ПОДТИПЫ РЕЦЕПТОРОВ НОНАПЕПТИДОВ НЕЙРОГИПОФИЗА И ИХ ФУНКЦИИ В ПОЧКАХ КРЫСЫ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 577.175.34: 577.171.6: 575.1 13.1: 577.322: 577.323

Подтипы рецепторов нонапептидов нейрогипофиза и их функции в почках крысы

А. В. Кутина*, А. А. Макашов, Е. В. Балботкина, Т. А. Каравашкина, Ю. В. Наточин

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург,

194223 Россия

*E-mail: kutina_anna@mail.ru

Поступила в редакцию 27.02.2019

После доработки 11.02.2020

DOI: 10.32607/actanaturae.10943

РЕФЕРАТ Нонапептиды нейрогипофиза вазотоцин и мезотоцин, выявляемые у большинства позвоночных, у млекопитающих заменены вазопрессином и окситоцином. С использованием биоинформатических методов нами определен спектр подтипов рецепторов этих гормонов у млекопитающих и их физиологические эффекты в почке крыс. Поиск последовательностей, сходных с последовательностями рецептора вазото-цина позвоночных, в протеомах и транскриптомах 9 видов млекопитающих и в геноме крысы выявил три подтипа рецепторов вазопрессина (V1a, V1b, V2) и один тип рецептора окситоцина. В почке ненаркотизи-рованных крыс, получивших водную нагрузку в объеме 2 мл на 100 г массы тела, выявлены три эффекта вазопрессина: 1) увеличение реабсорбции воды и натрия, 2) возрастание экскреции ионов калия, 3) рост экскреции ионов натрия. Обосновано предположение, что каждый из этих эффектов связан с селективной стимуляцией подтипов рецепторов вазопрессина - V2, V1b и V1a - в зависимости от концентрации нонапеп-тида. В экспериментах на ненаркотизированных крысах с водной нагрузкой показано, что инъекция окси-тоцина снижает реабсорбцию осмотически свободной воды в почке и увеличивает экскрецию ионов натрия. Проанализированы физиологические механизмы реализации обоих эффектов при участии рецептора окси-тоцина одного типа. Таким образом, спектр активируемых подтипов рецепторов изменяется в зависимости от действующей концентрации гормонов нейрогипофиза, вследствие этого изменяется и преобладающий эффект на функции почек, что обеспечивает точную регуляцию водно-солевого гомеостаза. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА почка, вазопрессин, рецепторы, биоинформатика, экскреция ионов, реабсорбция воды.

ВВЕДЕНИЕ

Нонапептиды нейрогипофиза влияют на функции различных органов и систем у млекопитающих, участвуют в регуляции социального поведения [1]. Среди периферических эффектов этих гормонов важную роль играет регуляция работы почек при поддержании водно-солевого гомеостаза [2]. В нейрогипофизе большинства позвоночных животных секретируют-ся вазопрессин-подобный (вазотоцин, вазопрессин, лизипрессин, фенипрессин) и окситоцин-подобный (окситоцин, мезотоцин, изотоцин, глумитоцин) гормоны [3]. Вазопрессин-подобные пептиды содержат остаток основной аминокислоты в положении 8 (Arg, Lys), а окситоцин-подобные - остаток нейтральной аминокислоты (Leu, Ile, Pro) [4]. Вазопрессин млекопитающих и человека участвует в регуляции функций почек: усиливает реабсорбцию воды, мочевины и натрия [5]. К основным периферическим эффектам окситоцина относятся утеротонический эффект [6]

и стимуляция выведения молока [7]. Введение высоких доз вазопрессина и окситоцина выявляет их натрийуретическое действие [8-10], а инъекции низких доз окситоцина оказывают гидроуретиче-ское действие [11]. Ранее мы показали, что введение млекопитающим вазотоцина (гормон нейрогипофиза у других классов позвоночных) вызывает интенсивный натрийурез, существенно превышающий эффект вазопрессина и окситоцина [12]. Синтезированы и охарактеризованы аналоги вазотоцина с селективным антидиуретическим и натрийуретическим действием (повышение экскретируемой фракции натрия с 0.5% до 15-20%) [13]. Выявлены также пептиды, усиливающие выведение почками ионов калия [12]. В ходе эволюции позвоночных изменялась структура как гормонов нейрогипофиза, так и соответствующих им рецепторов. Принципиально важно понять, при участии рецепторов каких подтипов опосредуются эффекты нонапептидов и их аналогов

в почке. Связаны ли они с действием пептида на известные подтипы рецепторов вазопрессина (V,,, V1a, V ) и окситоцина [14] или существуют другие подтипы рецепторов? Описан новый рецептор мыши, имеющий более высокое сродство к вазотоцину, чем к вазопрессину и окситоцину [15]. Задача настоящей работы заключалась в том, чтобы, используя методы биоинформатики, определить спектр подтипов рецепторов к пептидам семейства вазопрессина и ок-ситоцина у млекопитающих, а также выявить возможность воспроизведения эффектов, оказываемых аналогами вазотоцина, при введении крысам различных доз их природных гормонов - вазопрессина и окситоцина.

Таблица 1. Список версий использованных протеомов, транскриптомов и геномов

Вид Версия

Homo sapiens GRCh38.p12

Pan troglodytes Clint PTRv2

Pongo abelii Susie PABv2

Nomascus leucogenys Nleu 3.0

Canis lupus familiaris CanFam3.1

Rattus norvegicus Rnor 6.0

Mus musculus GRCm38.p6

Monodelphis domestica MonDom5

Ornithorhynchus anatinus Ornithorhynchus anatinus-5.0.1

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Гомологи гена вазотоцинового рецептора искали в геноме крысы (Rattus norvegicus), в протеомах и транс-криптомах 9 видов млекопитающих: крысы, человека (Homo sapiens), шимпанзе (Pan troglodytes), орангутана (Pongo abelii), белощекого гиббона (Nomascus leucogenys), собаки (Canis lupus familiaris), мыши (Mus musculus), домового опоссума (Monodelphis domestica), утконоса (Ornithorhynchus anatinus), доступных на ресурсе Genome (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/genome/). Список геномных сборок приведен в табл. 1. Для поиска гомологов использовали программы nHMMER и pHMMER, построенные на скрытых марковских моделях, а также оригинальный программный код на языке shell [16]. Степень гомологии оценивали по значениям e-value и score, которые автоматически присваивались программой на основании внутренних алгоритмов. В качестве запроса использовали марковскую модель, построенную по аминокислотным и нуклеотидным последовательностям рецепторов вазотоцина (V^-подтип) различных позвоночных. Пороговое значение e-value выбрано на уровне le-3 для аминокислотных выравниваний и le-10 - для нуклеотидных согласно опубликованной методике [17]. Последовательности, не удовлетворяющие данным параметрам, в дальнейшем не рассматривали. Все найденные последовательности ранжировали в порядке уменьшения показателя сходства с запрашиваемой последовательностью (индекс Score) и представляли в графическом виде для выбора порогового уровня. В ходе дальнейших исследований использовали все последовательности с индексом Score больше порогового, а также по две последовательности ниже порогового уровня у каждого вида млекопитающих. Полученные последовательности были сохранены в одном файле в формате fasta. Множественные выравнивания найденных гомологов выполнены с помощью программы MAFFT [18]. Алгоритм L-INS-i выбран нами как наи-

более подходящий для работы с базами, содержащими менее 200 последовательностей [19]. Fasta-файл с результатами множественного выравнивания для дальнейшего анализа преобразовывали в nexus-файл с помощью web-инструмента Alignment Format Converter (http://www.ibi.vu.nl/programs/ convertalignwww/). С использованием программы MrBayes и файла в формате nexus, полученного на прошлом этапе, выполнена байесовская реконструкция филогении гомологов [20]: произведено 300 000 генераций в случае аминокислотных последовательностей и 20 000 в случае нуклеотидных последовательностей. Число генераций выбрано на основе предварительно проведенного вычислительного эксперимента, где после всех генераций стандартное отклонение вероятностей расщепления было ниже 0.01 (значение выбрано на основании опубликованных данных [20]). Кладограмма с апостериорными вероятностями для каждого расщепления и филограмма со средней длиной ветвей были сгенерированы и записаны в nexus-файл. Визуализацию и редактирование деревьев выполняли инструментом FigTree (github.com/rambaut/figtree/). Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей рецепторов вазопрессина, окситоцина и нейропепти-да S крысы выполнено с помощью Clustal Omega 1.2.4 (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).

Физиологические эксперименты выполнены на самках крыс линии Вистар весом 180-230 г. В каждой серии использовали 10 животных. Крысы получали стандартный гранулированный корм («Мелькомбинат», Россия) и имели свободный доступ к воде. С вечера накануне эксперимента крыс не кормили, но сохраняли доступ к воде. Содержание животных и проведение экспериментов соответствовали российским и международным правилам работы с лабораторными животными. В дни экспериментов у животных определяли фазы эстрального цикла с помощью микроскопического анализа мазков

влагалищных смывов. Соотношение фаз проэструс, эструс, метэструс и диэструс составило в среднем 15 ± 6, 11 ± 5, 26 ± 6 и 48 ± 7% соответственно. Вазопрессин и окситоцин (Sigma-Aldrich, США), селективные агонисты окситоциновых (Carbetocin, Tocris, Великобритания) и V^-рецепторов (Phe2,Ile3,Orn8-вазопрессин, Bachem, США) в дозах 0.005, 0.015, 0.15 нмоль на 100 г массы тела (м.т.) вводили внутримышечно на фоне водной нагрузки (вода в объеме 2 мл на 100 г м.т. через зонд в желудок), которую использовали для подавления секреции ва-зопрессина. Контролем служили животные с водной нагрузкой и внутримышечной инъекцией 0.1 мл физиологического раствора на 100 г м.т. Селективные антагонисты окситоциновых (Pmp1-Tyr(Me)2-Thr4-Orn8-des-Gly-NH29-вазотоцин, Bachem, США) и V-рецепторов (Ртр^Ту^Ме^-вазопрессин, Bachem, США) вводили в дозе 2 нмоль на 100 г м.т. внутри-брюшинно одновременно с вазопрессином в дозе 0.15 нмоль на 100 г м.т. на фоне водной нагрузки. Крыс помещали в специальные индивидуальные клетки для сбора проб мочи при спонтанных мочеиспусканиях. Осмоляльность мочи определяли на микроосмометре Advanced Instruments 3300 (США), концентрацию ионов натрия и калия - на пламенном фотометре Sherwood-420 (Великобритания). Показатели экскреции ионов и реабсорбции воды рассчитывали за период 60 мин от начала эксперимента. При расчете реабсорбции осмотически свободной воды использовали усредненное значение осмоляльности сыворотки крови у крыс после водной нагрузки, равное 288 ± 1 мОсм/кг H2O. Во всех сериях экспериментов эффекты гормонов и агонистов их рецепторов наблюдали на протяжении всего эстрального цикла, поэтому значения показателей функции почек у крыс усредняли без учета фазы цикла. Показатели функции почек нормировали на 100 г м.т. Все данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Сравнение групп проводили с помощью однофактор-ного дисперсионного анализа с последующим использованием t-теста с поправкой Бонферрони. Различия считали статистически значимыми при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Поиск подтипов рецепторов вазопрессина и окситоцина методами биоинформатики

Найденные последовательности, сходные с рецептором вазотоцина, ранжировали в порядке убывания индекса Score (рис. 1). Показано, что у последовательностей с наилучшим совпадением с запрашиваемой индекс Score составил более 600, далее степень сходства резко снижалась, и у большинства последовательностей индекс равен примерно 100. В качестве

700

600

д. 500

е

л. с 400

у

ф r 300

o

c

S 200

100

0

0

Où

* Rattus norvegicus □ Mus musculus i- Homo sapiens ■j Canis lupus familiaris

- Monodelphis domestica i Pongo abelii

Pan troglodytes = Nomascus leucogenys

- Ornithorhynchus anatinus

10 20 30 40

Номер последовательности по порядку

50

Рис. 1. Распределение найденных последовательностей по уровню сходства (Score) с усредненным рецептором вазотоцина. Пунктиром показано пороговое значение для дальнейшего анализа

порогового значения был принят уровень 200 (рис. 1). Последовательности, у которых Score был выше порогового, анализировали вручную по базе данных NCBI. Все обнаруженные белки, сходные на уровне первичной структуры с рецептором вазотоцина, аннотировали как рецепторы окситоцина и вазопрес-сина различных подтипов. Из дальнейшего анализа исключали дублирующие последовательности (в том числе мутантные аллельные варианты). Найдены актуальные версии ряда последовательностей, обновленных в базах данных.

У всех изученных видов млекопитающих выявлены четыре белка-рецептора семейства ва-зопрессина и окситоцина: V1a (AVPR1A), V (AVPR1B), V2 (AVPR2) и рецептор окситоцина (OXTR). Исключение составили три случая. Во-первых, среди последовательностей P. abelii, отобранных по уровню Score, не найден V..-рецептор. Просмотр результатов поиска выявил последовательность XP_009233694.1 (Score = 144.7) - фрагмент V..-рецептора. В базе данных NCBI найдена ее обновленная версия XP_024096521.1. Во-вторых, V2-рецептор не найден в протеоме M. domestica. Ручной поиск в базе NCBI также не выявил рецептор вазо-прессина данного подтипа у этого вида опоссумов, но найден белок, аннотированный как фрагмент V2-рецептора у D. virginiana. В-третьих, у R. norvegicus обнаружены две аминокислотные последовательности, аннотированные как V^-рецептор вазопрессина (NP_001276729.1 и NP_058901.3).

Наиболее сходными с белками-рецепторами семейства вазопрессина у всех изученных видов

NPSR1G_Hû№0 HPSR1_PO(190

NPSRl_Cart*

GNRHR HonOom

Рис. 2. Филограмма аминокислотных последовательностей рецепторов вазопрессина, окситоцина, нейропепти-да S и гонадотропин-рилизинг гормона у млекопитающих

оказались рецепторы нейропептида S (NPSR1) и гонадотропин-рилизинг гормона (GNRHR). Аминокислотные последовательности этих белков включены в построение филограмм наряду со всеми найденными последовательностями рецепторов вазопрессина и окситоцина. Обозначения и номера аминокислотных последовательностей белков, использованных для построения филограмм, приведены в табл. 2. Построение филограммы (рис. 2) показало, что все последовательности с индексом Score выше 200 четко разделились на четыре клады, соответствующие рецепторам вазопрессина V, V и V2-подтипов и рецептору окситоцина. Отдельные клады, сестринские по отношению к V2-рецепторам, сформировали рецепторы нейропептида S и гонадо-тропин-рилизинг гормона. Анализ опубликованной ранее последовательности кДНК «вазотоцинового» рецептора мыши (GenBank: AK033957) [15], а также предсказанной по ней структуры белка показал их соответствие нуклеотидной и аминокислотной последовательностям рецептора нейропептида S. На рис. 3 представлены результаты множественного выравнивания последовательностей рецепторов вазопресси-на, окситоцина и рецептора нейропептида S крысы. Показано, что по аминокислотной последователь-

ности рецепторы вазопрессина и окситоцина идентичны друг другу примерно на 50%: V^-рецептор имеет 54% гомологии с V^-рецептором, 51% - с окси-тоциновым и 46% - с Vj.-рецептором. Рецептор ней-ропептида S имеет меньшее сходство с рецепторами вазопрессина (с V1a - 33, с V1b - 33, с V2 - 30%) и ок-ситоцина (32%), он содержит радикальные замены в лигандсвязывающих участках (рис. З).

В транскриптомах 9 видов млекопитающих проведен поиск нуклеотидных последовательностей, сходных с транскриптом гена рецептора вазотоцина. Выявленные таким образом мРНК полностью соответствовали белкам, обнаруженным на предшествующем этапе исследования в протеоме. У R. norvegicus найдены две разные последовательности мРНК, кодирующие рецептор вазопрессина V^-подтипа: NM_017205.3 и NM_001289800.1. У M. domestica, как и при поиске по протеому, не найдена последовательность, соответствующая Vj.-рецептору. Наиболее близкими к нуклеотидной последовательности мРНК рецептора вазотоцина оказались мРНК рецепторов гонадотропин-рилизинг гормона и нейропептида S. Обозначения и номера нуклеотидных последовательностей, использованных для построения филограмм, приведены в табл. 2. На рис. 4 представлена фило-

Таблица 2. Идентификаторы нуклеотидных последовательностей мРНК и аминокислотных последовательностей белков-рецепторов млекопитающих, схожих с рецептором вазотоцина позвоночных

Вид Белок мРНК Обозначение на филограммах

Homo sapiens NP 000697.1 NM 000706.4 Avprla Homo

NP 000698.1 NM 000707.4 Avprlb Homo

NP 000907.2 NM 000916.3 Oxtr Homo

NP 000045.1 NM 000054.4 Avpr2 Homo

NP 997055.1 NM 207172.1 NpsrlA Homo

NP 001287864.1 NM 001300933.1 NpsrlG Homo

NP 997056.1 NM 207173.1 NpsrlB Homo

NP 000397.1 NM 000406.2 Gnrhr Homo

Pan troglodytes XP 016778615.1 XM 016923126.2 Avprla Pan

XP 525039.2 XM 525039.6 Avprlb Pan

XP 001144020.1 XM 001144020.5 Oxtr Pan

XP 001145732.2 XM 009439827.2 Avpr2 Pan

XP 024213409.1 XM 024357641.1 Npsrl Pan

XP 526608.1 XM 526608.5 Gnrhr Pan

Pongo abelii XP 002823515.2 XM 002823469.3 Avprla Pongo

XP 002813528.1 XM 002813482.3 Oxtr Pongo

XP 024089895.1 XM 024234127.1 Avprlb Pongo

XP 024096521.1 XM 024240753.1 Avpr2 Pongo

XP 002818110.2 XM 002818064.3 Npsrl Pongo

XP 024101999.1 XM 024246231.1 Gnrhr Pongo

Nomascus leucogenys XP 003252777.1* XM 003252729.3 Avprla Nleu

XP 003272998.1 XM 003272950.3 Avprlb Nleu

XP 012357682.1 XM 012502228.1 Oxtr Nleu

XP 003279348.1 XM 003279300.2 Avpr2 Nleu

XP 003279243.1 XM 003279195.2 Npsrl Nleu

XP 003268473.1 XM 003268425.1 Gnrhr Nleu

Canis lupus familiaris NP 001185587.1 NM 001198658.1 Avprla Canis

NP 001185588.1 NM 001198659.1 Oxtr Canis

XP 545695.2 XM 545695.3 Avprlb Canis

NP 001003177.1 NM 001003177.1 Avpr2 Canis

XP 022283280.1 XM 022427572.1 Npsrl Canis

NP 001003121.1 NM 001003121.1 Gnrhr Canis

Rattus norvegicus NP 444178.2 NM 053019.2 Avprla Rat

NP 058901.3 NM 017205.3 Avprlb Rat

NP 001276729.1 NM 001289800.1 Avprlb Rat

NP 037003.2 NM 012871.3 Oxtr Rat

NP 062009.1 NM 019136.1 Avpr2 Rat

NP 001100278.1 NM 001106808.1 Npsrl Rat

NP 112300.2 NM 031038.3 Gnrhr Rat

Mus musculus NP 058543.2 NM 016847.2 Avprla Mus

NP 036054.1 NM 011924.2 Avprlb Mus

NP 001074616.1 NM 001081147.1 Oxtr Mus

NP 062277.1 NM 019404.2 Avpr2 Mus

NP 783609.1 NM 175678.3 Npsrl Mus

NP 034453.1 NM 010323.2 Gnrhr Mus

Monodelphis domestica XP 001372716.1 XM 001372679.3 Avprla MonDom

XP 001372263.1 XM 001372226.2 Avprlb MonDom

XP 016279957.1 XM 016424471.1 Oxtr MonDom

XP 001365641.2 XM 001365604.4 Npsrl MonDom

XP 001362289.1 XM 001362252.2 Gnrhr MonDom

Ornithorhynchus anatinus XP_001520677.1 XM_001520627.2 Avprla OrnAnat

XP_007660695.1 XM_007662505.1 Oxtr OrnAnat

XP_007663815.1 XM_001520222.2 Avpr2 OrnAnat

XP_007658276.1* XM_007660086.1 Avprlb OrnAnat

XP_016082441.1* # XM_016226955.1 Npsrl OrnAnat

NP_001116830.1 NM_001123358.1 Gnrhr OrnAnat

Примечание: * - неполная последовательность, # - не обнаружена при автоматическом поиске, добавлена вручную из базы NCBI.

АУРБНа МБЕРКСЗСЮКЗУСЫЗБР№ДОРЬТТЕСЗЫСЗ-СЕДАЯ-----ЬСЕСОЗРЬСОУКЫЕЕЬАКЬЕ 54

АУРК1Ь ------------МЫЗЕРЗТСТАТРЗРССГЬ-РУР---------Ы-АТТРИЬвЬШЕЕЪАКУЕ 37

ОХТЯ ----------МЕСТРААЫИЗ'УЕЪОЬСЗСУ'-РРбЕЕ------СЫ-ЯТАСРРОРШАЬАЯУЕ 42

АУРИ2 ----------МЫЛ/Э----ТУЗАУРСЬЕЭ-РРЗЗР-----ЗЫЗЗОЕЕЬЬООРОРЫЛ/ЯАЕ 40

ЫРЭЯ — МРАЫЬТЕ---СЗЕНА№Т---УРМЪОЗЗРУАСТЕ1УТГТЕАЬЕАЕЕ1л1СЗЕУЗЗЕКТЕ0 52

АУРРИа АУРК1Ь ОХТИ АУРК2

ырзи

АУРБЯа

АУРР1Ь

ОХТИ

АУРИ2

ырэя

АУРИ1а АУРК1Ь ОХТИ АУРЯ2

ырги

1АУЬАУ1ЕУУАУЬ6ЫЗЗУЪЪАЪНЯТРК--КТЗКМНЪГ1КНЬЗЬА0ЬАУАЕЕ0УЬРС IС1Ь АТ УЬУЬ АТССКГЬАУЬЬТЬСКНСН - - ККЭ ИМНЪ ГУЪНЬАЬТ 01СТАЬ Е£)УЬ Р£ УАУЬСЫЬЕЬАЪЗбНАСТЬЬАЬКТТКН—КНЗКЬЕЕЕМКНЬЗТАОЪУУАУЕОУЬРС ЬАЬ Ь БТIРУАУАЬ ЭШЬУЬС АЬIЯЯСЯЯСИИАРМНVРIЙ НЬСЪАОЬАУАЬ ЕСУЬРС LITLWVLFVFTIVGNSVVLFSTWRR---КККЗШТРГУТОЬА1ТОЗРТСЬ:Ш11ДТ

ьсип 112

ЬЫЯБ 95

ЬЫИБ 100

ЬАИО 100

ИКР 109

ГУКЕКСРОИ! ГУРРСХЗЗБЫ ГРИРУСРБЫ ГОРРНСРОА!

ГСОРМАРОМ * *

СЯУУКНЪОУЕАМ СРАУКУЬОУЬЗМ

срьукуызуусм СЯАУКУЬОМУбМ

* * *..**.

РАЗАУМ1^УМТАОРУ]^СНР11КТЬС)С>РАРР-ЗР11М1 ГАЗТУМЬЬАМТЬОКУЬАУСНРЬКЗЬНОРЗОЗ-ТУРЫ РАЗТУЬЬЬЬМ31^СЪА1С0Р1^3ЬРЯЯТОК-Ь—АУ УАЗЗУМ1ЬАМТЬПКНИА1СКРМЬАУННСССАК^^МРРУ

УАБТУУЪУЗЪЗIЭРУНА1УУРМКГЬС)СЕКОА—КУЫ . * * . *.....* * * . * .

АТЭИУЬ ААРИЬЫ ЬСТИЬСС ЬУА1\1АР£

С1А1л13Ь *

Р1ЬЗТРСУР1РЗУ1Е1ЕУШ6ТКТООС1д[АТР1<2РИС А1ЬЗЬР£ УПРЗЬЯЕУ1—ОбЗСУЬОСИАОЕУРЗЮС

ЬУАЗАРСУН1РЗЬЯЕУА----ОСУРБСИАУРЮРИС

Ы,ЕЗЪРС1^1РАСЖОУС—ШЗСУРБСИАРРАЕРИС

РЪГЗХРТЬЫРСКРТЬЗ----ЫСЕУОСИАЫЛРООЗ^

+ * * * . . ***

ТРДУУТИМТЭСУБ РКАУ1Т№ГТМА1Е PKAYVTWITLAVY ИТРУМТХУАРЬУУ \ZAPV \7LPV 1УРУ УАРА Г1РЬ

* . * . . . *

171 154 157 160 167

231 212 213 218 223

АУРШа

АУРЯ1Ь

ОХТИ

АУРИ2

ырги

АУЬТАСУСЫСНЕ 1\7ЬААСУ6ЫЗРК ЬС1ААСОУЫРЕЕ

тпзу^илакт

ШРМтСКТАЗ-ЗРНЗКСБКОЗСЕАУСРРНКСЬ^ТРСУЗЗУКШЗР 2 90

1УКЫЪКУКТ0А-СКЕЕЯР6ИНТИ0КЗЗЗЗААТЕСЬРЗЯУ3313Т13К 271

ПЯОЫЪКЬКТАА-АААААЕСШ-----ААСбАбРААЬАЯУЗЗ'^КЫЗК 267

IHASLVPGPSERAGRRRRGRRTGSP--------------ЗЕСАНУЗА 264

IИIКБ КАНЕ ТVIЙ----------------N СБ БСЕЬС СБУШ6ЪI ЭК 267

АУРЯ1а АК1КТУКМТРУ1УЗАУ1ЪС

АУ'РЯ1Ь АКIРТ УКМТ 1 \/ЪАУ I АС

ОХТЯ АКтТУКМТШУЬАПУС

AVPR2 АМАКТУЯМТЬУ1У1УУУЪС

ЫРЭР АК1КА1КУ31У11ЬАР1СС

WAPFFIVQMW ЮАРРГЗУОМИ WTPFFFVQMW ЯАРЕГЬУОЫЯА

КЭРУРЬЕОМЬС . * . *

£ VI £ VI

ИЭЕЫЕШТОЗ 'ИОЕЫАРЫЕОЗ ТОУЫАРКЕАЗ ^АКШРЕАРЬЕР-ЫРЫЬЬРО-ТКЕ

£ VI

ЕМР31Т1ТАЬЪАЗ ТОТАРТ13МЫ,СК

---АРИАМЬЪАЗ

—РРЕУЬЬМЬЪАЗ RFУASVIIQNLPP

ьызсси 350

ьззссм 331

ьызсск 324

БЫЗСТИ 321

ЬЫЗАШ 326

•к -к -к

AVPRla PWIYMFFSGHLLQDCVQSFPCCHSMAQKFAKDDSDSMSRRQTSYSNNRSPTNSTGMWKDS 410

АУРР1Ь PWIYMGFNSRLLPRSLSHHACCTGSKPQVHRQLST--------ЗЭЬТЗРРТТЬЬТНАССЗ 383

ОХТР РИ1УМЬРтЬнЬРНЕЬУдРРГССЗАКУЬКСЗЯРСЕТЗУЗККЗЫЗЗТЕ^ЬЗЯКЗЗЗ.ОЯЗСЗО 384

АУРЯ2 РМ1УАЗрфзУЗЗЕЪ^ЗЬЬССАСЖНТТН316Р<20Е--ЗСАТАЗЗЗ----------ЪМКОТ 369

ЫРЭР РЫУС1РЭСЗЬСЗРСКУ0------ЯЗОБ------ЗРМТУРЕРЭЕР------НЕМ-СДЬБК 367

АУРР1а РКЗЗКЭ!----RFIPVST--------------------

АУРР1Ь РТЬРЬЗЬЫЬЗЬРАКРРРАСЗЬКВЬЕ<ЭУБ6ЕАТМЕТБ1Р

ОХТЙ РББА----------------------------------

АУРР2 РБ------------------------------------

ЫРЗК рЕрх----------------------------------

424 421 388 371 371

Рис. 3. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей рецепторов вазопрессина, окси-тоцина и нейропептида S крысы. Серой заливкой выделены трансмембранные домены 1-7, рамкой обведены участки связывания рецептора с лигандами

РгоЬ(регсеп1)

Oxtr

{

СМг_Ното С СМг_Рап СМг_1Ч1.яи СМг_Ропдо гТ—— Оч1г_Ми& 1— СМг Ра!

- 0*/г_0тАпа1 -СМгМопОот

Npsr1

Gnrhr

Avpr1b

■ Аург1ЬСзо\$ Аург /й^Ното Avpr1b_Pan

Avpfíb_Pongo А\/рг1Ь_Н1ы Ачрг

Avpг1b_R а( Avprtb_ Моп Оо т

|— т

Что .

Н1'

Avpr2

Avpr1a

— Аург1а_МопОот

- Лург1а_Сатз

Лург 1в_Ногтю Аург 7з_Рап

— ДцргАМШ

/крг2_Ното ХАург2_Раг> Агр/2_ Ропдо

I—Лкрг2_МиЗ [— Аург2_ЪъХ

I ЛДз8г/С_Ното

_П ■ .ю Ыр5НВ_\Ното №аг7 Рап

I- Ыряг!_Раг\ Мр$г1_Роп до л^игМЛеи

Л/р5Г/_Ми8

-Л0мг7_МопОот

- Л/ряг/_ОгпАпз1

(ЗпгЛгНото-Оийг_Рап

СпФг_Рог\до

Рис. 4. Филограмма нуклеотидных последовательностей мРНК рецепторов вазопрессина, окситоцина, нейро-пептида S и гонадотропин-рилизинг гормона у млекопитающих

р13 р12 р11 р11 q12 q13 Я21 q22 q23q24 q25q26 q27

м ■ш ШЛ

48 360 К 48 365 К 48 370 К 48 375 К 48 380 К 48 385 К

Avpr1b

48 390 К 48 395 К 48 400 К ЮО00909648

405

NP 058901.3

№ 001276729.1

Рис. 5. Дупликация гена V1Ь-рецептора в хромосоме 13 у крысы Rattus norvegicus (С^ 13 ^С_005112.4): 48 358 720 - 48 406 569)

грамма мРНК рецепторов семейства вазопрессина, которая в целом оказалась сходной с филограммой белков. В геноме крысы выявлено пять локусов, сходных с геном рецептора вазотоцина (табл. 3). Обнаружена дупликация гена V1b-рецептора на длинном плече хромосомы 13 (рис. 5). Белки, кодируемые этими генами, полностью идентичны.

Физиологические эффекты вазопрессина и окситоцина на почки крыс

В опытах на крысах показано, что эффект вазо-прессина на экскрецию ионов натрия, калия или ре-

абсорбцию осмотически свободной воды зависит от дозы гормона. Этот нонапептид вводили животным на фоне водной нагрузки, которая на время угнетала секрецию вазопрессина нейрогипофизом. Инъекция вазопрессина в дозе 0.005 нмоль на 100 г м.т. оказала антидиуретическое действие. Несмотря на водную нагрузку, моча животных была осмотически концентрированной (осмоляльность составила 546 ± 31 мОсм/кг Н20; 89 ± 14 мОсм/кг Н20 в группе без вазопрессина), происходила реабсорбция осмотически свободной воды в канальцах почек (рис. 6). Экскреция ионов калия была такой же, как в контро-

Таблица 3. Результаты поиска генов, сходных с нуклеотидной последовательностью рецептора вазотоцина, в геноме крысы Rattus norvegicus

Score Хромосома (нить) Начало - конец гена, п.н. ID транскрипта ID белка Длина белка, а.о.

Avpr1a (ID гена - ENSRN0G00000004400)

852.5 7(-) 67341080-67345308 ENSRNOT 00000005829 ENSRNOP 00000005829 424

LOC100909648 (ID гена - ENSRN0G00000049261)

500.8 13(-) 48390417-48400632 ENSRNOT 00000074204 ENSRNOP 00000067252 421

Avpr1b (ID гена - ENSRN0G00000048522)

500.5 13(+) 48367307-48378831 ENSRNOT 00000074512 ENSRNOP 00000064689 421

Oxtr (ID гена - ENSRN0G00000005806)

464.3 4(-) 144403358-144416116 ENSRNOT 00000007724 ENSRNOP 00000007724 388

Avpr2 (ID гена - ENSRN0G00000059862)

238.2 X(-) 156889410-156891213 ENSRNOT 00000091495 ENSRNOP 00000071931 371

Na K 120 100

.0 с

о

X

%

со

0

1 О S о; X

И

<и

а *

и X

m

80 60 40 20

60 —вода - калий -•-натрий

40

30 20 10

H2O 0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

-0.2

-0.4

-0.6

-0.8

-1.0

.0

д

о в й о

н

^

*0 2 О L.

ш X

и О . 0

IÏ

ю

р о

и ю

а

<и

Q-

0 0.001 0.01 0.1 1 Доза вазопрессина, нмоль/100 г м.т.

Рис. 6. Влияние внутримышечного введения различных доз вазопрессина на фоне водной нагрузки у крыс на экскрецию почками ионов натрия, калия и реаб-сорбцию осмотически свободной воды. * - значимость отличий (p < 0.05) от контроля (0 нмоль/100 г м.т.)

■ Na

г120

0

0

>100

80

ь л о м к

м60

в о н о и я

и ц

е р

к с к

m

40

20

K 60 50 40 30 20 10

вода

калий

натрий

H2O

0.8

0.4

0.0

-0.4

-0.8

-1.2

-1.6

-2.0

ы д

о в й о

н

^

в г с0 . 0

ос/ч

II

б р

о с б а е Р

0 0.001 0.01 0.1 1 Доза окситоцина, нмоль/100 г м.т.

Рис. 7. Влияние внутримышечного введения различных доз окситоцина на фоне водной нагрузки у крыс на экскрецию почками ионов натрия, калия и реаб-сорбцию осмотически свободной воды. * - значимость отличий (p < 0.05) от контроля (0 нмоль/100 г м.т.)

0

0

ле, а выведение ионов натрия уменьшилось вдвое, т.е. вазопрессин в этой дозе оказал антинатрийуретиче-ское действие (рис. 6). Повышение дозы вазопрессина в 3 раза (до 0.015 нмоль на 100 г м.т.) привело к росту реабсорбции осмотически свободной воды, а выведение натрия было таким же, как в контрольной группе. Действие гормона в этой дозе вызывало усиление экскреции ионов калия на 130% (рис. 6), т.е. приводило к селективному калийурезу. При повышении дозы до 0.15 нмоль на 100 г м.т. вазопрессин не только усиливал реабсорбцию осмотически свободной воды,

но и повышал выведение одновалентных катионов. При этом наблюдался рост экскреции ионов калия и натрия с преобладанием выведения ионов натрия (рис. 6).

Введение в таких же физиологических условиях окситоцина (0.005 и 0.015 нмоль на 100 г м.т.) привело к усилению диуреза, селективному натрийурезу и уменьшению реабсорбции осмотически свободной воды (рис. 7). Экскреция ионов калия не отличалась от экскреции в контроле. Повышение дозы оксито-цина до 0.15 нмоль на 100 г м.т. привело к антидиу-

ретическому эффекту, росту реабсорбции осмотически свободной воды, наряду с ростом экскреции ионов натрия отмечался подъем выведения ионов калия. Экскреция ионов натрия при действии окси-тоцина была ниже, чем после введения вазопрессина в той же дозе (рис. 6, 7).

Селективный V^-агонист воспроизвел натрий-уретический эффект вазопрессина, при этом экскреция натрия усилилась в значительно большей степени, чем при действии гормона (рис. 8). Блокада V^-рецепторов полностью препятствовала развитию индуцированного вазопрессином натрийуреза; окси-тоциновый антагонист не вызывал такого эффекта (рис. 8). При действии окситоцина и агониста его рецепторов в отличие от V^-агониста усиление экскреции натрия сопровождалось усилением образования осмотически свободной воды (рис. 9).

ОБСУЖДЕНИЕ

В крупноклеточных нейронах гипоталамуса синтезируются различные нонапептиды, которые се-кретируются в кровь в нейрогипофизе. У большинства млекопитающих это вазопрессин и окситоцин, в то время как у позвоночных других классов - ва-зотоцин и мезотоцин [4, 21]. Эффекты нонапептидов опосредуются рецепторами, входящими в семейство мембранных G-связанных рецепторов. Согласно современным представлениям, у позвоночных произошли три последовательных дупликации генов рецепторов вазопрессин- и окситоцин-подобных пептидов. Данные, полученные при изучении кругло-ротых и хрящевых рыб, позволяют предположить, что у челюстноротых позвоночных было как минимум шесть разных генов, кодирующих рецепторы гормонов семейства вазопрессина: пять подтипов вазопрессиновых (вазотоциновых) рецепторов (V1a,

V

1 V2a, V2b, V2c) и один подтип рецептора окситоцина

(у разных животных он называется окситоциновым, изотоциновым или мезотоциновым в зависимости от гормона окситоцинового ряда) [22]. V2b-рецептор пока описан только у рыб, V2c-рецептор обнаружен у всех позвоночных, кроме млекопитающих (у сумчатых в виде псевдогена). Передача сигнала рецепторами данного семейства происходит при участии фосфолипазы С, инозитолтрифосфата и кальция. Исключением является V2a-рецептор, который активирует аденилатциклазу и стимулирует образование сАМР в качестве вторичного посредника.

м. 250 г

= 200

> 150 л о

км100

м

50

и ц

е р

к с к

m

ВН

O-ант + V^-ант + V^-аг + ВН + вазопрессин ВН

Рис. 8. Сопоставление действия вазопрессина и V1a-агониста (V^-аг) в дозе 0.15 нмоль/100 г м.т. на экскрецию натрия и эффект антагонистов V^-рецепторов (V^-ант) и рецепторов окситоцина (O-ант) на натрий-уретическое действие вазопрессина у крыс, получивших водную нагрузку (ВН). Значимость отличий (p < 0.05): * - от ВН, $ - от ВН + вазопрессин

0

25

20

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

0 0

U

Рис. 9. Сопоставление действия агонистов V^-рецепторов (V^-аг) и рецепторов окси-тоцина (O-аг) в дозе 0.015 нмоль/100 г м.т. на фоне водной нагрузки (ВН) на экскрецию натрия почками и клиренс осмотически свободной воды (CH2O) у крыс. * - значимость отличий (p < 0.05) от ВН

O-аг

V -аг

O-аг

V -аг

+ ВН

+ ВН

5

В поисках ответа на вопрос о молекулярных механизмах полифункциональности вазопрессина и окси-тоцина проведен поиск их рецепторов у млекопитающих, сходных по аминокислотной и нуклеотидной последовательности с рецептором вазотоцина других позвоночных. Данные настоящей работы подтвердили, что в геноме крыс имеются гены трех подтипов V-рецепторов - V , V , и V,,, и один ген рецептора окситоцина. Следующим, наиболее близким к ним по структуре белком является рецептор нейропепти-да S. Учитывая низкую степень гомологии с другими рецепторами вазопрессина и окситоцина, особенно лигандсвязывающих участков, маловероятным представляется его участие в реализации эффектов вазо-прессина и окситоцина в почке, хотя это требует отдельной экспериментальной проверки. Выявленные в данной работе различия в действии возрастающих доз вазопрессина (рис. 6), а также во влиянии вазотоцина и его аналогов [12] на экскрецию одновалентных катионов и реабсорбцию воды в почке крыс могут быть связаны с различиями в спектрах активации трех существующих подтипов V-рецепторов. Это предположение подтверждается результатами нашей работы, а также более ранними исследованиями с применением агонистов и антагонистов V-рецепторов [12]. Наиболее хорошо изучен механизм антидиуретического и антинатрийуретическо-го эффектов вазопрессина, направленных на обеспечение осмотического концентрирования мочи. V2-рецепторы активируются уже при низких концентрациях вазопрессина в крови, повышают проницаемость собирательных трубок для воды и активность транспортеров натрия в дистальных отделах нефрона [5, 23]. По-видимому, при повышении концентрации вазопрессина наряду с V2-рецепторами активируются V - и V1a-рецепторы и изменяется экскреция ионов натрия и калия. Ранее было показано, что агонист V1b-рецепторов усиливает экскрецию калия [24], а стимуляция V1a-рецепторов угнетает реабсорбцию натрия в толстом восходящем отделе петли Генле [10, 12, 13, 25] и приводит к натрийурезу. Нами показано, что натрийуретическое действие ва-зопрессина полностью устраняется антагонистом V-рецепторов. V1a-агонист, лишенный V2-активности, в значительно большей степени усиливает экскрецию натрия, чем вазопрессин, активирующий все подтипы V-рецепторов. Соотношение вовлечения подтипов V-рецепторов в физиологический ответ почки на введение вазопрессина в разных дозах может зависеть от различий в плотности рецепторов в мембранах канальцевых клеток нефронов и от разного сродства рецепторов к гормону. Различными методами показано присутствие в почке всех подтипов рецепторов вазопрессина и окситоцина (AVPR2

> AVPR1A > ОXTR > AVPR1B) [26], экспрессия V2-рецептора значительно превышает экспрессию всех остальных подтипов рецепторов этого семейства

[27]. Для активации V1a-рецепторов у крысы требуется в 100 раз более высокая концентрация вазопрессина, чем для передачи сигнала через V2-рецепторы

[28].

Более сложным представляется обсуждение механизма действия окситоцина в почке. В разных дозах этот нонапептид вызывает противоположные эффекты (рис. 7): в низкой дозе увеличивает выведение осмотически свободной воды и ионов натрия, а в высокой - усиливает реабсорбцию осмотически свободной воды и экскрецию ионов калия при повышении натрийуретического эффекта. Анализ про-теома, транскриптома и генома крысы не выявил подтипов рецептора окситоцина, поэтому механизм физиологического эффекта следует объяснять, исходя из существования рецептора одного типа. Согласно анализу мРНК, кодирующей рецептор окситоцина [27, 29], этот рецептор наиболее представлен в проксимальном отделе нефрона. Известно, что снижение реабсорбции натрия в проксимальном канальце создает условия для увеличения клиренса осмотически свободной воды [11]. Этот эффект наблюдали при изучении механизма действия ингибиторов карбоангидразы [30] и глюкагоноподоб-ного пептида-1 в почке [10]. Выполненные ранее эксперименты показали, что окситоцин [11] вызывает уменьшение реабсорбции жидкости в проксимальном канальце, вследствие чего больший объем жидкости поступает в последующие отделы нефро-на. Так как на фоне водной нагрузки прекращается секреция вазопрессина нейрогипофизом, увеличение под действием окситоцина объема жидкости, поступающей в дистальный сегмент нефрона, способствует росту клиренса осмотически свободной воды. Нами показано, что усиление экскреции натрия и воды под действием окситоцина воспроизводится при введении селективного агониста рецепторов окситоцина. Кроме того, полученные данные указывают на различия в механизмах натрийуреза, вызванного окситоцином и вазопрессином - рост экскреции натрия обусловлен снижением реабсорб-ции натрия в проксимальном и дистальном отделах нефрона при активации рецепторов окситоцина и V1a-рецепторов соответственно. Эффекты, наблюдающиеся при введении высокой дозы окситоци-на (0.15 нмоль/100 г м.т.), аналогичны описанным для вазопрессина и, вероятно, связаны с действием нонапептида на рецепторы вазопрессина. В отличие от окситоцина селективный агонист рецепторов ок-ситоцина в этой дозе не оказывает антидиуретического действия.

ВЫВОДЫ

1. Анализ аминокислотных и нуклеотидных последовательностей в протеомах и транскриптомах 9 видов млекопитающих выявил три подтипа рецепторов вазопрессина и один рецептор окситоцина.

2. При исследовании генома крысы методами биоинформатики выявлены гены, кодирующие четыре подтипа рецепторов к нонапептидам семейства ва-зопрессина и окситоцина (Avprla, Avprlb, Avpr2, Oxtr).

3. В экспериментах на ненаркотизированных крысах, получавших водную нагрузку в объеме 2 мл на 100 г м.т., установлены три эффекта вазопрессина в почке: 1) увеличение реабсорбции осмотически свободной воды, 2) возрастание экскреции ионов калия, 3) снижение реабсорбции ионов натрия. Обосновано предположение об обусловленности этих эффектов

селективной стимуляцией V1a-, V - и V..-рецепторов в почке соответственно.

4. В экспериментах на ненаркотизированных крысах с водной нагрузкой показаны два эффекта ок-ситоцина в почке: 1) снижение реабсорбции воды, 2) усиление экскреции натрия. Обсуждены возможные физиологические механизмы их реализации при участии одного подтипа рецептора окситоцина.

5. В зависимости от действующей концентрации гормонов нейрогипофиза изменяется спектр активируемых подтипов рецепторов и преобладающий эффект на функции почек, что обеспечивает точную регуляцию водно-солевого гомеостаза. •

Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда (грант № 18-15-00358).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Stein D.J. // CNS Spectr. 2009. V. 14. P. 602-606.

2. Bankir L., Bichet D.G., Morgenthaler N.G. // J. Intern. Med.

2017. V. 282. P. 284-297.

3. Wallis M. // Gen. Comp. Endocrinol. 2012. V. 179. P. 313-318.

4. Acher R., Chauvet J. // Front. Neuroendocrinol. 1995. V. 16. P. 237-289.

5. Kortenoeven M.L., Pedersen N.B., Rosenbaek L.L., Fenton R.A. // Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2015. V. 309. P. F280-F299.

6. Arrowsmith S., Wray S. // J. Neuroendocrinol. 2014. V. 26. № 6. P. 356-369.

7. Crowley W.R. // Compr. Physiol. 2015. V. 5. P. 255-291.

8. Verbalis J.G., Mangione M.P., Stricker E.M. // Endocrinology. 1991. V. 128. P. 1317-1322.

9. Musabayane C.T., Forsling M.L., Balment R.J. // Ren. Fail. 1997. V. 19. P. 23-32.

10. Kutina A.V., Golosova D.V., Marina A.S., Shakhmatova E.I., Natochin Y.V. // J. Neuroendocrinol. 2016. V. 28. № 4. P. 1-8.

11. Наточин Ю.В., Голосова Д.В., Шахматова Е.И. // Докл. АН.

2018. Т. 479. С. 712-715.

12. Kutina A.V., Marina A.S., Shakhmatova E.I., Natochin Yu.V. // Regul. Pept. 2013. V. 185. P. 57-64.

13. Karavashkina T.A., Kutina A.V., Shakhmatova E.I., Natochin Yu.V. // Gen. Comp. Endocrinol. 2011. V. 170. P. 460-467.

14. Pare P., Paixao-Cortes V.R., Tovo-Rodrigues L., Vargas-Pinilla P., Viscardi L.H., Salzano F.M., Henkes L.E., Bortolini M.C. // Genet. Mol. Biol. 2016. V. 39. P. 646-657.

15. Usui M., Aoshima H., Yamamoto Y., Luziga C., Mamba K. // J. Vet. Med. Sci. 2006. V. 68. P. 655-661.

16. Wheeler T.J., Eddy S.R. // Bioinformatics. 2013. V. 29. P.

2487-2489.

17. Pearson W.R. // Curr. Protoc. Bioinformatics. 2013. V. 43. P. 3.5.1-3.5.9.

18. Nakamura T., Yamada K.D., Tomii K., Katoh K. // Bioinformatics. 2018. V. 34. P. 2490-2492.

19. Katoh K., Standley D.M. // Mol. Biol. Evol. 2013. V. 30. P. 772-780.

20. Ronquist F., Huelsenbeck J.P. // Bioinformatics. 2003. V. 19. P. 1572-1574.

21. Warne J.M., Harding K.E., Balment R.J. // Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 2002. V. 132. P. 231-237.

22. Yamaguchi Y., Kaiya H., Konno N., Iwata E., Miyazato M., Uchiyama M., Bell J.D., Toop T., Donald J. A., Brenner S., et al. // Gen. Comp. Endocrinol. 2012. V. 178. P. 519-528.

23. Bachmann S., Mutig K. // Pflugers Arch. 2017. V. 469. № 7-8. P. 889-897.

24. Кутина А.В., Марина А.С., Наточин Ю.В. // ДАН. 2014. Т. 459. № 6. С. 762-764.

25. Perucca J., Bichet D.G., Bardoux P., Bouby N., Bankir L. // J. Am. Soc. Nephrol. 2008. V. 19. P. 1721-1731.

26. Yu Y., Fuscoe J.C., Zhao C., Guo C., Jia M., Qing T., Bannon D.I., Lancashire L., Bao W., Du T., et al. // Nat. Commun. 2014. V. 5. P. 3230.

27. Lee J.W., Chou C.L., Knepper M.A. // J. Am. Soc. Nephrol. 2015. V. 26. P. 2669-2677.

28. Bankir L. // Cardiovasc. Res. 2001. V. 51. P. 372-390.

29. Ostrowski N.L., Lolait S.J. // Adv. Exp. Med. Biol. 1995. V. 395. P. 329-340.

30. Rosin J., Katz M.A., Rector F.C. Jr., Seldin D.W. // Am. J. Physiol. 1970. V. 219. P. 1731-1738.