-0023-0.
6. Гайнуллина К.П., Кулуев Б.Р., Давлетов Ф.А. Оценка генетического разнообразия сортов и линий гороха с помощью SSR-анализа // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. -
2020. - № 181 (3). - С. 70-80. DOI: 10.30901/22278834-2020-3-70-80.
7. Ильницкая Е.Т., Макаркина М.В., Степанов И.В., Супрун И.И., Токмаков С.В., Айба В.Ш., Авидзба М.А., Котляр В.К. Генетический полиморфизм аборигенных абхазских сортов винограда // Вавиловский журнал генетики и селекции. -
2021. - 25 (8). - С. 797-804. DOI: 10.18699/VJ21.092.
8. Колобова О.С., Малюченко О.П., Шалаева Т.В., Шанина Е.П., Шилов И.А., Алексеев Я.И., Велишаева Н.С. Генетическая паспортизация картофеля на основе мультиплексного анализа 10 микросателлитных маркеров // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2017. - № 21 (1). - С. 124-127. DOI: 10.18699/VJ17.230.
9. Канукова К.Р., Газаев И.Х., Сабанчиева Л.К., Боготова З.И., Аппаев С.П. ДНК-маркеры в растениеводстве // Известия Кабардино-Балкарского научного центра РАН. - 2019. - № 6 (92). - С. 220-232.
10. Савиченко В.Г., Рамазанова С.А. Идентификация сортов сои (Glycine max L.) селекции ВНИИМК методом микросателлитного анализа // Сб. мат-лов 11 -й Всероссийской конф. молод. уч. и спец. «Актуальные вопросы биологии, селекции, технологии возделывания и переработки сельскохозяйственных культур». - Краснодар, 2021. - С. 97-101.
11. Савиченко В.Г. Идентификация сортов сои на основе полиморфизма SSR-маркеров // Научные труды Северо-Кавказского федерального
научного центра садоводства, виноградарства, виноделия. - 2023. - Т. 37. - С. 68-72.
12. SoyBase. Integrating Genetics and Genomics to Advance Soybean Research [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://soybase.org/ (дата обращения: 21.01.2024).
13. Primer-BLAST: [Электронный ресурс]. -Режим доступа: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast (дата обращения: 21.01.2024).
14. Ye J., Coulouris G., Zaretskaya I. [et al.]. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction // BMC Bioinformatics. -2012. - Vol. 13. - Art. No. 134. DOI: 10.1186/14712105-13-134.
References
1. SoyStats: [Elektronnyy resurs]. - Rezhim dostupa: http://soystats.com/international-world-oilseed-production/ (data obrashcheniya: 13.02.2024).
2. FAOSTAT: [Elektronnyy resurs]. - Rezhim dostupa: https://www.fao.org/faostat/ru/ (data obrashcheniya: 13.02.2024).
3. Federal'nyy zakon ot 30.12.2021 (v red. 04.08.2023) № 454-FZ «O semenovodstve» // So-branie zakonodatel'stva RF (ch. I). - 03.01.2022. - № 1. st. 23.
4. Zatybekov A., Yermagambetova M., Genievs-kaya Y., Didorenko S., Abugalieva S. Genetic diversity analysis of soybean collection using simple sequence repeat markers // Plants. - 2023. - 12. - 3445. DOI: 10.3390/plants12193445.
5. Gupta S.K., Manjaya J.G. Genetic diversity and population structure of Indian soybean [Glycine max (L.) Merr.] revealed by simple sequence repeat markers // Journal of Crop Science and Biotechnology. -2017. - No 20. - P. 221-231. DOI: 10.1007/s12892-017-0023-0.
6. Gaynullina K.P., Kuluev B.R., Davletov F.A. Otsenka geneticheskogo raznoobraziya sortov i liniy gorokha s pomoshch'yu SSR-analiza // Trudy po prikladnoy botanike, genetike i selektsii. - 2020. - № 181 (3). - S. 70-80. DOI: 10.30901/2227-8834-20203-70-80.
7. Il'nitskaya E.T., Makarkina M.V., Stepanov I.V., Suprun I.I., Tokmakov S.V., Ayba V.Sh., Avidzba M.A., Kotlyar V.K. Geneticheskiy polimorfizm aborigennykh abkhazskikh sortov vinograda // Vavilovskiy zhurnal genetiki i selektsii. -2021. - 25 (8). - S. 797-804. DOI: 10.18699/VJ21.092.
8. Kolobova O.S., Malyuchenko O.P., Shalaeva T.V., Shanina E.P., Shilov I.A., Alekseev Ya.I., Velishaeva N.S. Geneticheskaya pasportizatsiya kartofelya na osnove mul'tipleksnogo analiza 10 mikrosatellitnykh markerov // Vavilovskiy zhurnal genetiki i selektsii. - 2017. - № 21 (1). - S. 124-127. DOI: 10.18699/VJ17.230.
9. Kanukova K.R., Gazaev I.Kh., Sabanchieva L.K., Bogotova Z.I., Appaev S.P. DNK-markery v rastenievodstve // Izvestiya Kabardino-Balkarskogo nauchnogo tsentra RAN. - 2019. - № 6 (92). - S. 220-232.
10. Savichenko V.G., Ramazanova S.A. Identifikatsiya sortov soi (Glycine max L.) selektsii VNIIMK metodom mikrosatellitnogo analiza // Sb. mat-lov 11-y Vserossiyskoy konf. molod. uch. i spets. «Aktual'nye voprosy biologii, selektsii, tekhnologii vozdelyvaniya i pererabotki sel'skokhozyaystvennykh kul'tur». - Krasnodar, 2021. - S. 97-101.
11. Savichenko V.G. Identifikatsiya sortov soi na osnove polimorfizma SSR-markerov // Nauchnye trudy Severo-Kavkazskogo federal'nogo nauchnogo tsentra sadovodstva, vinogradarstva, vinodeliya. -2023. - T. 37. - S. 68-72.
12. SoyBase. Integrating Genetics and Genomics to Advance Soybean Research [Elektronnyy resurs]. -Rezhim dostupa: https://soybase.org/ (data obrashcheniya: 21.01.2024).
13. Primer-BLAST: [Elektronnyy resurs]. -Rezhim dostupa: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ tools/primer-blast (data obrashcheniya: 21.01.2024).
14. Ye J., Coulouris G., Zaretskaya I. [et al.]. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction // BMC Bioinformatics. -2012. - Vol. 13. - Art. No. 134. DOI: 10.1186/14712105-13-134.
Сведения об авторах
B.Г. Савиченко, млад. науч. сотр.
C.А. Рамазанова, вед. науч. сотр., канд. биол. наук С.З. Гучетль, зав. лаб., вед. науч. сотр., канд. биол. наук
Получено/Received 05.03.2024
Получено после рецензии/Manuscript peer-reviewed 12.03.2024
Получено после доработки/Manuscript revised 22.03.2024 Принято/A ccepted
25.04.2024 Manuscript on-line 30.06.2024
