CC BY
29
genetic basis of ecosystems evolution
27
DOI: 10.17816/ecogen16127-34
поиск и видовая идентификация патогенов природно-траногенного вида linaria vulgaris
© С.В. Сокорнова 2, Е.л. Гасич В.Д. Бемова 2, т.В. матвеева 2
1 ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений», Санкт-Петербург;
2 ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург
Для цитирования: Сокорнова С.В., Гасич Е.Л., Бемова В.Д., Матвеева Т.В. Поиск и видовая идентификация патогенов природно-трансгенного
вида Linaria vulgaris// Экологическая генетика. - 2018. - Т. 16. - № 1. - С. 27-34. doi: 10.17816/ecogen16127-34.
Поступила в редакцию: 20.10.2017 Принята к печати: 29.01.2018
' В природе встречаются виды, содержащие в геномах гомологи генов Т-ДНК агробактерий (клТ-ДНК). Их называют природно-трансгенными. Среди возможных функций клТ-ДНК в литературе обсуждают ее влияние на микробиоту растений. Для изучения возможной экологической роли Т-ДНК больше других подходят представители рода Linaria (например, L. vulgaris), поскольку они широко встречаются в различных экологических нишах. Первым этапом оценки растительно-микробных взаимодействий с участием этих растений является описание изолятов с контрастной вирулентностью в отношении льнянок. Поиск и ДНК-штрихкодирование таких изолятов фомоидных грибов стало целью данной работы. Для видоидентификации 14 штаммов, выделенных с растений семейств Plantaginaceae и Scrophullariaceae, использовали мультилокусный анализ по участкам внутренних транскрибируемых спейсеров, большой субъединицы РНК, гена тубулина. Вирулентность оценивали на отрезках листьев. К виду Boeremia exigua, имеющему обширный ареал обитания и широкую специализацию, были отнесены 9 штаммов. Штаммы этого вида были вирулентны в отношении L. vulgaris, но различались по агрессивности в отношении этого растения. Таким образом, была охарактеризована коллекция штаммов, которая в дальнейшем может быть использована для более детального изучения иммунного ответа при-родно-трансгенного растения L. vulgaris в ответ на инокуляцию фитопатогеном B. exigua. Итогом выполнения работы стала идентификация узкоспециализированного вида Heterophoma novae-verbascicola и широко специализированных видов Plectosphaerella cucumerina, Phoma herbarum и Trichothecium roseum, среди которых только P. cucumerina был слабым патогеном льнянок. Результаты подтверждают ранее полученные данные об обедненной микобиоте L. vulgaris.
' ключевые слова: природно-трансгенные растения; Linaria vulgaris; Boeremia exigua; идентификация фомоидных микромицетов.
CHARACTERIZATION AND IDENTIFICATION OF NATURALLY TRANSGENIC SPECIES linaria vulgaris PATHOGENIC MYCROMYCETES
© S.V. Sokornova >• 2, E.L. Gasich >, V.D. Bemova 2, T.V. Matveeva 2
1 All-Russian Institute of Plant Protection, Saint Petersburg, Russia; 2 Saint Petersburg State University, Saint Petersburg, Russia
For citation: Sokornova SV, Gasich EL, Bemova VD, Matveeva TV Characterization and identification of naturally transgenic species Linaria vulgaris
pathogenic mycromycetes. Ecological genetics. 2018;16(1):27-34. doi: 10.17816/ecogen16127-34.
Received: 20.10.2017 Accepted: 29.01.2018
& In nature there are species containing homologs of T-DNA genes of agrobacteria (cT-DNA) in their genomes. Such plants are called naturally transgenic ones. Interaction with the microbiota is one of the possible functions of cT-DNA, discussed in the literature. Linaria plants are the most suitable for the investigation of the probable ecological role of T-DNA, since they widely spread. The first stage in the evaluation of plant-microbial interactions involving these plants is the description of isolates with contrasting virulence for toadflax. The search and DNA-barcoding of such isolates of Phoma-like fungi was the goal of this work. 14 strains isolated from the plants of the families Plantaginaceae and Scrophullariaceae were analyzed. The of multilocus analysis included amplification and sequencing of internal transcribed spacers, a large subunit of RNA, a tubulin gene. Based on molecular data, 9 strains were assigned to the species Boeremia exigua, which has a wide range of habitats and a wide specialization. Strains of this species were virulent against L. vulgaris, but differed in aggressiveness with respect to this plant. Thus, a collection of strains was characterized, which can later be used for a more detailed study of the immune response of the naturally-transgenic L. vulgaris plant in response to inoculation with the B. exigua phytopathogen. As a result of the work, we
identified the narrow host range fungi Heterophoma novae-verbascicola, and broad host range pathogens Plectosphaerella cucumerina, Phoma herbarum and Trichothecium roseum. Among them, only P. cucumerina was a weak pathogen of L. vulgaris. These results confirm the early data on the depleted mycobiota of L. vulgaris.
& Keywords: naturally transgenic plants; Linaria vulgaris; Boeremia exigua; identification of Phoma-like fungi.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящий момент известно три рода растений Nicotiana, Ipomoea и Linaria, в пределах которых выявлены представители, содержащие в геноме участки ДНК, гомологичной Т-ДНК агробактерий, как результат горизонтального переноса генов. Многочисленные исследования показывают, что у природно-трансгенных растений, относящихся к родам nicotiana и Ipomoea, экспрессируются гены Т-ДНК [1, 2]. Недавно была продемонстрирована экспрессия гена rolC и у льнянок [3]. Это свидетельствует о том, что клТ-ДНК функциональна. На каллусных культурах показано влияние онкогенов rolA, rolB и rolC Agrobacterium rhizogenes на повышение стресс-устойчивости, в том числе за счет повышения уровня вторичных метаболитов, образования активных форм кислорода, экспрессии PR-белков и изменения путей метаболизма сахарозы [4—7]. Ряд этих механизмов растения реализуют при защите от патогенных микромицетов, но на данный момент не изучена устойчивость к болезням у видов, экспрессиру-ющих гены rola, rolB и rolC. Из природно-трансгенных растений только льнянки широко распространены в дикой природе [8]. Поэтому они могут служить моделью для изучения возможной экологической роли горизонтально перенесенных в их геномы последовательностей ДНК. Для этого требуется проведение большой подготовительной работы в разных направлениях, в том числе необходимы детальные исследования возможных межвидовых взаимодействий с участием льнянок. Частным случаем таких взаимодействий являются отношения растение — фитопатоген. На начальных этапах данного исследования необходимо выявить наиболее распространенных и агрессивных в отношении льнянок патогенов. Обедненный состав микобиоты природно-трансгенного вида Linaria vulgaris, преимущественно состоящий из фомоидного микромицета Boeremia exigua (Desm.) Aveskamp, Gruyter & Verkley (= Phoma exigua var. exigua), а также представителей родов Ramularia и Phomopsis может служить косвенным доказательством возможной роли rolC в регуляции устойчивости к патогенам [9]. Идентификация фомоидных патогенов затруднена из-за схожести морфолого-куль-туральных признаков, так как у представителей близкородственных секций размер конидий, характер роста на агаре и другие признаки могут быть неразличимы [10]. В то же время даже у близкородственных видов парази-то-хозяинные отношения имеют свои особенности как со стороны микромицета, так и со стороны ответа растения. Поэтому точная видоидентификация патогенов
природно-трансгенных льнянок представляет особый интерес. Эта работа важна для обнаружения и паспортизации изолятов, характеризующихся контрастными проявлениями вирулентности, так как это позволит в дальнейшем создать коллекцию для определения особенности иммунного ответа трансгенных растений при заражении. Ранее было показано, что патогенами льнянок являются преимущественно фомоидные ми-кромицеты [9]. Филогенетическая специализация этих патогенов различна. Есть как узкоспециализированные виды, приуроченные к растениям, лежащим в пределах одного семейства, так и виды, способные заражать представителей более 10 семейств [10]. Для расширения коллекции фитопатогенных микромицетов с различной агрессивностью в отношении льнянок был проведен дополнительный скрининг среди фитопатоге-нов семейства Plantaginaceae, а также родственного ему семейства Scrophullariaceae (куда ранее относили льнянку). Поэтому в данную работу вошел материал, собранный не только на растениях L. vulgaris, но и на видах Plantago major, Veronica sp. (Plantaginaceae), Verbascum sp, Verbascum thapsus (Scrophullariaceae). Для видоидентификации фомоидных грибов на практике широко используются молекулярные методы, в частности мультилокусный анализ по участкам внутренних транскрибируемых спейсеров, большой субъединицы РНК, гена тубулина [11, 12]. Таким образом, целью данной работы стала уточняющая идентификация видов, встречающихся на растениях семейств Plantaginaceae и Scrophullariaceae, оценка их вирулентности в отношении природно-трансгенного растения L. vulgaris, создание коллекции штаммов для изучения влияния генов клТ-ДНК на взаимодействие растений льнянки с фомо-идными микромицетами.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В работе использовали штаммы из коллекции лабораторий микологии и фитопатологии и токсикологии и биотехнологии ФГБНУ ВИЗР, хранящиеся при 5 °C в пробирках на скошенном картофельно-глюкозном агаре (КГА) (табл. 1).
Патогенность штаммов оценивали методом заражения листовых дисков [9].
Для получения препарата ДНК фрагменты мицелия гриба объемом около 10 мкл помещали в микроцентрифужную пробирку, содержащую 500 мкл буфера ТЕ. Далее пробирку инкубировали в течение 10 минут на кипящей водяной бане, затем центрифугировали 3 минуты при 8000 g, далее 1 мкл надосадочной
GENETIC BASIS oF ECoSYSTEMS EVoLUTioN
29
Таблица 1
Штаммы микромицетов, использованных в работе
Table 1
Strains of micromycetes used in the researchwork
№ Маркировка Семейство Вид Место
1 12_18 Scrophulariaceae Verbascum sp. Липецк
2 17_39 Plantaginaceae Plantago major Лен. обл., Гатчинский р-н
3 17_82 Plantaginaceae Plantago major Лен. обл., Ломоносовский р-н, п. Горелово
4 17_87 Plantaginaceae Plantago major Лен. обл., Ломоносовский р-н, п. Горелово
5 32_11 Plantaginaceae Plantago major Лен. обл., Кировский р-н, п. Назия
6 32_13 Plantaginaceae Plantago major Московская обл., Голицыно
7 32_25 Plantaginaceae Plantago major Ростовская обл., Славский р-н
8 32_36 Scrophulariaceae Verbascum nigrum Ставрополь
9 32_150 Scrophulariaceae Verbascum thapsus Адыгея, Майкопский район, п. Подгорный
10 32_151 Plantaginaceae Veronica sp. Иркутская обл.
11 32_226 Plantaginaceae Plantago major Сев. Осетия, Даргавс
12 Ph 6 Plantaginaceae Linaria vulgaris Тульская обл.
13 263_Ph6 Plantaginaceae Linaria vulgaris Тульская обл.
14 263_Ph6_2 Plantaginaceae Linaria vulgaris Тульская обл.
Таблица 2
Праймеры, использованные в работе
Table 2
Primers, used in the researchwork
№ Название Последовательность 5'—3' Ссылка
1 ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC 14
2 ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG
3 LROR GTACCCGCTGAACTTAAGC 15
4 LR5 TCCTGAGGGAAACTTCG 16
5 T1 AACATGCGTGAGATTGTAAGT 17
6 T2 TAGTGACCCTTGGCCCAGTTG
7 Btub2Fd GTBCACCTYCARACCGGYCARTG 18
8 Btub4Rd CCRGAYTGRCCRAARACRAAGTTGTC
Таблица 3
Референсные последовательности
Table 3
Reference sequences
№ Номер GenBank Растение-хозяин Семейство Место обнаружения
1 LT158235.1 Glycine max Fabaceae Китай, Цзилинь
2 KT309446.1 Cytisus scoparius Fabaceae Новая Зеландия
3 KT309407.1 Cynara scolymus Asteraceae Новая Зеландия
4 KT309519.1 Cynara scolymus Asteraceae Новая Зеландия
5 GU237495.1 Cichorium intybus Asteraceae Нидерланды
6 KT309512.1 Fragaria ananassa Rosaceae Новая Зеландия
окончание табл. 3 (table 3 (continued))
№ Номер GenBank Растение-хозяин Семейство Место обнаружения
7 КТ309489.1 Linum usitatissimum Linaceae Венгрия
8 GU237499.1 Linum usitatissimum Linaceae Нидерланды
9 GU237500.1 Linum usitatissimum Linaceae Нидерланды
10 KT389784.1 Nicotiana tabacum Solanaceae Китай, Пекин
11 KT309500.1 Lycopersicon esculentum Solanaceae Новая Зеландия
12 KR653202.1 Ipomoea batatas Solanaceae Китай, Ханчжоу
13 KR653203.1 Ipomoea batatas Solanaceae Китай, Ханчжоу
14 KR653201.1 Ipomoea batatas Solanaceae Китай, Ханчжоу
15 KT309617.1 Cyphomandra betacea Solanaceae Новая Зеландия
16 FJ427112.1 Solanum tuberosum Solanaceae Нидерланды
17 KT309470.1 Actinidia chinensis actinidiaceae Новая Зеландия
18 GU237493.1 Forsythia sp. oleaceae Нидерланды
19 GU237494.1 Forsythia sp. oleaceae Нидерланды
20 GU237498.1 Syringa vulgaris oleaceae Нидерланды
21 GU237503.1 Syringa vulgaris oleaceae Нидерланды
22 GU237504.1 Coffea arabica rubiaceae Бразилия
23 GU237505.1 Coffea arabica Rubiaceae Камерун
жидкости брали в реакционную смесь для проведения ПЦР.
ПЦР проводили в объеме 20 мкл. В состав смеси входили: DreamTaq™ Green Master Mix (2X) (Thermo-Scientific), по 5 пикомолей каждого праймера и 1 мкл препарата ДНК. Последователь ности праймеров представлены в таблице 2. Праймеры синтезированы компанией «Евроген».
Анализ нуклеотидных последовательностей выполняли при помощи программы MEGA 7.0.21 [13]. Ре-ференсные последовательности представлены в таблице 3.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Молекулярно-генетический анализ 14 штаммов, 11 из которых были выделены в чистую культуру из некротических пятен на листьях растений семейства Plantaginaceae и 3 из семейства Scrophulariaceae, показал, что 9 штаммов относятся к виду B. exigua (табл. 4). В описании этого вида, данном Van der Aa et al. [19], говорится, что в Евразии вид B. exigua имеет обширный ареал обитания [20] и широкую специализацию, то есть один и тот же штамм может поражать растения нескольких семейств [10, 19]. Любопытно, что среди проанализированных штаммов B. exigua восемь исходно были выделены из растений семейства Plantaginaceae. Также в пределах этого семейства были найдены штаммы Phoma herbarum Westend. и Trichothecium roseum (Pers.) (см. табл. 4).
Патогены, выявленные на растениях семейства Scrophulariaceae, относились к различным видам: Heterophoma novae-verbascicola (Aveskamp, Gruyter & Verkley) Q. Chen & L. Cai, Plectosphaerella cucumerina (Lindf.) W. Gams и B. exigua. Из них патоген H. novae-verbascicola имеет узкую специализацию и приурочен к семейству Scrophulariaceae. Фитопато-гены P. cucumerina, P. herbarum и t. roseum имеют широкую специализацию, встречаются на растениях Lamiaceae, Apiaceae, Solanaceae, Asteraceae и т. д. Интересно, что патоген P. cucumerina (штамм WST1, KU640393) был обнаружен на заразихе, среди вторичных метаболитов которой есть антиррид [20]. Ан-тиррид — редко встречающийся иридоидный гликозид с фунгицидной активностью, который является мажорным компонентом конститутивной защиты льнянок [21]. Патоген P. herbarum хорошо изучен, встречается в различных географических точках как на однодольных, так и на двудольных растениях. В базе NCBI имеется полногеномный сиквенс P. herbarum штамма JCM 15942 (GenBank: BCGR00000000.1).
Оценка вирулентности анализируемых штаммов показала, что среди изученных штаммов наиболее агрессивные в отношении льнянок формы найдены в пределах вида B. exigua. Кроме штаммов из микобиоты льнянок, L. vulgaris заражал штамм B. exigua 32_36, выделенный из Verbascum nigrum (Scrophulariaceae). Менее агрессивными, но все же вызывающими достоверные некротические пятна на отрезках листьев
genetic basis of ecosystems evolution 31
Таблица 4
Суммарные данные по видоидентификации и вирулентности штаммов Species identification and virulence
№ Штамм Номер последовательности маркера Вид Вирулентность
ITS LSU beta-tubulin
i 12_18 KY234213.1 KY234154 MG029466 Heterophoma novae-verbascicola ---
2 17_39 MF5991 10 MF599105 MG029470 Boeremia exigua +--
3 17_82 KY234205 KY234146 KY273917 Boeremia exigua +--
4 17_87 KY234206 KY234147 KY273918 Boeremia exigua +--
5 32_11 KY234207 KY234148 KY273919 Boeremia exigua +--
6 32_13 KY234209 KY234150 MG029464 Boeremia exigua +--
7 32_25 MF599106 MF599101 MG029469 Phoma herbarum ---
8 32_36 MF599107 MF599102 MG029468 Boeremia exigua + + -
9 32_150 KY234211 KY234152 MG029465 Plectosphaerella cucumerina +--
10 32_151 KY234208 KY234149 KY273920 Phoma sp. ---
ii 32_226 KY234212 KY234153 KY273922 Boeremia ex gua + + -
12 263 Ph6 MF599109 MF599104 MG029467 Boeremia ex gua + + +
13 263 Ph6 2 MF599108 MF599103 MG029471 Boeremia ex gua + + +
14 Ph6 KY234210 KY234151 KY273921 Trichothecium roseum ---
Примечание: + + +--площадь некрозов отрезков листьев 75—100 %; + +---площадь некрозов 45—75 %; +---— площадь некрозов 20—45 %;----площадь некрозов менее 20 %
L. vulgaris на 3-и сутки после заражения были штаммы B. exigua 32_226 и 32_11, выделенные из Plantago
major (Plantaginaceae) (см. табл. 4). Крайне слабую агрессивность в отношении L. vulgaris проявляли выделенные из того же растения-хозяина штаммы B. exigua 17_82, 17_87, 32_11, 32_13. Среди других видов можно выделить штамм P. cucumerina 32_150, вызвавший
слабое заражение льнянки.
Среди изученных фрагментов таксономически значимых районов ДНК наиболее вариабельным оказался фрагмент гена tub2. На его основе было построено филогенетическое древо, отражающее родство изолятов B. exigua (рис. 1). При его построении были использованы также последовательности данного маркера из базы NCBI (см. табл. 3). Они относятся к изолятам, выделенным с разных растений-хозяев и из различных географических точек. Хотя для фомоидных микроми-цетов принято считать, что взаимосвязи между растением-хозяином и родством его заражающих патогенов не существует [25], на нашем древе обнаружены некоторые моменты, которые трудно считать случайными. Так, несмотря на то, что изоляты, выделенные с Plantaginaceae, распределены по всему древу, тем не менее есть группа наиболее вирулентных в отношении льнянки патогенов, которая образует общую ветвь на древе. Аналогично обстоит дело с изолятами, выделен-
ными с батата. То есть, несмотря на широкий спектр хозяев, можно говорить о склонности отдельных рас заражать преимущественно родственные виды из одного или близких семейств. При поиске таких рас имеет смысл обращать внимание на несколько факторов, по крайней мере таких, как растение-хозяин и география сбора. Хотя для более ясной картины требуются дополнительные исследования.
Вирулентные в отношении льнянок штаммы B. exigua были выделены из растений, чей конститутивный иммунитет против болезней основан на синтезе таких вторичных метаболитов, как иридоидные гликозиды и флавоноиды. Одна из возможных функций гена rolC заключается в увеличении синтеза мажорных вторичных метаболитов, что в свою очередь могло дать преимущество предковым формам, в чьих геномах закреплялась и передавалась по наследству Т-ДНК, гомологичная агробактериальной [21]. Выявленная, благодаря проведенному исследованию, система L. vulgaris/B. exigua предоставляет уникальную возможность для изучения особенностей защиты таких природно-трансгенных растений. Хорошо известно, что паразито-хозяинные отношения претерпевают ряд изменений в процессе эволюции. Превалирование среди патогенов льнянок B. exigua указывает на то, что патогенез у природно-трансгенных растений может иметь ряд индивидуальных
49
54
67
67
64
растение-хозяин
■ KY273918 1 Plantago_major
■ GU237494 1 Forsythia_sp
■ GU237500 1 Linum_usitatisismum GU237493 1 Forsythia_sp
■ KY273917 1 Plantiago_major
■ Ш09407 1 Cynara_scolymus
■ Ш09489 1 Linum_usitatissimum
■ Ш37499 1 Linum_usitatissimum
■ Ш89784 1 Nicotiana_tabacum GU237495 1 Cichorium intybus
■ FJ427112 1 Solanum_tuberosum GU237504 1 Coffea_arabica
■ MG029470 Plantago_major
■ LT158235 1 Glycine_max
■ MG029464 Plantago_major
■ KT309519 1 Cynara_scolymus KT309446 1 Cytisus_scoparius
■ KR653201 1 Ipomoea_batatas KR653203 1 Ipomoea_batatas KR653202 1 Ipomoea_batatas
■ KT309617 1 Cyphomandra_betacea MG029467 Linaria_vulgaris MG029468 Verbascum_nigrum MG029471 Linaria_vulgaris KY273922 1 Plantago_major
■ KT309512 1 Fragaria_ananassa
■ KY273919 1 Plantago_major KT309500 1 Lycopersicon_esculentum GU237503 1 Syringa_vulgaris GU237505 1 Coffea_arabica KT309470 1 Actinidia_chinensis GU237498 1 Syringa_vulgaris
■ MG029469 P
наиболее вирулентны в отношении L. vulgaris
Рис. 1. Филогенетическое древо изолятов Boeremia exigua с указанием растений-хозяев. Древо построено с применением метода максимального правдоподобия. Консенсусное древо построено на основе 500 реплик бутстрепа. Начальное древо для эвристического поиска было получено автоматически, путем применения алгоритмов Neighbor-Join и BioNJ к матрице попарных расстояний, оцененных с использованием модели JTT, а затем выбора топологии с более высоким значением логарифма правдоподобия [22—24] Fig. 1. Molecular Phylogenetic analysis by Maximum Likelihood method. The evolutionary history was inferred by using the Maximum Likelihood method based on the Tamura-Nei model [22]. The bootstrap consensus tree inferred from 500 replicates [24] is taken to represent the evolutionary history of the taxa analyzed [24]. Branches corresponding to partitions reproduced in less than 40% bootstrap replicates are collapsed. The percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together in the bootstrap test (500 replicates) are shown next to the branches [24]. Initial tree(s) for the heuristic search were obtained automatically by applying Neighbor-Join and BioNJ algorithms to a matrix of pairwise distances estimated using the Maximum Composite Likelihood (MCL) approach, and then selecting the topology with superior log likelihood value. The analysis involved 21 nucleotide sequences. Codon positions included were 1st+2nd+3rd+Noncoding. All positions containing gaps and missing data were eliminated. There was a total of 295 positions in the final dataset. Evolutionary analyses were conducted in MEGA7 [23]. Disclaimer: Although utmost care has been taken to ensure the correctness of the caption, the caption text is provided "as is" without any warranty of any kind. Authors advise the user to carefully check the caption prior to its use for any purpose and report any errors or problems to the authors immediately (www.megasoftware.net). In no event shall the authors and their employers be liable for any damages, including but not limited to special, consequential, or other damages. Authors specifically disclaim all other warranties expressed or implied, including but not limited to the determination of suitability of this caption text for a specific purpose, use, or application
особенностей. На наш взгляд, в дальнейшем необходимо более тонкое изучение патогенеза, в частности, инокуляция целых растений L. vulgaris различающимися по агрессивности штаммами B. exigua и анализ развития болезни на организменном и клеточном уров-
нях. Кроме того, целесообразно оценить внутривидовую изменчивость штаммов B. exigua при помощи микроса-теллитных маркеров.
Таким образом, нами охарактеризовано 14 изолятов микромицетов. Больше всего вирулентных к льнян-
GENETIC BASIS oF ECoSYSTEMS EVoLUTioN
33
ке образцов выявлено среди представителей вида B. exigua. На основе изолятов этого вида создана коллекция, которая в дальнейшем может быть использована для более детального изучения иммунного ответа природно-трансгенного растения L. vulgaris в ответ на инокуляцию данным фитопатогеном. Итогом выполнения работы стала идентификация узкоспециализированного вида H. novae-verbascicola и широко специализированных видов P. cucumerina, P. herbarum и Т. roseum, среди которых только P. cucumerina был слабым патогеном льнянок. Результаты подтверждают раннее полученные данные об обедненной микобиоте L. vulgaris.
Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ, грант № 16-16-10010. Авторы благодарят РЦ СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий» и лично Е.Ю. Городилову и А.Э. Машарского за содействие в проведении секвенирования ДНК.
ЛИТЕРАТУРА
1. Kyndt T, Quispe D, Zhai H, et al. The genome of cultivated sweet potato contains Agrobacterium T-DNAs with expressed genes: An example of a naturally transgenic food crop. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112(18): 5844-5849. doi: 10.1073/pnas.1419685112.
2. Chen K, Otten L. Natural Agrobacterium Transformants: Recent Results and Some Theoretical Considerations. Front Plant Sci. 2017;8:1600. doi: 10.3389/ fpls.2017.01600.
3. Матвееева Т.В., Богомаз О.Д., Голованова Л.А., и др. Гомологи гена rolC природно-трансгенных льнянок Linaria vulgaris и Linaria creticola эк-спрессируются in vitro // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2018;22(2):273-278. [Mat-veeva TV, Bogomaz OD, Golovanova LA et al. Homologs of the rolC gene of naturally transgenic toadflaxes Linaria vulgaris and Linaria creticola are expressed in vitro. Russian Journal of Genetics: Applied Research. 2018;22(2):273-278 (In Russ.)]. doi: 10.18699/VJ18.359.
4. Bulgakov VP, Tchernoded GK, Mischenko NP, et al. Effect of salicylic acid, methyl jasmonate, ethephon and cantharidin on anthraquinone production by Rubia cordifolia callus cultures transformed with the rolB and rolC genes. J Biotechnol. 2002;97(3):213-221. doi: 10.1016/s0168-1656(02)00067-6.
5. Понтер Е.А., Попейко О.В., Шкрыль Ю.Н., и др. Влияние агробактериальных генов rol на содержание, строение пектиновых веществ и активность гликаназ в культурах трансгенных клеток Rubia cordifolia // Прикладная биохимия и микробиология. — 2013. — Т. 49. - № 4. - С. 409-416. [Gunter EA, Popey-ko OV, Shkryl YN, et al. Effect of the rol Genes from Agrobacterium rhizogenes on the Content and Struc-
ture of Pectic Substances and Glycanase Activity in Rubia cordifolia Transgenic Cell Cultures. Applied biochemistry and microbiology. 2013;49(4):409-416. (In Russ.)]. doi: 1134/S0003683813040066.
6. Veremeichik GN, Shkryl YN, Bulgakov VP, et al. Molecular cloning and characterization of seven class III peroxidases induced by overexpression of the agro-bacterial rolB gene in Rubia cordifolia transgenic callus cultures. Plant Cell Rep. 2012;31(6):1009-1019. doi: 10.1007/s00299-011-1219-3.
7. Bulgakov VP, Shkryl YN, Veremeichik GN, et al. Recent advances in the understanding of Agrobacterium rhizogenes-derived genes and their effects on stress resistance and plant metabolism. Adv Biochem Eng Biotechnol. 2013;134:1-22. doi: 10.1007/10_2013_179.
8. plantarium.ru [интернет]. Определитель растений on-line [доступ от 01.10.2017]. Доступ по ссылке http://www.plantarium.ru/. [Plantarium.ru [Internet]. Identification guide for plants [cited 2017 October 1]. Available from: http://www.plantarium.ru/. (In Russ.)]
9. Сокорнова С.В., Гасич Е.Л., Матвеева Т.В., Афонин А.Н. Микромицеты растений рода Linaria, содержащих в геноме т-ДНК // Микология и фитопатология. - 2015. - Т. 49. - № 3. - С. 188-193. [Sokornova SV, Gasich EL, Matveeva TV, Afonin AN. Micromycetes of plants Linaria containing DNA sequences of agrobacterial origin in their genomes. Mikol Fitopatol. 2015;49(3):188-193. (In Russ.)]
10. Boerema GH, de Gruyter J, Noordeloos ME, Hamers MEC Phoma identification Manual: differentiation of Specific and Infra-specific Taxa in Culture. Wallingford: CABI Publishing; 2004.
11.Aveskamp MM, de Guyter J, Crous PW Biology and recent developments in the systematics of Phoma, a complex genus of major quarantine significance. Fungal Divers. 2008;31:1-18.
12. Chen Q, Jiang JR, Zhang GZ, et al. Resolving the Phoma enigma. Stud Mycol. 2015;82:137-217. doi: 10.1016/j.simyco.2015.10.003.
13. Kumar S, Stecher G, Tamura K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Mol Biol Evol. 2016;33(7):1870-1874. doi: 10.1093/molbev/msw054.
14. White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor JW Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylo-genetics. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ, editors. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press; 1990. P 315-322.
15. Rehner SA, Samuels GJ. Taxonomy and phylogeny of Gliocladium analysed from nuclear large subunit ribo-somal DNA sequences. Mycol Res. 1994;98(6):625-34. doi: 10.1016/s0953-7562(09)80409-7.
16. Vilgalys R, Hester M. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal
34
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЭВОЛЮЦИИ ЭКОСИСТЕМ
DNA from several Cryptococcus species. J Bacteriol. 1990;172(8):4238-4246. doi: 10.1128/jb.172.8.4238-4246.1990.
17. O'Donnell K, Cigelnik E. Two divergent intragenomic rDNA ITS2 types within a monophyletic lineage of the fungus Fusarium are nonorthologous. Mol Phy-logenet Evol. 1997;7(1):103-116. doi: 10.1006/ mpev.1996.0376.
18. Woudenberg JH, Aveskamp MM, de Gruyter J, et al. Multiple Didymella teleomorphs are linked to the Phoma clematidina morphotype. Persoonia. 2009;22:56-62. doi: 10.3767/003158509X427808.
19. Van der Aa HA, Boerema GH, de Gruyter J Contributions towards amonograph of Phoma (Coelomycetes) VI-1. Section Phyilostictoides: Characteristics and nomenclature of its type species Phoma exigua. Persoonia. 2000;17(Pt 1): 435-456.
20. Tsuchiya Y, McCourt P. Strigolactones: a new hormone with a past. Curr Opin Plant Biol. 2009;12(5):556-61. doi: 10.1016/j.pbi.2009.07.018.
21.Matveeva TV, Sokornova SV, Lutova LA. Influence of Agrobacterium oncogenes on secondary metabolism of plants. Phytochem Rev. 2015;14(3):541-554. doi: 10.1007/s11101-015-9409-1.
22. Tamura K, Nei M. Estimation of the number of nucleo-tide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Molecular Biology and Evolution. 1993;10:512-526.
23. Kumar S, Stecher G, Tamura K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution. 1993;33:1870-1874.
24. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution. 1985;39: 783-791.
25. Rai MK, Tiwari VV, Irinyi L, Kovics GJ. Advances in Taxonomy of Genus Phoma: Polyphyletic Nature and Role of Phenotypic Traits and Molecular Sys-tematics. Indian J Microbiol. 2013;54(2):123-128. doi: 10.1007/s12088-013-0442-8.
Ф Информация об авторах
Софья Валерьевна Сокорнова — канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории токсикологии и биотехнологии. ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений», Пушкин, Санкт-Петербург. ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет». Санкт-Петербург. ORCID: 0000-0001-6718-4818, SPIN: 3223-0513. E-mail: mymryk@gmail.com.
Елена леонидовна Гасич — канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории микологии и фитопатологии. ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений», Пушкин, Санкт-Петербург. SPIN: 1101-5323. E-mail: elena_gasich@mail.ru.
Виктория Дмитриевна Бемова — магистрант кафедры генетики и биотехнологии. ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург. E-mail: viktoria.bemova@ yandex.ru.
татьяна Валерьевна матвеева — д-р биол. наук, профессор кафедры генетики и биотехнологии. ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург. SPIN: 3877-6598. E-mail: radishlet@gmail.com.
* Information about the authors
Sofia V. Sokornova — Senior Researcher, All-Russia Institute of Plant Protection, Pushkin, Saint Petersburg. Saint Petersburg State University, Saint Petersburg. ORCID: 0000-0001-6718-4818, SPIN: 3223-0513. E-mail: mymryk@gmail.com.
Elena L. Gasich — Senior Researcher, All-Russia Institute of Plant Protection, Pushkin, Saint Petersburg. SPIN: 1101-5323. E-mail: elena_gasich@mail.ru.
Victoria D. Bemova — Master Student. Saint Petersburg State University, Saint Petersburg. E-mail: viktoria.bemova@yandex.ru.
Tatiana V. Matveeva — Professor. Saint Petersburg State University, Saint Petersburg. SPIN: 3877-6598. E-mail: radishlet@gmail.com.
