CC BY
35
© 12Горбач О. I., 1Храновська Н. М., 1Скачкова О. В., 12Сидор Р. I., 2Позур В. К. УДК 616-006-085:615. 37
12Горбач О. I., 1Храновська Н. М., 1Скачкова О. В., 12Сидор Р. I., 2Позур В. К.
ПОеДНАННЯ ВАКЦИНИ НА ОСНОВ1 ДЕНДРИТНИХ КЛ1ТИН ТА НИЗЬКИХ ДОЗ ДОКСОРУБ1ЦИНУ - ЕФЕКТИВНИЙ МЕТОД В БОРОТЬБ1 З ПУХЛИННОЮ 1МУНОСУПРЕС1еЮ
Жацюнальний ¡нститут раку (м. КиГв) 2Кшвський нацюнальний ушверситет ¡меш Тараса Шевченка (м. КиГв)
Доошдження проводили в рамках науково-до-слщно'| роботи НДЛ експериментально'| онкологи На-цюнального ¡нституту раку Укра'ши «Розробити метод комбЫованоУ специф1чноУ та неспециф1чноУ ¡муноте-рапп в експериментi та визначити показання до його застосування в комплексному л^ваны хворих на зло-якiснi новоутворення» (шифр теми - В. Н. 14.01.07. 122-10, № державноУ реeстрацi¡ 0109и000439, 20102012 рр.).
Вступ. У зв'язку з недостатньою ефективнiстю основних методiв л^вання злоякiсних новоутворень, у всьому свт активно йде пошук нових пiдходiв про-типухлинноУ терапi¡. Останнiм часом активно розви-ваеться напрямок хiмiоiмунотерапi¡ (Х1Т), зокрема поеднання iмунотерапi¡ на основi дендритних клiтин (ДК) та низьких доз хiмiопрепаратiв [10, 11].
На тзых стадiях пухлинноУ прогресп у хворих спо-стерiгаeться iмунодефiцитний стан, що характеризу-еться зниженням активност Т-лiмфоцитiв, природ-них ктерних клiтин (ПКК), системи мононуклеарних фагоци^в, порушенням механiзмiв презентацi¡ анти-геыв, збiльшення кiлькостi супресорних кJliтин з фенотипом С04+С025+Бохр3+ та супресорних кглтин мie-ло¡дного походження (МЮЭС) [2]. Бiльшiсть основних методiв протипухпинно'| терапi¡ (хiрургiя, променева терапiя та хiмiотерапiя) також ¡ндукують клмтинну ¡му-носупресiю. Пухлинна iмуносупресiя розвиваеться як на системному (порушення дозрiвання лiмфоцитiв, недостатня активацiя ангиненпрезентуючих клмтин (АПК), синтез протизапальних цитоюыв), так i на локальному (пiдвищення ктькост супресорних клптин в мiкрооточеннi (МО) пухлини, синтез протизапальних цитокiнiв, неповна актива^я ефекторних кттин) рiв-нях, що значно ускладнюе створення ефективних ¡му-нотерапевтичних препаратiв.
Пухлина та кштини ¡¡ МО здатнi секретувати ряд факторiв, що допомагають пухлинним кпiтинам уни-кати iмунно¡ вщповщ, до них вiдносять УБОр 11-10, ТСБ-р, Б2, розчинний фосфатидилсерин, Бае, БавЬ, т1оД, якi чинять iмуносупресорну дiю та сприяють iнвазi¡ та метастазуванню пухлини [16, 12, 3]. В МО пухлини ТОБ-р, в основному, продукують МЮБС [2] та Т-регуляторы кпiтини з фенотипом С04+С025+Бохр3+, а саме субпопуляцiя ТИ3 [14, 6]. ТОБ-р в МО пухлини Ыпбуе продукцiю ПКК 1ФНу i пригнiчуe антитiло-за-лежну кпiтинну цитотоксичнють через фосфорилю-вання бiлку БМД03 [15].
Дiя низьких доз хiмiопрепаратiв мае ¡стотний вплив на МО пухлини за рахунок антианпогенного ефекту, а не на пролiферативну активнють пухлин-них кпiтин [18]. Показано, що пщ дieю низьких доз хiмiопрепаратiв вiдбуваeться зменшення популяцi¡ С04+С025+РохР3+-кттин, що чинять iмуносупресорну дiю, за рахунок чого може значно посилюватися про-типухлинна дiя вакцини [7].
Метою роботи було дослщити вплив Х1Т на осно-вi ДК-вакцини та доксорубщину дозою 0,2 мг/кг на МО пухлини та ¡мунну систему тварин на моделi ми-шино¡ саркоми-37 (С37).
Об'ект I методи досл1дження. В експериментi використано 40 мишей лiнi¡ СВА, самщ вагою 18-22 г. та вком 1,5-2 мiсяцi, розведення вiварiю Нацюналь-ного ¡нституту раку. Всi процедури з тваринами проводили з дотриманням принцитв гуманности ви-кладених у директивi Ради бвропейського Союзу 86/609/ЕС «Про зближення законiв, постанов та ад-мiнiстративних положень держав 6С з питань захисту тварин, що використовуються для експеримен™ та ¡нших наукових цiлей» вiд 24 листопада 1986 р.
В якос^ експериментально'| пухпинно¡ моделi ви-користовували лЫю пухлинних кпiтин саркома-37. Кттини вводили внутрiшньом'язево в концентрацi¡ 2 х 106 кпiтин на тварину. Доксорубщин в дозах 0,2 мг/мл вводили тваринам ¡нтраперитонеально. ДК-вакцину вводили внутршньовенно в орбiтальний синус ока в концентрацп 0,2х106 ДК на тварину, починаючи з 15ч пiсля перещеплення пухлини, три рази з ¡нтервалом в 3-4 доби.
Тварини були розподiленi на наступы групи:
- контрольна група (тварини з перещепленою С-37, п = 10);
- ДК (тварини з С-37, що отримували ттьки ДК-вакцину на 15, 18 та 22 добу пюля перещеплення пух-лини, п = 10);
- ООХ (тварини з С-37, що отримували доксорубщин (доза 0,2 мг/кг) на 7,8,9,10 та 11 добу пюля перещеплення пухлини, п = 10);
- Х1Т (тварини з С-37, що отримували ДК-вакцину на 15, 18 та 22 добу пюля перещеплення пух-лини та доксорубщин (доза 0,2 мг/кг) на 7,8,9,10 та 11 добу пюля перещеплення пухлини, п = 10).
Протягом експерименту проводили замiри об'ему первинно'| пухлини в трьох проек^ях з ¡нтервалом 2-3
доби, починаючи з 10-ï доби тсля перещеплення пух-линних кттин, та визначали ïï об'ем за формулою:
V = 6 nDx D2 D3, де
6
V - об'ем первинно'| пухлини;
D1-3 - проекцп в яких вим1рювали д1аметр пухлини,
см.
На 23 добу пюля перещеплення С-37 тварин деви тал1зували та проводили заб1р бюлопчного матер1алу для подальших ¡мунолог1чних дослщжень.
Отримання ДК-вакцини. В якост джерела ДК використовували спленоцити ¡нтактних сингенних мишей. ДК отримували за методикою [9] з деякими модифка^ями. Вс манiпуляцiï з кл^инами проводили з дотриманням правил асептики. Суспензю спле-ноцитiв в концентрацiï 5х106/мл iнкубували при 37 0С i 5 % С02 протягом доби в повному культуральному се-редовищi RPMI-1640. Клiтини концентрували шляхом центрифугування протягом 15 хв. при 1000 об/хв. на градieнтi щтьност 14,5 %о метризамiду. ДК «наванта-жували» пухлинними антигенами наступним чином: кл^ини iнкубували в концентрацiï 1 х 106/мл в серед-овищi RPMI-1640 потягом 4 годин при 37 0С i 5 %> С02 в присутностi механомодифiкованих лiофiлiзованих пухлинних кл^ин. Потiм ДК вiдмивали, доводили кон-центрацiю до 1 х 106/мл, та використовували в якост ДК-вакцини.
Визначення рвня експресп мРНК цитоюн1в. Час-тину селезiнки або пухлини занурювали у 0,3 мл розчину RNA-later («Ambion», USA) для стаб^зацп РНК. Видтення тотальноï РНК проводили методом кислотно-фенольно'| екстракцiï з використанням ПЛР-тест набору «Рибозоль-А» («AmpliSens», Росiя), отриману РНК обробляли ДНКазою («Ambion», USA). Для отримання кДНК проводили реакцiю зворот-ноï транскрипцп з використанням ПЛР-тест-набору «Реверта-Ь-100» («AmpliSens», Росiя). Рiвень екс-пресiï гешв IFNy, TGF-ß, VEGF та FoxP3 визначали з допомогою ПЛР в режимi реального часу на приладi 7500 Real-Time PCR Systems («Applied Biosystems», USA) з використанням специфiчних праймерiв та сумiшi Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo
Scientific, USA). Послщовност праймерiв були 50
пiдiбранi експериментально з використанням 45
програми Primer Express Software v3.0 («Ap- о 4j0
plied Biosystems», USA) та синтезован фiрмою о_ 35
«Applied Biosystems», (USA). Рiвень експресiï I 30
геыв оцiнювали за допомогою методу ÀÀCt з g 2,5
нормуванням вщносно експресiï ендогенного с 20
контролю. В якост ендогенного контролю ви- 1j5
користовували рiвень експресiï house-keeping о 1,0
гену глщеральдегщ-3-фосфатдепдрогенази 05
(GAPDH). 0;0
Статистичну обробку даних здмснюва-ли, використовуючи t-критерм Стьюдента для параметричних та критерм Mанна-Уíтнi
для непараметричних даних. Для визначення Рис
об'ему первинноï пухлини застосовували дис- вали персмний аналiз для повторних вимiрiв. Всю
статистичну обробку даних проводили в програм1 ЭгаНэНоа 10.
Результати досл1джень та Тх обговорення. В
ход1 експерименту встановлено, що максимальний пригн1чуючий вплив на рют пухлини було зареестро-вано у тварин, що одержували комб1новану Х1Т. Так, у тварин, що отримували Х1Т заф1ксовано достов1р-не зменшення об'ему пухлини пор1вняно як з контролем (р < 0,01), так \ монотератею ДК (р < 0,01) та ЭОХ (р < 0,01), починаючи з 23 доби 11 росту. У тварин, що одержували тератю за схемами ДК, ЭОХ1, не спостер1гали статистично достов1рного зменшення об'ему первинноТ пухлини пор1вняно з контрольною групою (рис. 1).
Подальш1 дослщження присвячен1 з'ясуванню ме-хан1зм1в впливу Х1Т на МО пухлини та ¡мунну систему оргашзму. Вiдомо, що протипухлинна активнiсть хiмi-опрепаратiв у низьких дозах реалiзуeться переважно через Тх вплив на МО пухлини, а не на саму пухлину [9]. Тому, враховуючи одержат результати, нашим наступним завданням було дослщити плив Х1Т на МО первинноТ пухлини.
У МО пухлини ми визначали рiвень експресп мРНК протизапального цитоюну TGF-p та анпогенного фактора УЕй^ яю сприяють росту та iнвазiТ пухлини.
TGF-p е протизапальним супресорним цитоюном, який сприяе експансiТ Тгед та пщвищуе в них про-дукцю транскрипцiйного фактору FoxP3, у результа-тi чого пiдвищуeться Тх функцюнальна активнiсть та розвиваеться пухлинно-асоцiйована iмуносупресiя. Крiм того, TGF-p пригнiчуe пролiферативну активнiсть Т-лiмфоцитiв та ПКК [15]. Секретувати TGF-p здатнi пухлиннi кл^ини, фiбробласти, пухлинно-асоцiйованi макрофаги, T-рег та МЭЭО, якi входять до МО пухлини [2, 17]. Нами встановлено достовiрне зменшення рiвня експресп мРНК TGF-p в пухлинi у тварин всiх до-слiджуваних груп. Так, рiвень експресiТ мРНК TGF-p в групi тварин, що одержували Х1Т, зменшуеться в 16.7 рази порiвняно з контрольною групою, у грут тварин, що отримували ДК-вакцину - в 55,7 разiв та у грут ЭОХ - в 18.6 разiв (р < 0.01) (рис. 2 А). 3 отриманих даних можна зробити висновок, що застосування ДК-вакцини та доксорубщину як в режимi монотерапп,
1. Об'ем пухлини мишей лшм СВА з С-37, що отриму-комб1новану Х1Т (* - p < 0. 01 пор1вняно з контрольною групою).
Pиc. 2. Piвeнь eкcпpecГГ цитoкiнiв в мiкpooтoчeннi пухлини C37 мишвй лшп CBA: A — piвeнь eкcпpecГГ мPHK TGF-ß; Б — piвeнь eкcпpecГГ мPHK VEGF (* — p < O.O1 пopiвнянo з кoнтpoльнoю гpyпoю).
Pиc. 3. Piвeнь eкcпpecГГ цитoкiнiв cплeнoцитaми мишвй лшп CBA на 23 дeнь пicля пepeщeплeння пухлини C37: A — piвeнь eкcпpecГГ мPHK FoxP3; Б — piвeнь eкcпpecГГ мPHK IFNy (* — p < O.O1 пopiвнянo з кoнтpoльнoю гpyпoю;
** — p < O.O5 пopiвнянo з гpyпoю ÄK).
тaк i в кoмбiнaцiï викликae знaчнe змeншeння piвня eкcпpeciï мPHK TGF-ß клiтинaми МО пyxлини.
VEGF, зв'язyючиcь з peцeптopoм VEGFR2, зa-пycкae нeoплacтичний aнгioгeнeз в peзyльтaтi чoгo збiльшyeтьcя щшьнють мiкpocyдин, i мaлiгнiзoвaнa ткaнинa oтpимye знaчнo бiльшe пoживниx peчoвин [1]. VEGF, пpигнiчyючи aпoптoз, cтимyлюe виживa-нicть eндoтeлiaльниx клiтин, вiдiгpae вaжливy poль в мoбiлiзaцiï i мiгpaцiï пoпepeдникiв eндoтeлioцитiв з кicткoвoгo мoзкy в дiлянки aнгioгeнeзy. VEGF тaкoж збiльшye cyдиннy пpoникнicть, iнгiбye дифepeнцiaцiю cyдинниx клiтин, aктивye ткaниннi фaктopи тa мiгpa-цiю мoнoцитiв [1]. В МО пyxлини VEGF здaтнi ceкpeтy-вaти фiбpoблacти, пyxлиннo-acoцiйoвaнi мaкpoфaги тa влacнe пyxлиннi клiтини. Peзyльтaти дocлiджeнь пoкaзaли, щo y фут твapин, якi oтpимyвaли XIT, вщ-бyвaeтьcя дocтoвipнe змeншeння в 3 paзи piвня era-пpeciï мPHK VEGF пopiвнянo з кoнтpoльнoю гpyпoю твapин, p < O.O1 ^и^ 2 Б). Пpи зacтocyвaннi мoнoтe-paпiï ДK-вaкцинoю piвeнь eкcпpeciï мPHK VEGF змeн-шyeтьcя в 2 paзи (p < O. O1) тa мoнoтepaпiï дoкcopyбi-цинoм в дoзi O.2 мг/кг - в 3 paзи (p < O.O1).
Biдпoвiднo дo oтpимaниx peзyльтaтiв мoжнa зpo-бити виcнoвoк, щo зacтocyвaння ДK-вaкцини тa дo-кcopyбiцинy, як oкpeмo тaк i в кoмбiнaцiï, cпpияe знaчнoмy знижeнню piвня eкcпpeciï мPHK VEGF, тим
6в
caмим пpигнiчyючи пpoдyкцiю VEGF пyxлинними кт-тинaми тa ïï МО.
T-peг вiдiгpaють ключoвy poль в iмyннiй cиcтeмi зaвдяки yнiкaльнiй здaтнocтi кoнтpoлювaти iмyннy вiдпoвiдь. Cepeд ниx видiляють пoпyляцiю T-peг кт-тин з фeнoтипoм CD4+CD25+Foxp3+, щo пpигнiчyють пpoтипyxлинний iмyнiтeт, тим caмим cпpияючи пyx-линшй пpoгpeciï. Знaчнe збiльшeння кiлькocтi T-peT клiтин в opгaнiзмi пyxлинoнociя мoжe 6ути пoв'язaнo з пpигнiчeнням пyxлинocпeцифiчнoï пpoтипyxлиннoï iмyннoï вiдпoвiдi, щo в cвoю чepгy нeгaтивнo впливae нa eфeктивнicть XIT [19]. Для Tpeг клiтин xapaктepнa нaявнicть в ядpi ядepнoгo фaктopy FoxP3, тoмy ви-знaчeння piвня eкcпpeciï мPHK дaнoгo фaктopy мoжe cвiдчити пpo кшькють дaниx клiтин в ткaнинi тa ïx фyнкцioнaльнy aктивнicть.
В дaнoмy eкcпepимeнтi ми дocлiджyвaли piвeнь eкcпpeciï мPHK FoxP3 cплeнoцитaми мишeй нa 23 дeнь пicля тpaнcплaнтaцiï пyxлинниx клiтин. У peзyль-тaтi вiдмiчeнo дocтoвipнe знижeння piвня eкcпpeciï мPHK ядepнoгo фaктopy y твapин вcix гpyп, щo oтpи-мyвaли тepaпiю. У гpyпi кoмбiнoвaнoï XIT ^o^epi-гaли мaкcимaльнe змeншeння piвня eкcпpeciï мPHK, щo cтaнoвилo нa 46 % мeншe пopiвнянo з кoнтpoль-нoю гpyпoю, p < O.O1. У гpyпax твapин, щo oдepжy-вaли мoнoтepaпiю, тaкoж cпocтepiгaли cтaтиcтичнo
достов1рне зниження eKcnpecii мРНК FoxP3. У тва-рин, що отримували тiльки ДК-вакцину, piBeHb екс-npecii мРНК FoxP3 зменшуеться на 32 % (р < 0.01), а в rpyni тварин, що отримували ттьки доксорубщин, - на 39 % (p < 0. 01) поpiвняно з контрольною групою тварин (рис. 3 А).
Таким чином, застосування доксорубщину в дозi 0.2 мг/кг пщсилюе дiю ДК-вакцини, сприяючи зни-женню на 21 % piвня експресп мРНК FoxP3 клiтинами ceлeзiнки поpiвняно з групою тварин, що отримували ттьки ДК-вакцину, р < 0.05. Можна припустити, що ДК-вакцини та низьк дози докcоpyбiцинy при ix ком-бiнованомy заcтоcyваннi у тварин з пухлиною мають cинepгiчнy дю щодо зменшення кiлькоcтi та актив-ноcтi Трег клiтин з супресорною активнютю.
1ФНу вiдiгpаe ключову роль в протипухлинному iмyнiтeтi, пiдвищyючи активнють ПКК, регулюе про-лiфepацiю Т-кгмтин, модулюе активнicть АПК, воло-дie антипpолiфepативним i проапоптичним ефектом, впливаючи на пухлини через JAK1 або JAK2/STAT1 cигнальнi шляхи [8, 13]. Максимальне пщвищен-ня в 2 рази piвня eкcпpecii мРНК IFNy cпоcтepiгали у тварин, що отримували ДК-вакцину в комбЫацп з доксорубщином поpiвняно з контрольною групою, p < 0.01. Застосування тiльки ДК-вакцини сприяе пщ-вищенню piвня експресп мРНК IFNy на 76 % поpiвняно з контрольною групою тварин, p < 0.01. Також в^^-чено збтьшення на 73 % piвня eкcпpecii мРНК IFNy спленоцитами тварин, що отримували докcоpyбiцин в дозi 0.2 мг/кг поpiвняно з контрольною групою, p < 0.01 (рис. 3. Б). З отриманих даних можна зроби-ти висновок, що використання ДК-вакцини та доксорубщину як в монотерапп, так i в комбшацп, сприяе значному пщвищенню piвня eкcпpecii мРНК IFNy по-piвняно з групою тварин, що не отримували терапю. Проте при застосуванн комбiнованоi Х1Т в^^чено бiльш вагомий вплив на експресю мРНК IFNy, нiж при використанн монотepапii.
Застосування Х1Т, монотepапii ДК-вакциною або доксорубщином сприяе значному зменшенню про-дукцй' ангiогeнного фактору VEGF кштинами пер-винноi пухлини та кштинами МО пухлини, завдяки чому не вщбуваеться нeоангiогeнeз i припиняеться picт пухлини. Комбiнована Х1Т та монотератя також
позитивно впливае на МО пухлини, власне зменшу-ючи експресю протизапального цитоюну TGF-ß, що свщчить про зменшення локально! ¡муносупресп.
У мишей ядерний фактор FoxP3 в основному експресуеться тiльки Т-рег клiтинами з фенотипом CD4+TCRaß+, що володють супресорною активнiстю [4, 5]. На фон зменшення iмуносупресii в МО пухлини, комбЫована тератя сприяе значному зменшенню Т-рег кгмтин в селезiнцi, тим самим послаблюючи системну iмуносупресiю. Kрiм того, тварин вЫх груп, де використовували терапю, вiдмiчено значне пщви-щення експресп мРНК IFNy. Тому можна припустити, що вщбуваеться посилення протипухлинно! актив-ностi ¡мунно! системи.
Виходячи з отриманих даних, можна зробити висновок, що додаткове застосування доксорубщину в дозi 0.2 мг/кг перед застосуванням ДК-вакцини поси-люе пригычуючий ii вплив на рют первинно! пухлини, створюе антиангiогенний ефект в зонi росту пухлини, зменшуе iмуносупресiю в МО пухлини та посилюе системну ¡мунну вiдповiдь, зменшуючи кiлькiсть та активнiсть Т-рег кглтин та посилюючи продукцiю IFNy.
Висновки.
1. Xiмiоiмунотерапiя на основi ДК-вакцини та низьких доз доксорубщину мае суттевий протипух-линний ефект при ii застосуванн у тварин з переще-пленою пухлиною.
2. Застосування ДК-вакцини та доксорубщину в дозi 0.2 мг/кг в монотерапп та комбЫовано чинить антианпогенний ефект на первинну пухлину шляхом зменшення рiвня експресii гену VEGF, послаблюе локальну iмуносуперсiю, знижуючи експресiю мРНК TGF-ß в мiкрооточеннi пухлини.
3. Xiмiоiмунотерапiя сприяе зниженню системноi iмуносупресii, знижуючи рiвень експресii гену FoxP3 та суттево посилюе IFNy-продукуючу здатнiсть кштин селезiнки.
Перспективи подальшихдослщжень. Оде ржа нi
результати обфунтовують доцiльнiсть комбiнування ДК-вакцини з низькими дозами доксорубщину. Подальше дослщження протипухлинного ефек-ту ДК-вакцини та низьких доз доксорубщину при-зведе до створення ефективних схем комбЫовано'| протипухпинно'| терапii, що дозволить в наступному проведденя клiнiчних дослiджень дано'| терапii.
^¡TepaTypa
1. HexoHMH B. n. Po^b VEGF b pa3BMTm/i Heon^acTMHecKoro aHrnoreHe3a / B. n. HexoHMH, C. A. LUenH, A. A. KopHarnHa [Ta ¡h.] // BecTHHK PAMH. - 2012. - № 2. - C. 23-34.
2. Bunt S. K. Inflammation induces myeloid-derived suppressor cells that facilitate tumor progression. / S. K. Bunt, P. Sinha, V. K. Clements, J. Leips [et al.] // J. Immunol. - 2006. - Vol. 176, № 1. - P. 284-290.
3. Lima L. G. Tumor-derived microvesicles modulate the establishment of metastatic melanoma in a phosphatidylserine-depen-dent manner / L. G. Lima, R. Chammas, R. Q. Monteiro [et al.] // Cancer Lett. - 2009. - Vol. 283, № 2. - P. 168-175.
4. Mayer C. T. Lack of Foxp3+ macrophages in both untreated and B16 melanoma-bearing mice / C. T. Mayer, A. A. Kuhl, C. Loddenkemper [et al.] // Blood. - 2012. - Vol. 119. - P. 1314-1315.
5. Miyao T. Plasticity of foxp3(+) T cells reflects promiscuous foxp3 expression in conventional T cells but not reprogramming of regulatory T cells / T. Miyao, S. Floess, R. Setoguchi [et al.] // Immunity. - 2012. - Vol. 36. - P. 262-275.
6. Park H. B. Acquisition of anergic and suppressive activities in transforming growth factor-beta-costimulated CD4+CD25-T cells / H. B. Park, D. J. Paik, E. Jang, S. Hong [et al.] // Int. Immunol. - 2004. - Vol. 16, № 8. - P. 1203-1213.
7. Penel N. Cyclophosphamide-based metronomic chemotherapy: After 10 years of experience, where do we stand and where are we going? / N. Penel, A. Adenis, G. Bocci // Critical Reviews in Oncology / Hematology. - 2012. - Vol. 82, № 1. - P. 40-50.
8. Saha B. Gene modulation and immunoregulatory roles of interferon gamma / B. Saha, S. Jyothi Prasanna, B. Chandrasekar [et al.] // Cytokine. - 2010. - Vol. 50, № 1. - P. 1-14.
9. Shalin H. N. Dendritic Cell Protocols / H. N. Shalin. - Humana Press, 2010. - 446 p.
10. Sistigu A. Immunomodulatory effects of cyclophosphamide and implementations for vaccine design / A. Sistigu, S. Viaud, N. Chaput [et al.] // Semin Immunopathol. - 2011. - Vol. 33. - P. 369-383.
11. Slovin S. Chemotherapy and immunotherapy combination in advanced prostate cancer / S. Slovin // Clinical Advances in Hematology & Oncology. - 2012. - Vol. 10, № 2. - P. 90-100.
12. Solberg T. D. Correlation between tumor growth delay and expression of cancer and host VEGF, VEGFR2, and osteopon-tin in response to radiotherapy / T. D. Solberg, J. Nearman, J. Mullins [et al.] // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. - 2008. -Vol. 72, № 3. - P. 918-926.
13. Spadaro F. IFN-a cross-presentation in human dendritic cells by modulating antigen survival, endocytic routing, and processing / F. Spadaro, C. Lapenta, S. Donati [et al.] // Blood. - 2012. - Vol. 119. - P. 1407-1417.
14. Tang Q. Distinct roles of CTLA-4and TGF-beta in CD4+CD25+ regulatory T cell function / Q. Tang, E. K. Boden, K. J. Henriksen, H. Bour-Jordan [et al.] // Eur. J. Immunol. - 2004. - Vol. 34, № 11. - P. 2996-3005.
15. Trotta R. TGF-beta utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFNgamma production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells / R. Trotta, J. Dal Col, J. Yu, D. Ciarlariello [et al.] // J. Immunol. - 2008. - Vol. 181, № 6. -P. 3784-3792.
16. Tsujimoto H. Roles of inflammatory cytokines in the progression of gastric cancer: friends or foes? / H. Tsujimoto, T. Ono, T. Ichikura [et al.] // Gastric Cancer. - 2010. - Vol. 13, № 4. - P. 212-221.
17. Umemura N. Tumor-infiltrating myeloid-derived suppressor cells are pleiotropic-inflamed monocytes/macrophages that bear M1- and M2-type characteristics / N. Umemura, M. Saio, T. Suwa [et al.] // J Leukoc Biol. - 2008. - Vol. 83, № 5. -P. 1136-1144.
18. Wang S. TRAIL and Doxorubicin Combination Induces Proapoptotic and Antiangiogenic Effects in Soft Tissue Sarcoma In vivo / S. Wang, R. Wenhong, L. Jeffery [et. al.] // Clin Cancer Res. - 2010. - Vol. 16, № 9. - P. 2591-2604.
19. Yang Z. Z. The role of Treg cells in the cancer immunological response / Z. Z. Yang, S. M. Ansell // Am. J. Immunol. - 2009. - Vol. 5, № 1. - P. 17-28.
YflK 616-006-085:615. 37
noeAHAHHfl BAKUMHM HA OCHOBI flEHflPMTHMX KniTMH TA HM3bKMX flO3 flOKCOPYBIUMHy -EOEKTMBHMM METOfl B BOPOTbBI 3 nyX^MHHOW IMyHOCynPECIGW
rop6an O. I., XpaHOBCbKa H. M., CKaHKOBa O. B., CMflop P. I., no3yp B. K.
Pe3№Me. MeTora po6oTH 6y.no flocnifli/rn/ Bn.ni/iB XIT Ha 0CH0Bi flK-BaKui/mi/i Ta floKcopy6iui/iHy flo3ora 0,2 Mr/ Kr Ha MiKpooToneHHH nyxn/H/ Ta iMyHHy CMCTeMy TBap/H Ha Mofleni M/manoi capKoMM-37. XiMioiMyHoTepania Ha ocHoBi flK-BaKUHHM Ta H/3bK/x flo3 floKcopy6iui/iHy Mae cyttgbmm npoT/nyxn/HH/M e0eKT np/ ii 3acTocyBaHHi y TBap/H 3 nepe^enneHora nyxn/Hora. 3acTocyBaHHa flK-BaKU/H/ Ta floKcopy6iui/iHy b flo3i 0.2 Mr/Kr b MoHoTepanii Ta KoM6iHoBaHo Hi/HMTb aHTi/iaHrioreHHi/iM e0eKT Ha nepB/HHy nyxn/Hy wniaxoM 3MeHi±ieHHa piBHa eKcnpecii reHy VEGF, nocna6nrae noKanbHy iMyHocynepcira, 3Hi/ixyraHM eKcnpecira mPHK TGF-p b MiKpooToHeHHi nyxn/H/. XiMioiMyHoTepania cnp/ae 3Hi/ixeHHra c/CTeMHoi iMyHocynpecii, 3Hi/ixyraHM piBeHb eKcnpecii reHy FoxP3 Ta cyrreBo noc/-nrae IFN-y-npoflyKyraHy 3flaTHicTb KniT/H cene3iHK/. OflepxaHi pe3ynbTaT/ BKa3yraTb Ha flouinibHicTb KoM6iHyBaHHa xiMio- Ta iMyHoTepaneBT/HH/x MeTofliB np/ po3po6ui 6inibi±i e0eKTMBHi/ix niflxofliB flnia npo0LnaKTi/iKM peui/ifli/iBiB Ta MeTacTa3iB y xBop/x Ha 3noaKicHi HoBoyTBopeHHa nicna ocHoBHoro niKyBaHHa.
K^№HOBi c.noBa: flK-BaKU/Ha, floKcopy6iu/H, xiMioiMyHoTepaneBT/HHi/M pex/M, KoM6iHoBaHa Tepania, capKoMa-37.
yflK 616-006-085:615. 37
COHETAHME BAKUMHbl HA OCHOBE flEHflPMTHblX K^ETOK M HM3KMXflO3 flOKCOPyBMUMHA - 30-OEKTMBHblM METOfl B BOPbBE C OnYXO^EBOM MMMYHOCYnPECCMEM
Top6aH A. M., XpaHOBCbKa H. H., CKaHKOBa O. B., CMflop P. M., no3yp B. K.
Pe3№Me. Uenbra pa6oTbi 6binio /ccnefloBaTb Bn/aH/e xi/iMi/ioi/iMMyHoTepani/iM Ha ocHoBe flK-BaKU/Hbi / floKco-py6/u/Ha flo3oM 0,2 Mr / Kr Ha M/KpooKpyxeH/e onyxon/ / MMMyHHyra CMCTeMy xmbothnx Ha Moflen/ mh^mhom capKoMbi-37. X/MMo/MMyHoTepan/a Ha ocHoBe flK-BaKU/Hbi m h/3kmx flo3 floKcopy6i/mi/iHa i/MeeT cyi^ecTBeHHbifi npoT/BoonyxoneBHM 300eKT np/ ee np/MeHeH/M y xmbothhx c nepeB/BaeMora onyxonbra. np/MeHeH/e flK-BaKUMHbi m floKcopy6/u/Ha flo3oM 0.2 Mr/Kr b MoHoTepan/M m coBMecTHo oKa3biBaeT aHTi/iaHri/ioreHHbiM 300eKT Ha nepB/HHyra onyxonb nyTeM yMeHbrneH/a ypoBHa 3Kcnpecc/M reHa VEGF, ocna6naeT noKanbHyra MMMyHocynepc/ra, CH/xaa 3Kcnpecc/ra mPHK TGF-p b M/KpooKpyxeH/M onyxon/. X/MMo/MMyHoTepan/a cnoco6cTByeT CH/xeH/ra CMCTeMHoM MMMyHocynpecc/M, CH/xaa ypoBeHb 3Kcnpecc/M reHa FoxP3 m cy^ecTBeHHo yc/n/BaeT npoflyKU/ra IFN-y KneTKaMM cene3eHKM. nonyHeHHbe pe3ynibTaTbi yKa3HBaraT Ha uenecoo6pa3HocTb KoM6/HMpoBaHMa xmmmo- m MMMyHoTepaneBT/HecK/x MeTofloB np/ pa3pa6oTKe 6onee 300eKTMBHbx noflxofloB np/ npo0/naKTMKM peu/fl/BoB m MeTacTa3oB y 6onibHbix 3noKaHecTBeHHbMM HoBoo6pa3oBaH/aMM nocne ocHoBHoro neHeH/a.
Kn№HeB^e c^oBa: flK-BaKU/Ha, floKcopy6/u/H, capKoMa-37, x/M/o/MMyHoTepaneBTMHecK/M pex/M, kom6m-H/poBaHHaa Tepan/a.
UDC 616-006-085:615. 37
Combination of Vaccine Based on Dendritic Cells and Low-Dose Doxorubicin as an Effective Method to Reduce Tumor Immunosuppression
Gorbach O. I., Khranovska N. M., Skachkova O. V., Sydor R. I., Pozur V. K.
Abstract. Immunodeficiency caused by T lymphocytes, natural killer cells and mononuclear phagocytes system decreased activities, antigen presentation mechanisms defection, increased number of T suppressor cells with CD4+ CD25+ Foxp3+ phenotype is observed in patients with later tumor progression stages. The tumor cells and their microenvironment are able to secrete factors that help tumor avoid immune response and promote invasion and metastasis. Low-dose chemotherapy has a significant effect on the tumor microenvironment by reducing angiogenesis and CD4+CD25+FoxP3+-cells number. The aim of the study was to investigate the impact of chemoimmunotherapy based on DC vaccine and 0. 2 mg/kg dose doxorubicin on tumor microenvironment and immune system of animals in the murine sarcoma-37 model.
We have used sarcoma-37 cell line as an experimental tumor model. The tumor cells were injected intramuscularly in amount of 2x106 cells per CBA mice. Doxorubicin at 0.2 mg/ml doses was injected intraperitoneally. DC vaccine was injected intravenously into the eye orbital sinus in concentration of 0,2x106 DC per animal after 15th day of tumor transplantation, three times with 3-4 days interval.
Chemoimmunotherapy had significant antitumor effect in animals with transplanted tumor. Significant reduction in primary tumor volume was observed in chemoimmunotherapy treated animals group compared with control (p < 0.01), DC vaccine group (p < 0.01) and DOX group (p < 0.01). Also, 3 times VEGF mRNA expression level decrease was found compared to the control group, p < 0.01. Its level in splenocytes in DC vaccine group has reduced in 2 times (p < 0.01) and in doxorubicin group - in 3 times (p < 0.01). The TGF-p mRNA expression level in chemoimmunotherapy group decreased in 16. 7 times, in DC group - in 55.7 times and in DOX group - in 18.6 times compared to the control group, p < 0.01.
Maximal reduction of FoxP3 mRNA expression level on 46 % (p < 0.01) compared with the control group was observed in splenocytes of combined therapy based on DC-vaccine and 0.2 mg/kg doxorubicin group. We have shown that its level in DC vaccine group decreased on 32 % (p < 0.01) and in the doxorubicin group - on 39 % (p < 0.01) compared with the control group. Administration of 0.2 mg/kg doxorubicin enhanced DC vaccine effect, decreasing the FoxP3 mRNA expression level on 21 % in splenocytes compared to the DC vaccine group, p < 0.05.
We have found that in chemoimmunotherapy group IFN-y mRNA expression level in splenocytes increased in 2 times compared with the control group, p < 0.01. DC vaccine administration increased IFN-y mRNA expression level on 76 % compared with the control group, p < 0.01. Its level increased on 73 % in 0.2 mg/kg doxorubicin group in splenocytes compared to the control group, p < 0.01.
Application of DC vaccine and doxorubicin at 0.2 mg/kg dose as monotherapy and/or combined therapy had an antiangiogenic effect on primary tumor by VEGF gene expression reduction. It also reduced TGF-p mRNA expression in tumor microenvironment resulting in local immunosuppression diminishment. Chemoimmunotherapy helped to reduce systemic immunosuppression via FoxP3 expression decrease and IFN-y-producing ability of spleen cells increase. Obtained results show the importance of chemo- and immunotherapeutic methods combining for the development of high effective approaches of recurrence and metastasis prevention after primary treatment for cancer patients.
Keywords: DC vaccine, doxorubicin, chemoimmunotherapeutic regimen, combined therapy, sarcoma-37.
Рецензент - проф. Кочина M. Л.
Стаття надшшла 12. 09. 2014 р.
