CC BY
22
Turczaninowia 18 (1): 99-109 (2015) DOI: 10.14258/turczaninowia.18.1.11 www.ssbg.asu.ru/turczaninowia.php
I ISSN 1560-7259 (print edition)
TURCZANINOWIA
I ISSN 1560-7267 (online edition)
УДК 582.736:581.142:57.042
Подходы к сохранению генофонда лекарственного растения Oxytropis lanata (Pall.) DC. (Fabaceae)
Approaches to gene pool conservation of medicinal plant Oxytropis lanata (Pall.) DC. (Fabaceae)
А.Б. Холина, Н.М. Воронкова, О.В. Наконечная, О.Г. Корень A.B. Kholina, N.M. Voronkova, O.V. Nakonechaya, O.G. Koren'
Биолого-почвенный институт ДВО РАН, проспект 100 лет Владивостоку, 159, Владивосток, 690022, Россия Institute of Biology and Soil Science FEB RAS, Prospect 100 let Vladivostoku, 159, Vladivostok, 690022, Russia
E-mail: [email protected]
Ключевые слова: Oxytropis lanata; Fabaceae; аллозимы; криоконсервация семян. Key words: Oxytropis lanata; Fabaceae; allozymes; seed cryopreservation.
Аннотация. С целью сохранения генофонда лекарственного растения Oxytropis lanata (Pall.) DC. проведен анализ аллозимного полиморфизма и выявлены надежные и информативные маркерные ферментные системы для данного вида; также мы изучили реакцию семян на глубокое замораживание в жидком азоте (-196 °С). Популяция обладает средним уровнем полиморфизма (P95 = 41,2 %, P99 = 52,9 %, A = 1,58, Ho = 0,158, He = 0,171), в целом характерным для травянистых бобовых, и может служить источником материала для сохранения генофонда вида. Глубокое замораживание не привело к гибели семян; отмечено стимулирующее действие ультранизких температур, выраженное как ускорение прорастания и резкое повышение всхожести (98,6 ± 2,3 %) по сравнению с контролем (12,0 ± 3,5 %), связанное с преодолением физического покоя. Не отмечено отклонений в развитии проростков из семян, прошедших криоконсерва-цию.
Summary. In order to preserve the gene pool of medicinal plant Oxytropis lanata (Pall.) DC. we analyzed allozyme polymorphism and identified reliable and informative marker enzyme systems of this species; also we studied the response of seeds to deep freezing in liquid nitrogen (-196 °С). Population has an average level of polymorphism (P95 = 41,2 %, P99 = 52,9 %, A = 1,58, Ho = 0,158, He = 0,171) in general typical for herbaceous legumes, and can serve as a source of material for gene pool conservation of the species. Deep freezing has not
led to the death of the seeds; it was marked stimulatory effect of ultralow temperatures, expressed as an acceleration of germination and sharp increase of germinability (98,6 ± 2,3 %) compared to the control (12,0 ± 3,5 %) that is associated with overcoming physical dormancy. There were no abnormalities in the development of seedlings from seeds passed cryopreservation.
Введение
Травянистый многолетник остролодочник шерстистый Oxytropis lanata (Pall.) DC. относится к секции Baicalia подрода Oxytropis рода Oxytropis семейства Fabaceae (Polozhij, 1994), 2n = 16 (Probatova et al., 2011). Область распространения O. lanata довольно ограничена -это степной южновосточно-сибирский вид с дизъюнктивным ареалом, который охватывает в основном Байкальскую Сибирь и Северную Монголию (Polozhij, 1994; Yurtsev, 1964). O. lanata характеризуется узкой экологической приуроченностью к открытым пескам - псаммофит, гелиофит; обитает на берегах рек и озер (Polozhij, 1994; Yurtsev, 1964). Благодаря строению корневой системы, растения остролодочника способствуют укреплению песчаных берегов. Симбиоз растений остролодочника с клубеньковыми азотфиксирующими бактериями приводит к обо-
Поступило в редакцию 05.05.2014 Принято к публикации 13.01.2015
Submitted 05.05.2014 Accepted 13.01.2015
гащению почвы азотом, что также делает возможным поселение других растений. О. ¡апМа является пионером подвижных дюнных песков, ценозообразователем (Kasyanova et а1., 2007), и имеет большое значение для сохранения биоразнообразия. Псаммофитные остролодочниковые фитоценозы служат местом обитания многих реликтовых и эндемичных видов, существование которых напрямую зависит от состояния доминантного вида (Boikov, Sutkin, 2012; Kasyanova, Azovskiy, 2011). Очевидна привлекательность О. !апа(а как декоративного растения с длительным периодом цветения.
Однако наиболее важными и значимыми являются лекарственные свойства О. !апа(а. В тибетской медицине используют все части растения О. !апа(а в качестве кровоостанавливающего, жаропонижающего, диуретического, сердечно-сосудистого средства (Blinova, Sakanyan, 1986). В эксперименте настой, отвар, экстракт корней проявляют депримирующую, антигипок-сическую и обезболивающую активность (Копо-pleva, 1989). Для О. lanata установлено наличие флавоноидов, алкалоидов, кумаринов, фенол-карбоновых кислот, сапонина и галактоманнана (Blinova, Iriste, 1972; Ы et а1., 2012; 01епшко^ Rokhin, 2010; Povydysh et а1., 2010), что указывает на перспективность вида как ресурса биологически активных веществ.
Изменение ландшафтов, как природное, так и антропогенное, а также возросшее использование лекарственных растений в медицине наносят значительный ущерб природным популяциям этих видов. Поэтому все большее значение приобретают исследования по сохранению генофонда ценных видов растений. Наиболее надежным методом сохранения генетических растительных ресурсов в генных банках является замораживание семян в жидком азоте при температуре -196 °С (криоконсервация) (Engelmann, 2004; Stanwood, 1985; Tikhonova, 1999). Однако перед применением этого метода требуется экспериментальная проверка реакции семян на сверхглубокое замораживание. Прорастание семян дикорастущих растений, в отличие от культурных, часто затруднено из-за наличия глубокого покоя, поэтому при оценке жизнеспособности семян требуется применение определенных способов его преодоления (Репсе, 1991; Salomao, 2002; Stanwood, 1985). Кроме того, при мобилизации геноресурсов вида рекомендуется оценка внутривидового разнообразия с использованием молекулярных маркеров (Яао, 2004).
Цель настоящей работы - разработать подходы к сохранению генофонда ценного лекарственного растения О. lanata: выявить молекулярные маркеры для определения уровня генетического разнообразия, исследовать жизнеспособность и криоустойчивость семян О. lanata и оценить влияние глубокого замораживания семян на развитие растений на ранних этапах онтогенеза. Наша работа является продолжением собственных исследований по криоконсервации семян дикорастущих растений (Voronkova et а1., 2008; КЪоНпа, Voronkova, 2008, 2012; Voronkova, КЬо-Нпа, 2010).
Материалы и методы
Материалом для анализа изоферментов служили 4-недельные проростки из семян О. lanata, собранные на берегу оз. Байкал в окрестности с. Горячинск (Республика Бурятия, Прибайкальский район). Экстракцию и электрофорез проводили, как описано ранее (КЪоНпа et а1., 2013), гистохимическое окрашивание зон ферментной активности выполняли по стандартным методикам (Goncharenko et а1., 1989). Исследованные ферментные системы представлены в табл. 1. Локусы были пронумерованы в порядке уменьшения электрофоретической подвижности контролируемых ими зон. Аллели обозначали в соответствии с электрофоретической подвижностью по отношению к наиболее распространенному варианту, подвижность которого принимается за 1,00. Показатели полиморфности (Р), среднего числа аллелей на локус (А), средней наблюдаемой (Но) и ожидаемой (Не) гетерозигот-ности рассчитывали общепринятыми методами (Goncharenko et а1., 1989; Zhivotovskiy, 1991).
Остролодочники являются облигатными на-секомоопыляемыми перекрестниками, размножаются семенами. Массу семян определяли взвешиванием 3 проб по 100 шт., размеры - измерением 25 шт. в каждом образце. Влажность воздушно-сухих семян определяли высушиванием пробы из 50 семян при 105 °С до постоянного веса в трехкратной повторности. Проращивание семян во всех вариантах опыта проводили в чашках Петри при температуре 23-25 °С в условиях естественного освещения (днем на свету, ночью в темноте) по 50 шт. в трехкратной по-вторности. Жизнеспособность семян оценивали по лабораторной всхожести, которую определяли ежедневно. Ее рассчитывали как отношение числа проросших семян к числу первоначально заложенных на проращивание и выражали в
Таблица 1
Исследованные ферментные системы и количество полиморфных локусов и аллелей,
выявленных для Oxytropis ¡апМа
Фермент Сокращение К.Ф.* Интерпретируемые локусы Полиморфные локусы Аллели
Аконитаза ACO 4.2.1.3 1 O 1
Флюоресцентная эстераза FE 3.1.1.2 3 2 6
Глутаматдегидрогеназа GDH 1.4.1.2 1 O 1
Глюкозофосфатизомераза GPI 5.3.1.9 2 1 3
Глутаматпируваттрансаминаза GPT 2.6.1.2 1 1 2
Изоцитратдегидрогеназа IDH 1.1.1.42 1 1 2
Лейцинаминопептидаза LAP 3.4.11.1 1 1 3
Малатдегидрогеназа MDH 1.1.1.37 3 1 4
Малик-энзим ME 1.1.1.40 1 O 1
6-фосфоглюконатдегидрогеназа 6-PGD 1.1.1.44 1 O 1
Фосфоглюкомутаза PGM 2.7.5.1 2 2 4
Всего 11 17 9 28
Примеч.: * - кодовый номер фермента (шифр) согласно изданию «Enzyme Nomenclature [Номенклатура ферментов]» (1979).
процентах. Для анализа динамики прорастания учитывали начало прорастания и определяли показатели Т0 - число суток до начала прорастания и Т50 - число суток, в течение которых всхожесть достигала 50 % от итоговой всхожести. Глубокое замораживание проводили путем прямого погружения семян, завернутых в алюминиевую фольгу, в жидкий азот (-196 °С), где они хранились в течение 100 сут.; затем деконсервированные семена отогревали 2 ч. при комнатной температуре и ставили на проращивание одновременно с контрольными семенами, которые хранились в лаборатории. Семена O. lanata обладают физическим типом покоя, поэтому для изучения способов его преодоления проводили опыт по обработке семян концентрированной серной кислотой в течение 20 мин. с последующим промыванием в проточной воде.
Проросшие семена после криохранения и в контроле высаживали в контейнеры с почвой. В данном опыте в контроле использовали проростки из семян после скарификации, так как для них характерно дружное и одновременное прорастание. Сравнительный анализ морфологических признаков проростков проводили на 4 этапах развития: на стадии семядольных листьев (I), стадии 2-3 настоящих листьев (II), стадии 2-3 пар листьев (III) и для двухмесячных проростков (IV). На каждом этапе на 20 проростках измеряли длину корня и высоту проростка. Достоверность разницы между вариантами опыта и контролем определяли по критерию Стьюдента
(t): на 95%-ном доверительном уровне при n = 3 (в опытах по прорастанию) разница достоверна при t > 2,78, при n = 20 (сравнение проростков) разница достоверна при t > 2,01. На I, III и IV этапе определяли сырой и сухой вес объединенной пробы из 20 проростков (табл. 5).
Результаты и обсуждение
Описание ферментных систем и показатели полиморфизма
По результатам анализа 11 ферментных систем было обнаружено 28 аллельных вариантов 17 структурных локусов и выявлен полиморфизм по 9 локусам (Fe-2, Fe-3, Gpi-2, Gpt, Idh-2, Lap, Mdh-2, Pgm-1, Pgm-2) (табл. 1, рис. 1). Далее приведено описание фенотипов и генетическая интерпретация для исследованных ферментных систем, а также литературные данные относительно генетического контроля некоторых ферментов у изученных ранее видов Oxytropis, представителей секции Ba-icalia - O. chankaensis (Kholina et al., 2004), секции Orobia - O. retusa (Kholina et al., 2000), O. erecta, O. evenorum и O. ochotensis (Kholina et al., 2013), секции Arctobia - O. kamtschatica, O. exserta и O. revoluta (Kholina et al., 2013). Полные названия ферментных систем приведены в табл. 1.
ACO выявляется в виде одной инвариантной зоны, под контролем мономорфного гена Aco. У O. kamtschatica АСО также контролиру-
Фермент ACO ME MDH 6-PGD GPI GDH
локус Acó Me Mdh-1 Mdh-2 Mdh-3 6-Pgd-2 Gpi-1 Gpi Gdh-2
аллели 1.00 1.00 1.00 1.15 1.00 1 00 1.00 1.00 1.00 0.92 1.00
j - — _ — — _
— — —
С>ep мент П PGM LAP GPT IDH
локус Fe-2 Fe 3 Fe-4 Pgm-1 Pgm-2 Lap Gpt Idh-2
аллели: 1.05 1,00 0.95 1,20 1.00 1.00 1.00 0.95 1.00 0.95 1,05 1,00 0.95 1.10 1.00 1.20 1.00
- ~~ — — — — —
— —
Рис. 1. Схематическое изображение электрофоретических вариантов ферментов в листьях Oxytropis lanata.
ется мономорфным локусом, у O. chankaensis и O. ochotensis - слабополиморфным локусом с двумя аллелями, у O. erecta, O. evenorum, O. exserta и O. revoluta - полиморфным локусом с 2 аллелями. FE выявляется 4 зонами активности, наиболее быстрая окрашивается нестабильно, в анализ не включена, менее подвижные зоны предположительно кодируются 3 локусами: полиморфным Fe-2 с тремя аллелями, каждый из которых выявляется двойными фракциями (рис. 1), полиморфным Fe-3 с двумя аллелями и мономорфным Fe-4. Полиморфный Fe-2 с тремя аллелями известен для O. revoluta и O. erecta; у последнего вида, а также у O. kamtschatica и O. exserta обнаружен полиморфный локус Fe-3, у O. chankaensis выявлен полиморфный Fe-2 с 4 ал -лелями и мономорфный локус Fe-3; мономорф-ный локус Fe-4 обнаружен у O. erecta. GDH проявляется инвариантной зоной, контролируемой мономорфным локусом, который по подвижности совпадает с локусом Gdh-2, известным для изученных ранее остролодочников. GPI представлена 2 зонами активности, более подвижная -под контролем мономорфного локуса Gpi-1, менее подвижная - под контролем полиморфного локуса Gpi-2 с 2 аллелями. У изученных ранее видов Oxytropis GPI также находится под контролем двух локусов, мономорфного Gpi-1 и полиморфного Gpi-2 с 2-4 аллелями; исключение составляет O. revoluta, у которого локус Gpi-2
мономорфный. GPT выявляется одной зоной активности, под контролем полиморфного локуса Gpt с 2 аллелями. Для O. chankaensis и O. retusa известно наличие полиморфного локуса Gpt-2 с 2 аллелями. IDH представлена 2 зонами, быстрая зона окрашивается слабо и не включена в анализ, медленная контролируется полиморфным локусом с двумя аллелями Idh-2. Аллельные варианты локуса Idh-2 соответствуют по подвижности известным ранее для O. chankaensis, O. kamtschatica, O. revoluta и O. exserta, при этом быстрый аллель у всех изученных видов встречается с низкой частотой. Для O. exserta отмечено присутствие третьего, медленного аллеля в этом локусе, у O. erecta отмечены основной и медленный аллель, а у O. evenorum и O. ochotensis локус Idh-2 мономорфный. LAP вы -является в виде высокоактивной полиморфной зоны, контролируемой локусом Lap с 3 аллелями. У исследованных видов Oxytropis LAP также контролируется одним геном: у O. chankaensis, O. erecta, O. kamtschatica, O. ochotensis, O. revoluta - полиморфным локусом с 3 аллелями, у O. evenorum - полиморфным с 2 аллелями, у O. exserta и O. retusa локус Lap мономорфный. MDH представлен 3 зонами активности - мономорфным локусом Mdh-1, аллель которого выявляется тройными фракциями, полиморфным локусом Mdh-2 с 2 аллелями и мономорфным локусом Mdh-3 (рис. 1). Для 3 видов Oxytropis сек-
ции Arctobia характерен трехлокусный контроль MDH, а у видов секции Orobia и O. chankaensis присутствует малоактивная медленная зона под контролем мономорфного локуса Mdh-4. У большинства изученных видов аллели локуса Mdh-1 имеют трехполосный фенотип. МЕ выявляется одной зоной активности, под контролем гена Ме, как и других видов остролодочников. 6-PGD представлена 2 зонами активности, быстрая зона окрашивается нестабильно и не включена в анализ, медленная контролируется мономорфным локусом 6-Pgd-2. Мономорфный локус 6-Pgd-2 обнаружен у O. chankaensis, O. evenorum и O. exserta; у O. erecta, O. kamtschatica, O. ochotensis, O. revoluta 6-Pgd-2 - полиморфный локус с 2 аллелями.
PGM выявляется в виде 2 зон активности, под контролем двух полиморфных двухаллельных локусов Pgm-1 и Pgm-2, как и у O. chankaensis; у представителей секции Arctobia - полиморфным является только Pgm-1, Pgm-2 - мономорфный, при этом отмечено наличие еще одного мономорфного локуса Pgm-3 (Kholina et al., 2013). Исследованные локусы могут быть использованы в качестве генных маркеров для определения уровня аллозимного полиморфизма O. lanata.
Большинство полиморфных локусов имеют по 2 аллеля (табл. 2), у Fe-2 и Lap выявлено по 3 аллеля. Обнаружено 2 редких аллеля (с
частотой менее 0,05) - Idh-21,20 и Pgm-20,95. Четыре локуса (Fe-2, Fe-3, Gpt и Pgm-1) являются высокополиморфными (наблюдаемая гетерози-готность выше 35 %); локусы Gpi-2, Lap иMdh-2 характеризуются средним уровнем изменчивости (наблюдаемая гетерозиготность не превышает 35 %, но не менее 5 %); к слабополиморфным локусам, с минимальными значениями наблюдаемой гетерозиготности, относятся Idh-2 и Pgm-2 (табл. 2). На основе аллельных частот 17 локусов были рассчитаны основные показатели генетического разнообразия. Для исследованной популяции O. lanata выявлен средний уровень полиморфизма (P95 = 41,2 %, Pgg = 52,9 %, A = 1,58, Ho = 0,158, He = 0,171), сопоставимый с установленным ранее для растений с половым типом репродукции и небольшим размером ареала (P = 55,8, Н = 0,155) и травянистых бобовых (P = 53,0, Не = 0,160) (Hamrick, Godt, 1996). Показатель полиморфности O. lanata близок к таковому для представителя секции Baicalia псаммофита O. chankaensis (Pg5 = 42,9 %, A = 2,00, Ho = 0,266, He = 0,301), однако уровень гетерозиготности последнего значительно выше (Kholina et al., 2009). Уровень генетического разнообразия O. chankaensis обусловлен в значительной мере особенностями его биологии (вид является многолетником, что приводит к наличию перекрывающихся поколений и увеличивает эффективную
Таблица 2
Частоты аллелей и наблюдаемая гетерозиготность (H ) полиморфных локусов Oxytropis lanata (n = 15 растений)
Локус Аллель Частоты H
Fe-2 1,05 0,100 0,467
1,00 0,500
0,95 0,400
Fe-3 1,20 0,500 0,467
1,00 0,500
Gpi-2 1,00 0,900 0,200
0,92 0,100
Gpt 1,10 0,389 0,556
1,00 0,611
Idh-2 1,20 0,033 0,067
1,00 0,967
Lap-1 1,05 0,167 0,267
1,00 0,733
0,95 0,100
Mdh-2 1,15 0,067 0,133
1,00 0,933
Pgm-1 1,00 0,567 0,467
0,95 0,433
Pgm-2 1,00 0,967 0,067
0,95 0,033
Таблица 3
Влияние скарификации и криоконсервации на прорастание семян Oxytropis lanata
Вариант опыта сУт Т50, СУТ Период прорастания, сут Всхожесть, %
Контроль 2,3 ± 0,6 4,3 ± 2,3 43 12,0 ± 3,5
Скарификация серной кислотой, 20 мин 1 2 37 68,8 ± 8,8
Жидкий азот, 100 сут 1 2 55 98,6 ± 2,3
Примеч.: 1КС = 8,17 (сравнение всхожести семян в контроле и после скарификации); = 29,82 (сравнение всхожести семян в контроле и после криоконсервации); 1СА = 5,79 (сравнение всхожести семян после скарификации и после криоконсервации); пК, пС, пА = 3, при 1 > 2,78 разница достоверна.
численность популяции) и системы размножения (половой тип репродукции и перекрестное опыление с помощью насекомых); эти особенности характерны и для О. lanata (многолетник; для остролодочников установлена облигатная аллогамность), и они в совокупности способствуют поддержанию генетического разнообразия. Более высокие показатели гетерозиготности О. chankaensis объясняются его полиплоидной природой (КЬоПпа et а1., 2009). Показатели по-лиморфности и числа аллелей на локус О. lanata близки к известным данным для 6 видов остролодочников Камчатки (КЪоНпа et а1., 2013), однако уровень гетерозиготности у полиплоидных видов секции Orobia выше. Выявленный уровень полиморфизма О. lanata позволяет считать, что исследованная популяция может служить источником материала для сохранения генофонда вида.
Прорастание семян О. ЫиМа и их реакция на криоконсервацию
Размеры и масса семян О. lanata составляют в среднем: длина - 2,12 ± 0,05 мм, ширина -1,71 ± 0,04 мм, масса 100 семян - 0,29 ± 0,017 г. Влажность воздушно-сухих семян О. lanata -5,6 ± 0,4 %, такие семена называют ортодок-
сальными, вода в них находится в связанном состоянии, и они сохраняют высокую жизнеспособность при подсушивании и замораживании (Tikhonova, 1999). Исследование реакции семян на криохранение включает изучение прорастания семян. Для дикорастущих представителей сем. Fabaceae характерно наличие твердосемян-ности, которое обеспечивает физический тип покоя и способствует длительному сохранению всхожести (Nikolaeva et al., 1985). Семена таких растений обладают высокой стойкостью к неблагоприятным факторам среды. Растения O. lanata сформировали семена с довольно высокой степенью твердосемянности (табл. 3, контроль), близкой к таковой O. chankaensis, у которого всхожесть семян в контроле не превышала 6,0 % (Kholina, Voronkova, 2012; Voronkova, Kho-lina, 2010). Нарушение непроницаемости кожуры при обработке серной кислотой привело к активному прорастанию семян (табл. 3, рис. 2), что указывает на присутствие только физического типа покоя. С учетом увеличения всхожести после скарификации установлено, что семена O. lanata имеют высокую всхожесть (свыше 60 %), как и семена других видов рода после скарификации -O. kamtschatica (93,6 ± 4,2 %), O. ochotensis (87,3 ± 5,2 %), O. revoluta (79,3 ± 1,9 %) (Voronkova et
Таблица 4
Сравнение морфометрических показателей проростков Oxytropis lanata из семян, прошедших криоконсервацию, и в контроле (^критерий Стьюдента, пК, пА = 20, при 1 > 2,02 разница достоверна)
Показатель Этапы развития проростков
I II III IV
Длина корня 0,19 0,72 1,21 3,03*
Высота проростка 2,39* 0,60 0,40 1,27
Длина листа** 0,30 0,52 - -
Ширина листа** 0,59 0,52 - -
Примеч.: * - разница достоверна. ** - на I этапе сравнивали размеры семядольного листа, на II этапе - настоящего листа.
Рис. 2. Динамика прорастания семян Oxytropis 1апа(а после скарификации и криоконсервации (-196 °С). Контроль - без предпосевной обработки; Скарификация - обработка семян концентрированной серной кислотой 20 мин.; Азот - предпосевное замораживание семян в жидком азоте, 100 сут. По оси абсцисс - период прорастания, сут.; по оси ординат - всхожесть, %.
а1., 2008), О. chankaensis (65,0 ± 2,0 %), О. Шша (67,0 ± 2,0 %) (Уогопкоуа, КЪоНпа, 2010).
После криоконсервации семена сохранили способность к прорастанию. Реакция на кри-ообработку проявилась резким повышением всхожести по сравнению с контролем и увеличением скорости прорастания - проросло свыше 90 % семян в течение пяти дней, через 1,5 мес. всхожесть составила около 100 % (табл. 3, рис. 2). Воздействие ультранизкой температуры с последующим размораживанием было аналогично воздействию серной кислоты и, по-видимому, также связано с повреждением семянной кожуры. Преодоление экзогенного типа покоя под действием сверхнизких температур отмечено ранее для видов Oxytropis (КЪоНпа, Уогопкоуа, 2012; Уогопкоуа et а1., 2008; Уогопкоуа, КЪоПпа,
2010) и других дикорастущих бобовых (КЪоПпа, Уогопкоуа, 2012; Репсе, 1991; Peгez-Gaгsia, 2008; Salomao, 2002).
Одним из важных показателей успеха крио-консервации является нормальный рост и развитие растений из деконсервированных семян. Глубокое замораживание семян О. !апа(а не привело к появлению аномальных проростков. Сравнительный анализ не выявил существенных отклонений результатов опытного варианта от контрольного (рис. 3, табл. 4, 5). По сравнению с контролем отмечено незначительное снижение средней высоты сеянцев из семян после замораживания на первом этапе и увеличение длины корня в варианте с глубоким замораживанием на четвертом этапе (рис. 3, табл. 4). Фитомасса проростков из семян после криохранения была
Таблица 5
Изменение фитомассы проростков Oxytropis lanata из семян, прошедших криоконсервацию,
и в контроле (общая масса 20 шт.)
Показатель Вариант опыта Этапы развития проростков
I III IV
Сырая фитомасса, г Контроль 0,590 1,135 2,285
Азот 0,625 1,200 2,320
Сухая фитомасса, г (в % от сырой фитомассы) Контроль 0,040 (6,8) 0,170 (15,0) 0,385 (16,9)
Азот 0,055 (8,8) 0,190 (15,8) 0,424 (18,3)
Рис. 3. Влияние криоконсервации на длину корня (А) и побега (Б) проростков Oxytropis lanata. Азот - предпосевное замораживание семян в жидком азоте (-196 °С). По оси абсцисс - этапы развития проростков (см. Материалы и методы), по оси ординат - длина, мм.
выше, чем у контрольных, на всех этапах (табл. 5). Нормальное развитие растений из семян после хранения в жидком азоте было показано в наших ранних работах для 3 видов бобовых -Sophora flavescens (Voronkova, Kholina, 2003) и 2 видов Hedysarum (Voronkova, Kholina, 2010). Известны случаи появления поврежденных проростков - так, у Astragalus mongolicus после экспозиции семян в жидком азоте половина проростков были поврежденными или погибли, что отчасти может быть вызвано особенностями размораживания семян - нагреванием на водяной бане до 40 °С (Shibata et al., 1995). Мы проводили менее контрастное отогревание семян на воздухе, никаких повреждений проростков с начальных этапов прорастания отмечено не было.
Проведенное исследование показало, что семена O. lanata хорошо переносят замораживание. Один из существенных для сохранения генофонда при криоконсервации показатель -всхожесть семян - не уменьшилась. Отмечено стимулирующее влияние замораживания семян -преодоление физического покоя, ускорение прорастания и увеличение всхожести. Рост и развитие растений из семян после криохранения не
выявили отклонений. Устойчивость семян O. la-nata к сверхнизким температурам обеспечивает возможность для хранения семянного материала с максимальной гарантией. Полученные результаты могут быть использованы при создании коллекции семян O. lanata для низкотемпературного банка семян.
Заключение
В работе выявлены молекулярные маркеры, с помощью которых исследовано состояние генофонда O. lanata. В популяции установлен средний уровень генетического разнообразия, в целом характерный для травянистых бобовых. Изученная популяция может служить источником материала для сохранения генофонда вида. Глубокое замораживание семян O. lanata в жидком азоте не оказало отрицательного действия на их жизнеспособность и на развитие растений из семян после криоконсервации и может быть использовано в качестве режима долговременного хранения.
Работа поддержана программой Президиума РАН «Биологическое разнообразие», проект № 12-1-П30-02.
ЛИТЕРАТУРА
Blinova K.F., Iriste V.A. The present state and the prospects of investigation of the representatives of the genus Oxytropis DC. // Rast. Resursy [Plant Resources], 1972. - Vol. 8, iss. 2. - P. 305-309 [in Russian]. (Блинова К.Ф., Иристе В.А. Современное состояние и перспективы изучения представителей рода Oxytropis DC. // Раст. ресурсы, 1972. - Т. 8, вып. 2. - С. 305-309).
Blinova K.F., Sakanyan E.I. Species of Oxytropis DC. used in Tibetan medicine and their flavonoid composition // Rast. Resursy [Plant Resources], 1986. - Vol. 22, iss. 2. - P. 266-272 [in Russian]. (Блинова К.Ф., Саканян Е.И. Виды Oxytropis DC., применяемые в тибетской медицине, и их флавоноидный состав // Раст. ресурсы, 1986. -Т. 22, вып. 2. - С. 266-272).
Boikov T.G., Sutkin A.V. Ecophytocenotic features of Vicia tsydenii Malysch. in Southern Transbaikalia // Rus. J. Ecol., 2012. - No. 5. - P. 340-346.
Engelmann F. Plant cryopreservation: progress and prospects // In Vitro Cellular and Developmental Biology -Plant, 2004. - Vol. 40, No. 5. - P. 427-433.
Enzyme Nomenclature. Recommendations (1972) of the International Union of Biochemistry on the nomenclature and classification of enzymes. - Moscow: V1NITI, 1979. - 321 p. [in Russian]. (Номенклатура ферментов. Рекомендации (1972 г.) Международного биохимического союза по номенклатуре и классификации ферментов. - М.: ВИНИТИ, 1979. - 321 с.).
Goncharenko G.G., Padutov V.E., Potenko V.V. Rukovodstvo po issledovaniyu khvoinykh vidov metodom ele-ktroforeticheskogo analiza izofermentov [Guide to conifer species research by isozyme electrophoretic methods]. -Gomel: Polespechat, 1989. - 164 p. [in Russian]. (Гончаренко Г.Г., ПадутовВ.Е., ПотенкоВ.В. Руководство по исследованию хвойных видов методом электрофоретического анализа изоферментов. - Гомель: Полеспечать, 1989. - 164 с.).
Hamrick J.L., Godt M.J.W. Effects of life history traits on genetic diversity in plant species // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B., 1996. - Vol. 351. - P. 1291-1298.
Kasyanova L.N., Azovskiy M.G. Vegetation of dune sands of Olkhon Island on Baikal and some questions concerning its protection // Geogr. Nat. Res., 2011. - Vol. 32, No. 3. - P. 248-253 [in Russian]. (Касьянова Л.Н., Азовский М.Г. Растительность дюнных песков острова Ольхон на Байкале и вопросы ее охраны // География и природные ресурсы, 2011. - Т. 32, № 3. - С. 57-63).
Kasyanova L.N., Azovskiy M.G., Mazukabzov A.M. The vegetation of drift sands on an island Olkhon (Baikal) // Bull. Mose. Soc. Natur., 2007. - Vol. 211, iss. 2. - P. 41-49 [in Russian]. (Касьянова Л.Н., Азовский М.Г., Мазу-кабзов А.М. Структура растительности перевеиваемых песков острова Ольхон (озеро Байкал) // Бюлл. МОИП, 2007. - Т. 211, вып. 2. - С. 41-49).
Kholina A.B., Koren O.G., Zhuravlev Yu.N. Allozyme variation in Oxytropis retusa Matsum. from the Kuril Archipelago // Natural History Research. Special Issue, 2000. - No. 7. - P. 15-20.
Kholina A.B., Koren O.G., Zhuravlev Yu.N. High polymorphism and autotetraploid origin of the rare endemic species Oxytropis chankaensis Jurtz. (Fabaceae) inferred from allozyme data // Rus. J. Genet., 2004. - Vol. 40, No. 4. - P. 393-400.
Kholina A.B., Koren O.G., Zhuravlev Yu.N. Genetic structure and differentiation of populations of the tetraploid species Oxytropis chankaensis (Fabaceae) // Rus. J. Genet., 2009. - Vol. 45, No. 1. - P. 70-80.
Kholina A.B., Nakonechnaya O.V., Yakubov V.V., Koren O.G. Genetic variation in six species of the genus Oxytropis DC. (Fabaceae) from Kamchatka Peninsula // Rus. J. Genet., 2013. - Vol. 49, No. 10. - P. 1021-1029. doi: 10.1134/S1022795411120088.
Kholina A.B., Voronkova N.M. Conserving the gene pool of far eastern plants by means of seed cryopreservation // Biol. Bull., 2008. - Vol. 35, No. 3. - P. 262-269.
Kholina A.B., Voronkova N.M. Seed cryopreservation of some medicinal legumes // Journal of Botany, 2012. -Vol. 2012, Article ID 186891, 7 pages, doi:10.1155/2012/186891.
Konopleva E.V. Comparative characteristics of analgesic and antihypoxic effects of tinctures of some species Oxytropis DC. // Rast. resursy [Plant Resources], 1989. - Vol. 25, iss. 2. - P. 254-258 [in Russian]. (Коноплева Е.В. Сравнительная характеристика обезболивающего и противогипоксического действия настоев некоторых видов Oxytropis DC. // Раст. ресурсы, 1989. - Т. 25, вып. 2. - С. 254-258).
Li M.X., Lan Z.H., Wei L.L. et al. Phytochemical and biological studies of plants from the genus Oxytropis // Rec. Nat. Prod., 2012. - Vol. 6, No. 1. - P. 1-20.
Nikolaeva M.G., Razumova M.V., Gladkova V.N. Spravochnik po prorashchivaniyu pokoyashchikhsya semyan [Germination of Dormant Seeds: A Handbook]. - Leningrad: Nauka, 1985. - 348 p. [in Russian]. (Николаева М.Г., Разумова М.В., Гладкова В.Н. Справочник по проращиванию покоящихся семян. - Л.: Наука, 1985. - 348 с.).
Olennikov D.N., Rokhin A.V. Galactomannan of the locoweed (Oxytropis lanata (Pallas) DC) seeds // Appl. Bioch. Microbiol., 2010. -Vol. 46, No. 4. - P. 444-448.
Pence V.C. Cryopreservation of seeds of Ohio native plants and related species // Seed Sci. Technol., 1991. - Vol. 19. - P. 235-251.
Perez-Garsia F. Effect of cryopreservation, gibberellic acid and mechanical scarification on the seed germination of eight endemic species from the Canary Islands // Seed Sci. Technol., 2008. - Vol. 36. - P. 237-242.
Polozhij A.V. Oxytropis DC. // Flora Sibiri [Flora Sibiriae]. - Novosibirsk: Nauka, 1994. - Vol. 9. - P. 74-151 [in Russian]. (Положий А.В. Oxytropis DC. // Флора Сибири. T. 9. Fabaceae (Leguminosae). - Новосибирск: Наука, 1994. - T. 9. - С. 74-151).
Povydysh M.N., Bobyleva N.S., Bityukova N.V. Oxytropis DC. // Rastitelnye resursy Rossii: dikorastushchie ts-vetkovye rasteniya, ikh komponentnyi sostav i biologicheskaya aktivnost. T. 3. Semeistva Fabaceae-Apiaceae [Plant resources of Russia: wild flowering plants, their component composition, and biological activity. Vol. 3. Families Fabaceae-Apiaceae] / Ed. Budantsev A.L. - St. Peterburg, Moscow: KMK, 2010. - P. 65-69 [in Russian]. (Повы-дыш М.Н., Бобылева Н.С., Битюкова Н.В. Oxytropis DC. - Остролодочник // Растительные ресурсы России: дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. Т. 3. Семейства Fabaceae-Apiaceae / Ред. Буданцев А.Л. - СПб., М.: КМК, 2010. - С. 65-69).
Probatova N.S., Kazanovsky S.G., Rudyka E.G. et al. Oxytropis lanata // In: Marhold K. (ed.), IAPT/IOPB chromosome data 12. Taxon, 2011. - Vol. 60, No. 6. - P. 1792, E53.
Rao N.K. Plant genetic resources: Advances conservation and use through biotechnology // African J. Biotechnol., 2004. - Vol. 3. - P. 136-145.
Salomäo A.N. Tropical seed species' responses to liquid nitrogen exposure // Braz. J. Plant Physiol., 2002. - Vol. 14, No. 2. - P. 133-138.
Shibata T., Sakai E., Shimomura K. Effect of rapid freezing and thawing on hard-seed breaking in Astragalus mongolicus Bunge (Leguminosae) // J. Plant Physiol., 1995. - Vol. 147. - P. 127-131.
StanwoodP.C. Cryopreservation of seed germplasm for genetic conservation // Cryopreservation of plant cells and organs. - Boca Raton; Florida: CRC Press, Inc, 1985. - P. 200-226.
Tikhonova V.L. Long-term storage of seeds // Rus. J. Plant Phys., 1999. - Vol. 46, No. 3. - P. 400-408.
Voronkova N.M., Kholina A.B. An influence of temperature factor and scarification on seed germination and growth of seedlings of Sophoraflavescens Soland. // Rast. Resursy [Plant Resources], 2003. - Vol. 39, iss. 1. - P. 43-49 [in Russian]. (Воронкова Н.М., Холина А.Б. Влияние температурного фактора и скарификации на прорастание семян и рост сеянцев Sophora flavescens Soland. // Раст. ресурсы, 2003. - Т. 39, вып. 1. - С. 43-49).
Voronkova N.M., Kholina A.B. Conservation of endemic species from the Russian Far East using seed cryopreser-vation // Biol. Bull., 2010. - Vol. 37, No. 5. - P. 496-501. doi: 10.1134/S1062359010050092
Voronkova N.M., Kholina A.B., Verkholat V.P. Plant biomorphology and seed germination in pioneer species of Kamchatka volcanoes // Biol. Bull., 2008. - Vol. 35, No. 6. - P. 599-605.
Yurtsev B.A. Conspectus of the section Baicalia Bge. of the genus Oxytropis DC. // Novosti Sist. Vyssh. Rast. [Novit. Syst. Pl. Vasc.], 1964. - Vol. 1. - P. 191-218 [in Russian]. (ЮрцевБ.А. Конспект системы секции Baicalia Bge. рода Oxytropis DC. // Новости сист. высш. раст., 1964. - Т. 1. - С. 191-218).
Zhivotovskiy L.A. Populyatsionnaya biometriya [Population Biometry]. - Moscow: Nauka, 1991. -271 p. [in Russian]. (Животовский Л.А. Популяционная биометрия. - М.: Наука, 1991. - 271 с.).
