CC BY
24
68
ИЗ НАУЧНЫХ ЛАБОРАТОРИЙ
ЙДЕативиаЯвйидиВпия1и1ВнКВидпия
ПОИСК ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ И РАЗВИТИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ЛИМФОЛЕЙКОЗА
Б.А. Бакиров, Д.О. Каримов, Т.В. Викторова
ГОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет
Бакиров Булат Ахатович, канд. мед. наук,
врач-гематолог, анестезиолог-реаниматолог РКБ им. Г.Г.Куватова, 450001, Республика Башкортостан, г. Уфа, ул. Заки Валиди д. 47, тел.: +7917 776 99 88, e-mail: bbakirov@mail.ru
Статья посвящена поиску генетических маркеров прогнозирования и развития хронического лимфолейкоза. Авторы статьи рассмотрели роль полиморфных, вариантов генов MDM2, ВАХ и VEGF в прогнозировании развития хронического лимфо-лейкоза.
Ключевые слова: хронический лимфолейкоз, гены MDM2, ВАХ и VEGF, маркеры прогнозирования, генотипы, аллели.
CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA PROGNOSIS AND DEVELOPMENT AND SEARCH OF THEIR GENETIC MARKERS
B.A. Bakirov, D.O. Karimov, T.V. Victorova
Bashkir State University of Medicine
The article is devoted to the chronic lymphocytic leukemia prognosis and development and to the search of their genetic markers.
The article writers have considered the role of polymorphic MDM2, BAX and VEGF genes variants in chronic lymphocytic leukemia prognosis and development.
The key words: chronic lymphocytic leukemia, MDM2, BAX and VEGF genes, prognosis markers, idiotypes, allelic genes.
Введение
Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) является самым частым видом лейкозов у взрослых. Им ежегодно заболевают более 3500 россиян, общее число больных в России в настоящее время около 14 000 человек [2]. К сожалению, на сегодняшний день диагностика ХЛЛ затруднена. Нередко бывает трудно выявить заболевание на ранних этапах, что ведет к его прогрессированию и затрудняет дальнейшее лечение. В связи с этим все большую значимость приобретает разработка ранних методов выявления ХЛЛ и определение наследственной предрасположенности.
ХЛЛ - опухолевое заболевание лимфатической ткани моноклоновой природы с обязательным первичным поражением костного мозга. Этиология хронического лимфолейкоза, как и всех гемоблас-тозов, до конца не изучена [1]. Одной из причин развития ХЛЛ является нарушение контроля жизненного цикла клетки, пролиферации, апоптоза, а также репарации ДНК. В регуляции этих процессов важную роль играет белок р53. При различных стрессах
и внутриклеточных повреждениях происходит активация этого белка, и он приобретает способность эффективно трансактивировать специфические гены-мишени. Следствием чего является индукция в аномальных клетках апоптоза [10].
В свою очередь, активность белка р53 контролируется рядом генов, одним из которых является главный регулятор супрессора опухоли р53 - МЭМ2 (М1М 164785).
Это ядерный фосфопротеин, который формирует прочный комплекс с опухолевым белком р53 и ингибирует его трансактивационную активность [10]. Кроме того, МЭМ2 является Е3 убиквитин-ли-газой для р53 и приводит к его убиквитинации с последующей протеосомальной деградацией. Ген МЭМ2 расположен на длинном плече 12 хромосомы (^14.3^15). В гене ранее описана замена ти-мина на гуанин в положении 309.
В ряде научных исследований была установлена прямая связь между полиморфным вариантом 309Т>в гена МЭМ2 и увеличением опухолевого потенциала клеток [4]. Было показано, что замена ал-
КиеатиинамтоииммпияиЯюийшшюпЙ!
ИЗ НАУЧНЫХ ЛАБОРАТОРИЙ
69
леля T на аллель G повышает аффинитет гена MDM2 к активатору транскрипции Sp1 и впоследствии увеличивает его транскрипцию. Данный полиморфный локус ассоциирован с увеличением риска развития рака молочной железы и более ранним его началом заболевания, рака пищевода, остеосаркомы у женщин, рака почек, желудка, более злокачественным течением рака мочевого пузыря и др. [8].
В регуляции процессов кроветворения, нарушения которых лежат в основе развития ХЛЛ, принимает участие множество цитокинов, одним из которых является фактор роста эндотелия сосудов VEGF (MIM 192240).
VEGF представляет собой гликозилированный белок - митоген, который специфически действует на эндотелиальные клетки и обладает различными эффектами, включая стимулирование ангиогенеза, роста и пролиферации эндотелиоцитов, подавление их апоптоза [5]. Кроме того, VEGF регулирует процессы кроветворения, управляя выживанием стволовых кроветворных клеток. Различные дефекты, связанные с подавлением функции VEGF, ведут к снижению выживания кроветворных клеток, а также нарушению процесса формирования их колоний [9].
Ген VEGF расположен в коротком плече хромосомы 6 (6p12). В гене описана замена цитозина на тимин в положении 936. В ряде научных исследований была показана прямая связь между полиморфным вариантом 936C>T гена VEGF и повышением активности процессов пролиферации и, как следствие, высоким риском развития ряда онкологических заболеваний, таких как рак пищевода, толстой кишки и др.
Также одним из регуляторов апоптоза является белок BCL-2, который является индуктором запрограммированной гибели опухолевых клеток [9]. При связывании белка BCL-2 с геном ВАХ образуется комплекс BCL-2^AX, что сопровождается угнетением апоптоза, однако по обратной связи при образовании комплекса ВАХ:ВАХ данный процесс вновь активируется [10]. Ген ВАХ расположен у человека на коротком плече 19 хромосомы. Полиморфизм гена ВАХ обусловлен транзицией гуанина на аденин в положении -248G>A.
Материалы и методы
Нами было обследовано 133 пациента с ХЛЛ, находившихся на стационарном лечении в гематологическом отделении Республиканской клинической больницы им. Г.Г. Куватова. Средний возраст обследованных пациентов составил 49,57±1,42 лет. Половое соотношение мужчин к женщинам - 56,4% (75 чел.) к 43,6% (58 чел.). Все обследованные больные
- жители Республики Башкортостан, из которых 62 (46,6%) - русские, 54 (40,6%) - татары, 17 (12,8%)
- башкиры. Клиническое обследование больных проводилось врачами больницы и включало в себя обязательные и дополнительные методы исследования. В качестве контроля были использованы образцы ДНК 120 практически здоровых индивидов, жителей Республики Башкортостан, отобранные с учетом возраста (47,34±1,58), половой принадлеж-
ности (107 мужчин - 54,6%, 89 женщин - 45,4%) и этнического состава (97 русских - 49,5%, 79 татар - 40,3%, 20 башкир - 10,2%). Работа проводилась с соблюдением этических стандартов биотического комитета, разработанных в соответствии с Хельсин-ской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» (2000г.).
Материалом для молекулярно-генетическо-го анализа служили образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической венозной крови обследуемых индивидов методом фенольно-хлоро-формной экстракции [7]. Изучение полиморфных локусов 309T>G гена MDM2, 936C>T гена VEGF и -248g>A гена BAX проводилось методом ПЦР и ПДРФ.
Математическую обработку результатов исследования проводили на IBM-Pentium IV с использованием статистических программ BIOSTAT, а также в программах Statistica, Microsoft Excel и Microsoft Access.
Результаты и обсуждение
Распределение генотипов изученных генов MDM2, VEGF и BAX у больных с ХЛЛ и в контрольной группе соответствовало ожидаемому по Харди-Вайнбергу.
Сравнительный анализ полученных данных показал достоверные различия в частотах встречаемости аллелей Т и G полиморфного варианта 309T>G гена MDM2 в группе больных ХЛЛ и в группе здоровых индивидов (таблица 1).
Таблица 1
Частоты генотипов и аллелей полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 в группах больных
ХЛЛ и здоровых индивидов
Гены, аллели Больные ХЛЛ (N=133) Здоровые (N=118) Х2 P OR (95%CI)
абс. % абс. %
ТТ 36 27,07 45 38,14 3,02 0,08 0,60 (0,35-1,03)
TG 71 53,38 59 50,00 0,17 0,68 1,15 (0,70-1,88)
GG 26 19,55 14 11,86 2,21 0,14 1,81 (0,89-3,65)
Т 143 53,76 149 63,14 4,14 0,04 0,68 (0,48-0,97)
G 123 46,24 87 36,86 4,14 0,04 1,47 (1,03-2,11)
У больных ХЛЛ по сравнению со здоровыми индивидами достоверно преобладал аллель G (46,24% и 36,86% соответственно; х2=4,14; р=0,04; OR=1,47; 95% С1 1,03-2,11).
При сравнении частоты встречаемости генотипов и аллелей полиморфного локуса 936 С>Т гена VEGF в группе больных ХЛЛ и в контрольной группе достоверных различий выявлено не было (таблица 2).
70
ИЗ НАУЧНЫХ ЛАБОРАТОРИЙ
ЙДЕативиаявйидиВпиягошнКВлппия
Таблица 2
Частоты генотипов и аллелей полиморфного локуса 936 С>Т гена VEGF в группах больных
ХЛЛ и здоровых индивидов
Гены, аллели Больные ХЛЛ (N=129) Здоровые (N=120) Х2 P OR (95%CI)
абс. % абс. %
ТТ 124 96.12 119 99,17 1,32 0,25 0,21 (0,02-1,82)
TG 4 3,10 1 0,83 0,68 0,41 3,81 (0,42-34,57)
GG 1 0,78 0 0,00 0,01 0,97 0,01 (0,99-19,08)
T 252 97,67 231 99,58 2,04 0,15 0,18 (0,02-1,48)
G 6 2,33 1 0,42 2,04 0,15 5,69 (0,68-47,62)
Также при анализе частот генотипов полиморфного локуса (-248) G>A гена ВАХ обнаружены достоверные различия по генотипу GG, на долю которого в группе больных ХЛЛ приходилось 74,30%, а в группе контроля - 46,30% (х2=16,245; р=0,001) (таблица 3).
Таблица 3
Распределение частот генотипов и аллелей полиморфного локуса -248G>A гена ВАХ в группах больных ХЛЛ и здоровых индивидов
Гены, аллели Больные ХЛЛ (N=105) Здоровые (N=108) Х2 P OR (95%CI)
абс. % абс. %
GG 78 74,30 50 46,30 16,24 0,001 3,352 (1,879 - 5,977)
GA 23 21,90 41 38,00 5,79 0,02 0,459 (0,251 - 0,84)
AA 4 3,80 17 15,70 7,23 0,01 0,212 (0,069 - 0,655)
G 179 85,20 141 65,30 21,64 0,001 3,072 (1,914 - 4,93)
A 31 14,80 75 34,70 21,64 0,001 0,326 (0,203 - 0,523)
Риск развития ХЛЛ при наличии данного генотипа увеличен более чем в 3 раза (OR=3,35; 95% С1 1,88-5,98). Напротив, генотип GA чаще встречался в группе контроля, чем в группе больных ХЛЛ - 38,00% и 21,90% соответственно (х2=5,79; р=0,017). Также наблюдалось достоверное преоб-
ладание генотипа АА в группе контроля (15,70%) по сравнению с группой больных (3,80%) (х2=7,24; p=0,008).
Выводы
1. При изучении частот аллелей полиморфного локуса (-248) G>A гена ВАХ отмечалось достоверное преобладание аллеля G в группе больных ХЛЛ по сравнению с контролем (85,20% и 65,30% соответственно) (х2=21,641; p=0,001).
2. При наличии аллеля G риск развития ХЛЛ увеличен в 3 раза (0R=3,072; 95% CI 1,914-4,93).
Список литературы
1. Патологическая физиология / Под ред. А.Д. Адо и В.В.Новицкого - Томск, 1994. - С. 283-288.
2. Руководство по гематологии: в 2-х томах / под ред. А.И.Воробьева - М., 2003. - Т. 1.
3. Abnormal Intracellular Level of Bax in CD3+ Cells from Untreated B-Cell Chronic Lymphocytic Leukemia Patients // Laboratory Hematology. - 2006. - Vol. 12.
- № 4. - P. 187-192.
4. Bond G.L, Hirshfield K.M, Kirchhoff T. et al. MDM2 SNP309 accelerates tumor formation in a gender-specific manner // Cancer Res. - 2006. -Vol. 66.
- P. 10-16.
5. Leung D.W., Cachianes G., Kuang W.-J., Goeddel D.V., Ferrara N. Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen // Science. - 1989 - Vol. 246. - P. 1306-1309.
6. Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology / Ed. Walker J.M.. - N.Y., L.: Human Press, 1984.
- Vol. 2. - P. 31.
7. Phylogenomics of Life-Or-Death Switches in Multicellular Animals: Bcl-2, BH3-Only, and BNip Families of Apoptotic Regulators / А.Aouacheria, F.Brunet, M.Gouy // Molecular Biology and Evolution. - 2005.
- Vol. 22. - № 12. - P. 2395-2416.
8. Ying-Fang Sun, Jyh-Der Leu, Su-Mei Chen, I-Feng Lin and Yi-Jang Lee. Results based on 124 cases of breast cancer and 97 controls from Taiwan suggest that the single nucleotide polymorphism (SNP309) in the MDM2 gene promoter is associated with earlier onset and increased risk of breast cancer // BMC Cancer.
- 2009. -Vol. 9. - P. 13.
9. Yuhui Huang, Xiaolan Chen, Mikhail M., Dikov Sergey, Novitskiy V., Claudio A., Mosse, Li Yang, David P. Carbone Distinct roles of VEGFR-1 and VEGFR-2 in the aberrant hematopoiesis associated with elevated levels of VEGF // Blood. - 2007. - July 15. - Vol. 110(2).
- P. 624-631.
10. Zhang Y., Xiong Y. A p53 amino-terminal nuclear export signal inhibited by DNA damage-induced phosphorylation // Science. - 2001. - Vol. 292 - Р. 1910-1915.
