CC BY
15УДК 578.4(262.5)
ПОИСК И ИЗОЛЯЦИЯ НОВОГО АЛЬГОВИРУСА МИКРОВОДОРОСЛИ TISOCHRYSIS LUTEA ИЗ ЭКОСИСТЕМЫ ЧЕРНОГО МОРЯ В БУХТАХ СЕВАСТОПОЛЯ (КРЫМСКИЙ РЕГИОН)
Степанова О. А.1, СтельмахЛ. В.2
1 Институт природно-технических систем, Севастополь, Россия, solar-ua@ya.ru
2 Институт морских биологических исследований им. А. О. Ковалевского, Севастополь, Россия, lustelm@mail.ru
Впервые из бухт Севастополя в 2016-2017 годах были выделены и частично изучены пять штаммов нового для науки альговируса микроводоросли Tisochrysis lutea Bendif et Probert (Haptophyta). Изоляция данного альговируса из экосистемы Черного моря свидетельствует о возможном присутствии микроводоросли Tisochrysis lutea в изучаемых акваториях.
Ключевые слова: альговирус микроводоросли Tisochrysis lutea, экосистема Черного моря.
ВВЕДЕНИЕ
Вирусы водоемов, в том числе морские вирусы, выполняют важную, но пока недостаточно изученную роль в функционировании водных экосистем. Понимание роли вирусов в циркуляции органического вещества в Мировом океане, в процессах трансформации органического вещества по пищевым цепям и в биоразнообразии является основой для оценки стабильности морских систем и их биогеохимической значимости, увеличивая предсказуемость воздействий глобальных изменений на биогеохимические процессы в море (Proposal ..., 2005). И при этом ученые сходятся во мнении, что морские вирусы играют важную роль в глобальной экосистеме (Suttle, 2007).
Среди морских вирусов альговирусы представляют особый интерес для исследователей, поскольку вызывают лизис первичных продуцентов органической материи -микроводорослей, составляющих основу фитопланктона, ответственного за циркуляцию углекислого газа и кислорода, как в гидросфере, так и в атмосфере (Wommack, Colwell, 2000). Некоторые виды, например кокколитофорида Emiliania huxleyi (Lohmann) W.W.Hay & H.P. Mohler, производят диметилсульфид. Под действием вирусов данная кокколитофорида разрушается и выделяет в среду диметилсульфид, который способствует образованию облаков, а, следовательно, влияет на климат нашей планеты (Tyrrel, Merico, 2004).
Поиск, изоляция и изучение биологии и экологии альговирусов из экосистемы Черного моря проводятся с 2002 года. До 2015 года мониторинг черноморских альговирусов выполнялся на базе Института биологии южных морей (ныне Институт морских биологических исследований - ИМБИ), с 2015 года и по настоящее время работы продолжаются в Институте природно-технических систем (ИПТС). В 2002-2017 годах из различных проб из экосистемы Черного моря было изолировано около 300 штаммов в основном новых для науки вирусов к разным видам морских микроводорослей (Степанова, 2016). Изучение геномов трех штаммов черноморских альговирусов было проведено в Broad Institute of MIT USA в соответствии с «Gordon & Betty Moore Foundation Marine Phage, Virus, & Virome Sequencing Project» (2009-2010). Информация о геномных и мета данных черноморских альговирусов представлена в NCBI и CAMERA. Геномы вирусных штаммов TvV-S20, TvV-SI1 и DvV-SI2 были депонированы как G2351, G2352 и G2353 соответственно. Предварительный анализ геномов черноморских альговирусов свидетельствует как об их сходстве с наиболее изученными вирусами микроводорослей семейства Phycodnaviridae, так и об уникальности и индивидуальных особенностях их свойств, выявляя космополитную комбинацию генов черноморских альговирусов (Степанова и др., 2013).
2017 Ekosistemy, 12: 28-34
Published by Federal state autonomous education institution of higher education "V.I. Vernadsky Crimean Federal University"
Поиск, изоляция и изучение новых для науки альговирусов остается на острие интересов водной вирусологии, что связано как с экологической значимостью, широтой географического распространения и биоразнообразия их хозяев, так и с другими проблемами, в том числе и с возможной ролью альговирусов в патологии человека (Stepanova et al., 2011; Yolken et al., 2014). Выделение и изучение новых для науки альговирусов, в том числе к хозяевам, которые еще не были изолированы и описаны для экосистем определенных водоемов, является одновременно и изучением географического распространения хозяев вирусов - микроводорослей.
Цель работы - поиск, изоляция и предварительное изучение доступными способами свойств нового для науки альговируса микроводоросли Tisochrysis lutea Bendif et Probert (Haptophyta), выделенной из планктона Японского моря, с учетом отсутствия сведений об изоляции этой микроводоросли из Черного моря.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
С 2016 года впервые для поиска и изоляции черноморских альговирусов с помощью авторских запатентованных методов (Декл..., 2004; Пат..., 2012) была использована альгологически чистая культура Tisochrysis lutea (Haptophyta) клон MBRU_Tiso-08 из коллекции «Морской биобанк» ННЦМБ ДВО РАН (http://marbank.dvo.ru). Морфология клеток микроводоросли - одиночные, подвижные, эллипсовидные клетки с размером около 5 микрометров (рис. 1).
Рис. 1. Клетки культуры Tisochrysis lutea (http://biancacosmetics.pl/ekstrakt-z-mikroalg-lipout-tm/)
Паспортные данные используемой нами культуры микроводоросли, любезно предоставленной старшим научным сотрудником, к.б.н. Т. Ю. Орловой, сотрудницей «Национального научного центра морской биологии ДВО РАН (Владивосток), подробно описаны по адресу http://marbank.dvo.ru/index.php/ru/kollektsiya/microalgae/ prymnesiophyceae/details/5/55. Из этих данных следует, что культура коллекционной микроводоросли была создана на основе клеток данного вида, выделенных из планктона Японского моря в 2008 году.
Культура была адаптирована нами в течение 30 дней к стабилизирующей питательной среде Гольдберга (на основе черноморской воды) и использована для изоляции альговирусов в период 2016-2017 годов. Инокулят данного вида хранится и поддерживается в лаборатории отдела экологической физиологии водорослей ИМБИ в питательной среде f/2 (Guillard, Ryther 1962), приготовленной на основе стерильной черноморской воды. Поддержание культуры в активном состоянии обеспечивается регулярными пересевами в
свежую питательную среду в процессе выращивания в накопительном режиме в колбах объемом 100 мл при температуре 16-18 оС и естественном освещении (на северном окне).
Для поиска и изоляции альговируса T. lutea были использованы пробы морской воды, отбор которых проводили с октября 2016 года по ноябрь 2017 года из стабильных точек из акватории Карантинной, Мартыновой и Артиллерийской бухт (рис. 2).
44.СН-,-,-,-,-,-,-,-,-,-
32.0 32.2 32.4 32.6 32.8 33.С 33.2 33.4 33.6 33.8 34.С
Долгота, E°
Рис. 2. Схема станций отбора проб морской воды в бухтах Севастополя: Карантинной (1),
Мартыновой (2) и Артиллерийской (3)
Инкубационный (латентный) период для альговируса T. lutea определяли путем последовательных пассажей до установления стойкого (стабильного, постоянного) скрытого периода (до появления симптомов лизиса). Определение титра вируса в вирусной суспензии проводили на основе авторского метода (Декл..., 2004) путем десятикратного разведения в стабилизирующей среде Гольдберга с добавлением используемого в данной работе вида водорослей как индикатора.
Наличие суперкапсида у впервые изолированных альговирусов микроводоросли T. lutea (TlV) определяли путем обработки 2,0 мл вирусной суспензии в течение 1 часа 0,2 мл хлороформа, разрушающего липидную оболочку. Полученную суспензию далее проверяли на способность инфицировать и лизировать клетки T. lutea, для чего проводили несколько последовательных пассажей в эту индикаторную культуру.
Чувствительность вирусной суспензии TlV к низкой температуре изучали путем ее замораживания при -18 °С в морозильной камере на протяжении суток и более, после чего размороженную суспензию использовали для инфицирования культуры T. lutea.
Для предварительного определения максимального размера изолированного из Черного моря альговируса T. lutea (TlV) применяли метод ультрафильтрации с использованием установки - шприц, фильтродержатель и нитроцеллюлозные фильтры фирмы Sartorius. После фильтрации вирусных суспензий через фильтры с диаметром пор 0,3 и 0,2 мкм фильтраты использовали для заражения культуры индикаторной микроводоросли. Размер изучаемого нового альговируса TlV определяли в пределах диаметров пор фильтров с
46.0
44.2
учетом их максимального диаметра, когда фильтрат еще вызывал лизис культуры (максимальный размер вирусов).
Специфичность нового альговируса TlV изучали при его контакте с двумя видами микроводорослей - зеленой Tetraselmis viridis Rouchijajnen. R.E. Norris, Hori & Chihara и диатомовой Phaeodactylum tricornutum Bohlin. Также изучали специфичность культуры T. lutea по отношению к вирусным штаммам микроводорослей Tetraselmis viridis (штамм TvV-S1) и Phaeodactylum tricornutum (щтамм PtV-S18).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Поиск и изоляция альговируса Tisochrysis lutea из акватории бухт Севастополя.
Результаты проведенного поиска и изоляции альговируса T. lutea (TlV) из проб морской воды Карантинной, Мартыновой и Артиллерийской бухт c октября 2016 года по ноябрь 2017 года на фоне выполненного мониторинга альговирусов T. viridis (TvV) и P. tricornutum (PtV) приведены в таблице 1.
Изоляция нового для науки и экосистемы Черного моря альговируса T. lutea (TlV) пришлась на осенний (октябрь 2016 года), зимний (январь и февраль 2017 года) и летний (июнь, июль 2017 года) периоды. Надо отметить, что лето 2017 года до прихода в Крым антициклона «Люцифер» в августе, было прохладным, а осень 2016 года и зима в начале 2017 года были относительно теплыми, без морозов. По нашим первым наблюдениям предполагаем, что проявление сезонности альговируса T. lutea зависит от преобладания умеренной температуры среды (морская вода от +14 °С до +24 °С). Оптимальная температура воды, отмечаемая для роста и развития культуры T. Lutea, по паспортным данным - +20 °С. Вероятно, что на TlV и на его хозяина - микроводоросль T. lutea - влияют и другие абиотические факторы, однако эта проблема в условиях экосистемы Черного моря пока не изучена. Из пяти изолированных штаммов TlV два были выделены из проб воды, отобранных из относительно экологически благополучной открытой Карантинной бухты, а три - из неблагополучной, закрытой Артиллерийской бухты.
Таблица 1
Результаты поиска альговирусов Tetraselmis viridis (TvV), Phaeodactylum tricornutum (PtV) и Tisochrysis lutea (TlV) из проб морской воды Карантинной, Мартыновой и Артиллерийской
бухт c октября 2016 года по ноябрь 2017 года
Дата № пробы Место отбора TvV PtV TlV
1 2 3 4 5 6
20.10.16 1 Карантинная - - TlV-S-16-1
2 Мартынова - - -
3 Артиллерийская - - -
19.01.17 4 Карантинная - - -
5 Мартынова TvV-S-17-1 - -
6 Артиллерийская - - TlV-S-17-1
21.02.17 7 Карантинная - PtV-S-17-1 TlV-S-17-2
8 Мартынова - PtV-S-17-2 -
9 Артиллерийская - PtV-S-17-3 -
21.03.17 10 Карантинная TvV-S-17-2 PtV-S-17-4 -
11 Мартынова - PtV-S-17-5 -
12 Артиллерийская - - -
20.04.17. 13 Карантинная - - -
14 Мартынова - - -
15 Артиллерийская - - -
Продолжение таблицы 1
1 2 3 4 5 6
17.05.17 16 Карантинная - - -
17 Мартынова - - -
18 Артиллерийская - - -
23.06.17 19 Карантинная - - -
20 Мартынова - - -
21 Артиллерийская - - TlV-S-17-3
20.07.17 22 Карантинная - - -
23 Мартынова - - -
24 Артиллерийская - - TlV-S-17-4
11.09.17 25 Карантинная - PtV-S-17-6 -
26 Мартынова - PtV-S-17-7 -
27 Артиллерийская - PtV-S-17-8 -
9.10.17 28 Карантинная TvV-S-17-3 PtV-S-17-1 -
29 Мартынова - PtV-S17-10 -
30 Артиллерийская - PtV-S17-11 -
15.11.17 31 Карантинная - - -
32 Мартынова - PtV-S17-12 -
33 Артиллерийская - PtV-S17-13 -
Итого 33 пробы морской воды 3 TvV 13 PtV 5 TlV
Примечание к таблице. « - » - проба отрицательна (альговирус не изолирован).
Результаты изучения некоторых свойств нового для науки и экосистемы Черного моря альговируса микроводоросли Tisochrysis lutea. При помощи доступных нам методов были выявлены следующие свойства нового для науки альговируса микроводоросли культуры T. lutea:
1. В результате пассирования был установлен стойкий инкубационный период - 24 ч.
2. Путем титрования вирусной суспензии инфекционный титр был определен в пределах 104 вирионов/мл.
3. На основе чувствительности к хлороформу у вируса было выявлено наличие суперкапсида, что свидетельствует о сложном строении вириона.
4. Определена чувствительность к замораживанию (при - 18 °С), что типично при сложном строении вирионов.
5. Путем фильтрации для данного альговируса был определен максимально возможный размер вирионов - не более 0,2 мкм.
6. На основе выполненных исследований, представленных в таблице 2, было установлено отсутствие контакта между новым альговирусом T. lutea с неиндикаторными для него микроводорослями T. viridis и P. tricornutum, что проявлялось ростом культур. Контакт этих микроводорослей с их специфическими вирусами проявляется в виде лизиса. При этом наблюдали отсутствие инфекционной активности со стороны альговирусов этих микроводорослей (штаммы TvV-S 1 и PtV-S18) по отношению к микроводоросли T. lutea (рост культуры). Следовательно, контакт альговирусов со своими хозяевами - индикаторными микроводорослями сопровождался лизисом, что свидетельствует о специфичности изучаемых в этих опытах вирусов.
Таблица 2
Результаты контакта альговируса Tisochrysis lutea (штамм TlV-16-1) с микроводорослями Tetraselmis viridis и Phaeodactylum tricornutum (рост культур) и альговирусов этих микроводорослей (штаммы TvV-S 1 и PtV-S 18) при контакте с микроводорослью Tisochrysis lutea (рост культуры)
Культуры микроводорослей Штаммы альговирусов
TlV-16-1 TvV-S1 PtV-S18
Tisochrysis lutea лизис рост рост
Tetraselmis viridis рост лизис рост
Phaeodactylum tricornutum рост рост лизис
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Впервые для поиска и изоляции альговирусов была использована адаптированная к солености Черного моря культура T. lutea, выделенная из планктона Японского моря.
Впервые из проб морской воды бухт Севастополя были изолированы пять штаммов альговируса T. lutea - TlV-16-1, TlV-17-1, TlV-17-2, TlV-17-3, TlV-17-4. Полученные результаты поиска и изоляции пяти штаммов нового для науки альговируса косвенно свидетельствуют о возможном присутствии данного вида микроводорослей в экосистеме Черного моря.
Путем доступных методик были изучены некоторые свойства нового для науки и экосистемы Черного моря альговируса: установлен короткий инкубационный период (24 ч); титр вируса в суспензии не превышает 104 вирионов/мл; у TlV выявлено наличие суперкапсида; определена чувствительность альговируса к заморозке (-18 °С); установлено, что диаметр вирионов альговируса не превышает 200 нм; для альговируса микроводоросли T. lutea определена специфичность только по отношению к своему хозяину при изучении его контакта с двумя другими видами черноморских микроводорослей.
Работа выполнена в соответствии с планом в ИПТС по научной теме № 0012-20160008, в ИМБИ - в рамках госзадания по направлению «Функциональные, метаболические и токсикологические аспекты существования гидробионтов и их популяций в биотопах с различным физико-химическим режимом».
Список литературы
Декларационный патент на изобретение 65864A UA, MKU 7 C12 N 1/12. Споиб iзоляцü альпжруав однокштинних водоростей, наприклад Platymonas viridis Rouch (Chlorophita) / Степанова О.А. (UA); заявник 1нститут бюлогп твденних моргв ím. О.О. Ковалевського НАН Укра1ни (UA). № 2003065499; заявл. 13.06.2003; опубл. 15.04.2004, Бюл. № 4 // Промислова власшсть. - 2004. - № 4.
Патент 97293 С2 UA, МПК C12N 1/12. Споаб iзоляцü альпжруав мжроводоросл Phaeodactylum tricornutum (Bacillariophyta) з проб морсько! води / Степанова О.А. (UA); заявник 1нститут бюлогй пгвденних морш ím. О.О. Ковалевського НАН Укра!ни (UA). № а201003881; заявл. 06.04.2010; опубл. 25.01.2012. Бюл. -2012. - № 2.
Степанова О. А. Черноморские альговирусы // Биология моря. - 2016. - Т. 42, № 2. - С. 99-103.
Степанова О. А., Бойко А. Л., Щербатенко И. С. Компьютерный анализ геномов трех морских альговирусов // Микробиол. журн. - 2013. - Т. 75, № 5. - С. 76-81.
Guillará R. R. L., Ryther J. H. Studies of marine planktonic diatoms: I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (Cleve) Gran // Can. J. Microbiol. - 1962. - Vol. 8, N 2. - P. 229-239.
Stepanova O. A., Solovyova Y. A., Solovyov A. V. Results of Algae Viruses Search in Human Clinical Material // Ukrainica Bioorganica Acta. - 2011, N 2. - P. 53-56.
Suttle C. A. Marine viruses - major players in the global ecosystem // Nature Reviews Microbiology. - 2007. - 5. -P. 801-812.
Proposal for SCOR WG to Investigate the Role of Viruses in Marine Ecosystems // Proceedings of the Scientific Committee on Oceanic Research (Venice, Italy, Sept. 2004). Baltimore (USA), 2005. - Vol. 40. - P. 66-70. (Annex 4).
Tyrrell, T. Merico, A. Emiliania huxleyi: bloom observations and the conditions that induce them / In: Thierstein, H. R., Youngs, J. R. (Eds.). - Coccolithophores - From Molecular Processes to Global Impact. - Springer, 2004. - P. 7597.
Wommack K.E., Colwell R.R. Virioplankton: Viruses in aquatic ecosystems // Microbiol. and Molec. Biol. Reviews. - 2000. - Vol. 64, N 1. - P. 69-114.
Yolken R. H., Lorraine Jones-Brando, David D. Dunigan et al. Chlorovirus ATCV-1 is part of the human oropharyngeal virome and is associated with changes in cognitive functions in humans and mice // PNAS. 2014. - Vol. 111, N 45. (November 11). - P. 16106-16111.
Stepanova O. A. Stelmakh L.V. Search and isolation of the new algal virus of algae Tisochrysis lutea from the ecosystem of the Black Sea in the bays of Sevastopol (the Crimean region) // Ekosystemy. 2017. Iss. 12 (42). P. 28-34.
For the first time from the bays of Sevastopol in 2016-2017, have been isolated and partially studied five strains of the new algal virus of algae Tisochrysis lutea Bendif et Probert (Haptophyta). Isolation of the algal virus of algae Tisochrysis lutea from the ecosystem of the Black Sea indicates the circulation of this algae in the studied water areas. Key words: algal virus of microalgae Tisochrysis lutea, ecosystem of the Black Sea.
Поступила в редакцию 29.09.17
