CC BY
37ПЛЕМЕННОЕ ДЕЛО И РАЗВЕДЕНИ
УДК: 636.934 DOI: 10.24411/0023-4885-2020-10401
ПОДХОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ ООЦИТОВ ОТ КРОЛЬЧИХ И САМОК НОРОК
Д.В. Попов, Е.С. Колесник, И.С. Кашапова, Г.Ю. Косовский
ФГБНУ НИИПЗК, 140143, г/п Родники Московской обл., Россия
e-mail: niipzk@mail.ru
Гаметы содержат генетический материал, который используется в репродукивной биотехнологии. Женские половые клетки, ооциты, как правило, получают от постубойных самок, или, при промышленном получении эмбрионов, проводят процедуру прижизненной трансвагинальной аспирации фолликулов Ovum Pickup (OPU). В статье представлены результаты проведённого исследования по получению ооцитов методом прижизненной аспирации фолликулов у крольчих и самок норок. Показано, что с использованием аспиратора возможно получить достоверно большее количество ооцитов (p<0,01). Так, от крольчих в опытной группе было получено 31,00 ± 1,0 ооцитов, а в контрольной - 25,29 ± 1,5, от самок норок в экспериментальной группе это значение составило 15,6 ± 0,67 ооцитов и 11 ± 0,70 - от норок контрольной группы.
Ключевые слова: крольчихи, самки норок, фолликулы, ооциты, эмбрионы in vitro.
Технология получения эмбрионов млекопитающих методом in vitro применяется сегодня как для промышленного производства эмбрионов продуктивных сельскохозяйственных животных [1], так и для проведения научно-исследовательских работ, направленных на получение химерных животных, клонирования, а также животных с редактированными геномом [2, 3]. Данный метод основан на том, что ооциты, полученные из антральных фолликулов яичников млекопитающих, могут дозревать и способны к оплодотворению in vitro. В промышленной технологии получения эмбрионов in vitro от продуктивных животных используются два способа получения гамет самок. Во-первых, ооциты могут быть выделены из фолликулов постубойных животных -для этого проводят десекцию фолликулов либо аспирацию фолликулярной жидкости при помощи шприца. Второй способ получения гамет от самок-доноров - прижизненный (метод ovum pick-up, OPU), представляет собой пункцию поверхностных антральных фолликулов яичников и аспирацию ооцитов [4].
В тоже время, в научно-исследовательских целях источником ооцитов таких млекопитающих, как кролики или пушные звери, служат яичники умерщвлённых самок [3], такая процедура позволяет использовать самку в качестве донора яйцеклеток всего один раз, что ограничивает возможности экспериментов. Кроме того, на качество полу-
чаемых ооцитов может влиять ряд различных факторов, связанных с физиологическим статусом донора, в том числе, уровень гормонов в крови и стадия эстрального цикла, а также морфология яичника, биохимические характеристики фолликулярной жидкости, диаметр и уровень атрезии фолликулов [4]. Поэтому, если самку-донора предварительно не подвергать гормональной обработке с целью индукции фолликулогенза, то полученные постубойно яичники не всегда имеют достаточное количество антральных фолликулов, популяция ооцитов гетерогенна, часть ооцитов не способна дозревать in vitro.
Разработан метод прижизненного получения гамет (ооцитов) от крольчих и самок пушных зверей.
Материалы и методы Животные
В качестве самок-доноров ооцитов использовали половозрелых крольчих в количестве 14 голов: опытные самки (n=7), контрольные самки (n=7).
В качестве самок-доноров ооцитов пушных зверей использовали половозрелых самок американской норки в количестве 10 голов: опытные самки (n=5), контрольные самки (n=5). Индукция фолликулогенеза Для индукции фолликулогенеза применяли следующие режимы введения гормональных препаратов.
Таблица 1. Режим применения гормональных препаратов с целью индукции фолликулогенеза у крольчих
Table 1. The regimen of hormonal agents to induce folliculogenesis in rabbit females
День введения / Injection day Биорегулятор / процедура Bioregulator / procedure Доза, способ введения / Dose, method
День 0 / Day 0 ГнРг (Сурфагон) / Surfagon 0,3 мл в/м / ml intramuscularly
День 7 / Day 7 ФСГ + пролонгатор (полиэтиленгликоль) / FSH + prolonger (polyethylene glycol) 60 И.Е. п/к / IU subcutaneously
День 3 после инъекции ФСГ / Day 3 after FSH injection Лапаротомия и аспирация фолликулов (OPU) / Laparotomy and follicle aspiration
Таблица 2. Режим применения гормональных препаратов с целью индукции фолликулогенеза у самок норок
Table. The regimen of hormonal agents to induce folliculogenesis in mink females
День введения / Injection day Биорегулятор / процедура Bioregulator / procedure Доза, способ введения / Dose, method
День 0 / Day 0 ГнРг (Сурфагон) / Surfagon 0.25 мл в/м ml intramuscularly
День 4 / Day 4 ФСГ + пролонгатор (полиэтиленгликоль) / FSH + prolonger (polyethylene glycol) 25 И.Е. п/к IU subcutaneously
День 7 / Day 7 Лапаротомия и аспирация фолликулов (OPU) / Laparotomy and follicle aspiration —
Лапаротомия
Для получения ооцитов проводились процедуры лапаротомии и аспирация фолликулов.
Для работы с крольчихами, в качестве наркозного средства использовали препарат Пропо-фол 20%, который вводили внутривенно. С этой целью в ушную вену устанавливали периферический венозный катетер диаметров 20в. Препарат дозировали по рефлексам из расчёта первоначальной дозы 7.5-15 мг/кг [4].
При работе с самками норок в качестве средств для наркоза и анестезии применяли препараты золетил в/м в дозе 15 мг/кг и ксилазин в/м в дозе 0,2 мл/кг. Для премедикации за 15 мин до инъекции препарата золетил вводили подкожно атропина сульфат в дозе 0,04 мг/кг.
Самок на операционном столе располагали лёжа на спине. Операционное поле выбривали от шерсти и обрабатывали по Филончикову-Гроссиху.
Для хирургического доступа проводили сагиттальный разрез по белой линии живота, на 1-3 см ниже пупка. Гемостаз осуществляли путём электрокоагуляции сосудов кожи, подкожной жировой клетчатки и брюшины. Для предупреждения высыхания внутренних органов, использовали стерильный тёплый физиологический раствор для промывания и влажные марлевые салфетки. Для закрытия операционной раны на брюшине использовали шовный материал поликон. В дальнейшем рану ушивали послойно. Для ушивания кожи использовали атравматическую полигликолид-ную нить (pga) с режущей иглой. Во избежание возможных повреждений кожного шва накладывали внутрикожный шов по Шассеньяку[5].
Аспирация фолликулов
Яичники извлекали через разрез в брюшной стенке, проводили пункцию фолликулов и аспирировали
фолликулярную жидкость с ооцитами. С этой целью в опытных группах применяли аспиратор, всасывающее сопло оснащенное разъёмом Люэра, с присоединённой к нему иглой размером 23G для пункции фолликулов. В контрольных группах в качестве аспиратора использовали инъекционные шприцы объёмом 5 мл с иглой 23G со средой Хенкса и добавлением 20% фетальной сыворотки.
Яичник самки фиксировался мануально в таком положении, чтобы было видно наибольшее
Результаты и обсуждения
Результаты, полученные при проведении исследования, представлены в таблицах 3 и 4.
Так как, и к опытным, и к контрольным самкам-донорам применялся одинаковый режим
Таблица 3. Результаты получения ооцитов от Table 3. Results of obtaining oocytes from rabbits
количество зрелых фолликулов. Инъекционную иглу, закреплённую на аспираторе, или на инъекционном шприце вводили в зрелый фолликул, после чего аспирировали фолликулярную жидкость, которая поступала в ооцитоприёмник со средой Хенкса с добавлением 20% фетальной сыворотки или в шприц.
Подсчёт полученных ооцитов проводили с использованием бинокулярного микроскопа Nikon SMZ-2T при 150-200-кратном увеличении.
введения гормональных препаратов с целью индукции фолликулогенеза, общая реакция яичников в обеих группах была практически одинакова и составила для крольчих 35,43 и 35,47 созревших
крольчих
N п/п Общая реакция яичников (созревших фолликулов, шт.) / General reaction of the ovaries (mature follicles, pcs.) Аспирировано фолликулов, шт. (%) / Follicles aspirated, pcs. (%) Получено ооцитов, шт. (%) / Received oocytes, PCS. (%)
Опытная группа (n=7) - получение ооцитов при помощи аспиратора / Experimental group (n = 7) - obtaining oocytes using an aspirator
Донор № 1 / Donor # 1 34 34 (100) 29 (85,3)
Донор № 2 / Donor # 2 36 36 (100) 33 (91,6)
Донор № 3 / Donor # 3 39 39 (100) 33 (84,6)
Донор № 4 / Donor # 4 35 35 (100) 30 (85,7)
Донор № 5 / Donor # 5 37 37 (100) 35 (94,6)
Донор № 6 / Donor # 6 33 33 (100) 27 (81,8)
Донор № 7 / Donor # 7 34 34 (100) 30 (88,2)
Всего / Total 248 248 (100) 217 (87,5)
В среднем на донора в группе / Average per donor in the group 35,43 35,43 31,00 ± 1,0*
Примечание* Результаты, полученные в контрольной и опытной группе достоверно различны t=3,1 (p<0,01) / Note * The results obtained to control and experimental groups are significantly different t = 3.1 (p<0.01)
Контрольная группа (n=7) - получение ооцитов при помощи шприца / Control group (n = 7) - obtaining oocytes using a syringe
Донор № 1 / Donor # 1 35 35 (100) 26 (74,2)
Донор № 2 / Donor # 2 36 36 (100) 24 (66,6)
Донор № 3 / Donor # 3 33 33 (100) 27 (81,8)
Донор № 4 / Donor # 4 34 34 (100) 22 (64,7)
Донор № 5 / Donor # 5 38 38 (100) 28 (73,6)
Донор № 6 / Donor # 6 35 35 (100) 19 (54,2)
Донор № 7 / Donor # 7 38 38 (100) 31 (81,5)
Всего / Total 249 249 (100) 177 (71,0)
В среднем на донора в группе / Average per donor in the group 35,47 35,47 25,29 ± 1,5*
фолликулов на самку в среднем в группе соответственно. Для норок, этот показатель имел следующие значения: в опытной группе на самку-донора пришлось 17,6 созревших фолликула, а в контрольной группе насчитывали в среднем на обработанную самку 17,4 созревших фолликула. Процедуре аспирации, и в контрольных, и опытных группах подвергались все созревшие фолликулы, при этом полученные результаты имели межгрупповые практически значимые значения, как для крольчих, так и для норок.
Так, от крольчих опытной группы, к которым для получения ооцитов применяли аспиратор, было выделено 217 ооцитов, что в процентном соотношении к аспирированным фолликулам составило 87,5 процентов, в контрольной группе, с самками которой процедуру аспирации проводили при помощи шприца для инъекций было получено 177 ооцитов, или 71,0% к аспирированным фолликулам. На самку в среднем по группам пришлось - в опытной группе 31,00 ± 1,0 ооцитов, а в контрольной 25,29 ± 1,5,
при этом достоверная разница в межгрупповых значениях составила р<0,01.
При получении ооцитов от самок норок в опытной группе было собрано в общем количестве 78 ооцитов или 88,6% от количества аспирированных фолликулов, в контрольной группе это показатель составил 55 ооцитов или 63,2% от количества аспираций. Средние значения на самку в исследуемых группах имели достоверную разницу р<0,01 и составили для опытных самок 15,6 ± 0,67 ооцитов и 11 ± 0,70 выделенных ооцитов в контрольной группе.
Достигнутые значения при проведении процедур аспирации фолликулов с целью получения гамет от крольчих и самок норок, показывают, что при применении аспиратора можно получить достоверно большее количество ооцитов, чем при использовании для этой цели инъекционного шприца. Такие результаты достигаются за счёт того, что при применении аспиратора практически исключаются потери фолликулярной жидкости, которые неизбежны при применении для этой цели инъ-
Таблица 4. Результаты получения ооцитов от самок норок Table 4. Results of obtaining oocytes from mink females
N п/п Общая реакция яичников (созревших фолликулов, шт.) / General reaction of the ovaries (mature follicles, pcs.) Аспирировано фолликулов, шт. (%) / Follicles aspirated, pcs. (%) Получено ооцитов, шт. (%) / Received oocytes, PCS. (%)
Опытная группа (n=5) - получение ооцитов при помощи аспиратора / Experimental group (n = 5) - obtaining oocytes using an aspirator
Донор № 1 / Donor # 1 16 16 (100) 14 (87,5)
Донор № 2 / Donor # 2 16 16 (100) 16 (100)
Донор № 3 / Donor # 3 21 21 (100) 18 (85,7)
Донор № 4 / Donor # 4 18 18 (100) 15 (83,3)
Донор № 5 / Donor # 5 17 17 (100) 15 (88,2)
Всего / Total 88 88 (100) 78 (88,6)
В среднем на донора в группе / Average per donor in the group 17,6 17,6 15,6 ± 0,67*
Контрольная группа (n=5) - получение ооцитов при помощи шприца / Control group (n = 5) - obtaining oocytes using a syringe
Донор № 1 / Donor # 1 18 18 (100) 11 (61,1)
Донор № 2 / Donor # 2 19 19 (100) 13 (68,4)
Донор № 3 / Donor # 3 15 15 (100) 12 (80,0)
Донор № 4 / Donor # 4 17 17 (100) 10 (58,8)
Донор № 5 / Donor # 5 18 18 (100) 9 (50,0)
Всего / Total 87 87 (100) 55 (63,2)
В среднем на донора в группе / Average per donor in the group 17,4 17,4 11 ± 0,70*
Примечание* Результаты, полученные в контрольной и опытной группе достоверно различны t=4,7 (p<0,01) Note * The results obtained to control and experimental groups are significantly different t = 4.7 (p<0.01)
екционного шприца. Это объясняется тем, что в момент пункции созревшего фолликула всасывающий механизм апсиратора обеспечивает ток фолликулярной жидкости с ооцитами непосредственно в ооцитоприёмник с помещенной в него средой, при этом, оператор одной рукой может фиксировать яичник, а в другой держать аспиратор, что позволяет ему синхронизировать свои действия и собирать «растёкшуюся» по поверхности яичника фолликулярную жидкость. При использовании шприца для забора фолликулярной жидкости с ооцитами и создания всасывающего воздействия на содержимое полости фолликула оператору необходимо синхронизировать момент пункции фолликула и оттягивания поршня шприца на себя, при этом, для фиксации яичника необходима помощь ассистента, с которым также необходима абсолютная синхронизация всех манипуляций, что невозможно достичь практически, что приводит к неизбежным потерям фолликулярной жидкости с ооцитами.
Заключение
Таким образом, можно сделать заключение, что применение аспиратора для пункции фолликулов с целью прижизненного получения ооцитов от крольчих и самок норок позволяет достичь достоверно различных значений в сравнении с результатами, полученными при аспирации фолликулов
инъекционным шприцем и может применяться для
практического получения эмбрионов методом in
vitro от крольчих и самок пушных зверей.
Список литературы
1. Moore S. G., Hasler J. F. A 100-Year Review: Reproductive technologies in dairy. Journal of Dairy Science Vol. 100 No. 12, 201
2. Косовский Г.Ю. Клеточные и геномные технологии в повышении эффективности животноводства. М.: Издательство «Новые печатные технологии». - 2015 - 272 с
3. Jia L., Ding B., Shen C., Luo S., Zhang Y., Zhou L., Ding R., Qu P., Liu E. Use of oocytes selected by brilliant cresyl blue staining enhances rabbit cloned embryo development in vitro https:www.//cam-bridge.org/core. 26 Mar 2020 at 08:53:21, subject to the Cambridge Core terms of use.
4. Попов Д.В., Бригида А.В., Косовский Г.Ю. Руководство по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота М.: ФГБНУ «Росин-формагротех». 2016 - 51 с.
5. James W. Carpenter, MS, Exotic animal formulary Journal of Small Animal Practice 54(5), May 2013
6. Учебное пособие по технике наложения хирургических швов http: sgkb-kirov.chat.ru/ uzel/index.htm
OBTAINING OOCYTES FROM RABBIT FEMALES AND MINK FEMALES D.V. Popov, E.S. Kolesnik, I.S. Kashapova, G.Yu. Kosovsky
FSBSINIIPZK
Gametes contain genetic material that is used in reproductive biotechnology. Female germ cells, oocytes, as a rule, are obtained from females after slaughter, or, in the case of industrial production of embryos, the procedure for intravital transvaginal follicular aspiration Ovum Pick-up (OPU) is performed. The article presents the results of a study on obtaining oocytes by the method of intravital follicle aspiration in rabbits and mink females. It has been shown that with the use of an aspirator it is possible to obtain a significantly larger number of oocytes (p<0.01). So, from rabbits of the experimental group, 31.00 ± 1.0 oocytes were obtained, and of the control group - 25.29 ± 1.5, from mink females of the experimental group, this value was 15.6 ± 0.67 oocytes and 11 ± 0.70 - from minks of the control group.
Keywords: rabbits, mink females, follicles, oocytes, embryos in vitro.
References
1. Moore S. G., Hasler J. F. A 100-Year Review: Reproductive technologies in dairy. Journal of Dairy Science Vol. 100 No. 12, 201. 4.
2. Kosovskii G.Yu. Cellular and genomic technologies to improve the efficiency of animal husbandry. Moscow: «Novye pechatnye tekhnologil», 2015, 272 p. 5.
3. Jia L., Ding B., Shen C., Luo S., Zhang Y., Zhou L., Ding R., Qu P., Liu E. Use of oocytes selected by 6. brilliant cresyl blue staining enhances rabbit cloned
embryo development in vitro https://www.cam-bridge.org/core. 26 Mar 2020 at 08:53:21, subject to the Cambridge Core terms of use. Popov D.V., Brigida A.V., Kosovskii G.Yu. Bovine Embryo Transplant Guide. Moscow: FSBSI «RosinformagroteKH», 2016, 51 p. James W. Carpenter, MS, Exotic animal formulary Journal of Small Animal Practice 54(5), May 2013 Tutorial on Surgical Suture Technique http:sgkb-kirov.chat.ru/uzel/index.htm
