CC BY
38
УДК612.017
ПОДХОДЫ К КОРРЕКЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПАРАМЕТРОВ ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ СТВОЛОВОЙ КЛЕТКИ АУТОИММУННЫХ МЫШЕЙ MRL- 1рг/1рг
Наталья Александровна ФЕОФАНОВА, Людмила Борисовна ТОПОРКОВА, Марина Александровна ТИХОНОВА, Елена Рэмовна ЧЕРНЫХ, Георгий Александрович НЕВИНСКИЙ, Владимир Александрович КОЗЛОВ, Ирина Анатольевна ОРЛОВСКАЯ
ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН 630099, Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14
Для изучения возможности коррекции функциональной активности костномозговых гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) Ра8-дефектных мышей МЯЬ-/рг//рг с нарушенным апоптозом клеток использовались препараты, направленные на стимуляцию апоптоза — вортманнин (ингибитор фосфоинозитид-3-киназы, Р13К), Н7 (ингибитор протеинкиназы С, РКС) и ролипрам (ингибитор фосфодиэстеразы 4, РББ4). Показано, что все препараты усиливали апоптоз СБ34+ клеток (Н7 и ролипрам — достоверно), при этом в присутствии Н7 и ролипрама наблюдалась тенденция к снижению количества 8/02М клеток. Обнаружено, что обработка клеток костного мозга (ККМ) препаратами приводит к снижению числа эритроидных колоний, повышенного у старых мышей МЯЬ- /рг//рг.
Ключевые слова: СБ34+ клетки, гемопоэтические предшественники, апоптоз,
дифференцировка, пролиферация.
У Ра8-дефектных мышей МКЬ-/рг//рг, несущих мутантный ген 1рт, нарушен апоптоз имму-нокомпетентных клеток, что приводит к появлению аутореактивных популяций, а также большого количества специфических для аутоиммунного процесса субпопуляций (СБ4-СБ8-) Т-лимфоцитов, результатом чего является формирование тяжелой лимфоаденопатии, сопровождаемой продукцией разнообразных аутоантител, иммунных комплексов, а также гломерулонефритом [1,2]. Ранее нами показано, что уровень апоптоза СБ34+ клеток снижается по мере формирования аутоиммунного заболевания (АИЗ) мышей МЯЬ-/рг//рг, обнаружено повышение пролиферативной активности популяции СБ34+ клеток по сравнению с соответствующим показателем контрольных мышей (СБЛхС57Б1/6)Р1-гибридов [3]. Показано также нарушение пролиферативно-дифференциро-вочных потенций ГСК: увеличение количества эритроидных колоний в костном мозге уже на ранних стадиях развития АИЗ, до появления
протеинурии [4].
В последние годы формируются новые подходы к коррекции аутоиммунной патологии путем воздействия на внутриклеточные сигнальные пути, опосредующие основные события в жизненном цикле клетки, такие как пролиферация, дифференцировка, выполнение специфических функций и апоптоз. В данной работе с целью коррекции функциональных параметров ГСК in vitro использовались препараты, направленные на стимуляцию апоптоза клеток — вортманнин (ингибитор PI3K), Н7 (ингибитор РКС) и ролипрам (ингибитор PDE4).
Методика исследования
До эксперимента животные (мыши MRLIpr/lpr) содержались в стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей) на стандартном рационе. Эксперименты проводили в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных (Страсбург, 1986) и одобрен-
Феофанова Н.А. — м.н.с, лаборатория иммунобиологии стволовой клетки ТопорковаЛ.Б. — к.б.н. с.н.с., лаборатория иммунобиологии стволовой клетки Тихонова М.А. — к.б.н., с.н.с. лаборатория клеточной иммунотерапии Черных Е.Р. — д.м.н., проф., заведующая лабораторией клеточной иммунотерапии Невинский Г.А. — д.х.н., проф., зав. лабораторией ферментов репарации Козлов В.А. — д.м.н., проф., академик РАМН, директор
Орловская И.А. — д.м.н., проф., зав. лабораторией иммунобиологии стволовой клетки, e-mail: [email protected] БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, № 4 (132), 2008 г 85
Таблица
Модуляция параметров клеточного цикла и апоптоза СБ34+ клеток костного мозга мышей МКЬ-1рг/1рг в условиях ингибиции Р13К (вортманнин), РКС (Н-7) и РОЕ4 (ролипрам) М±т
Показатель контроль (16 мышей) вортманнин (14 мышей) Н7 (16 мышей) ролипрам (16 мышей)
CD34 (%) 3,2±0,6 2,3±0,2 2,8±0,4 2,4±0,3
Апоптоз (%) 7,8+1,5 13±4,2 18+2,6* 16+3,2*
GJG, (%) 76+5,4 69+6,2 70+5,1 71±5
S/G2M (%) 16±4,6 17+3,9 12+3,5 13+3,7
IND (G0G]/SG2M) 20±6,2 11±3,7 21±6,7 32±13,6
* — отличие от контроля достоверно при р<0,05.
ными комитетом по биомедицинской этике ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН. На основании данных литературы и собственных исследований основным диагностическим критерием развития гломерулонефрита в нашей модели следует считать стойкое наличие белка в моче более 3 мг/мл [5]. Количество белка в моче определяли колориметрически с красителем Кумасси бриллиантовый синий; калибровочную кривую строили по BSA («Sigma») (100-1000 мкг/мл), результаты выражали в мг/мл. В работе использовались мыши MRLlpr/lpr в возрасте 12-23 месяцев с клинической манифестацией АИЗ (протеинурия).
Клетки костного мозга (ККМ) вымывали охлажденной культуральной средой из бедренных и больших берцовых костей. ККМ инкубировали со стимуляторами апоптоза в течение 3-4 часов, дозы препаратов выбраны в соответствии с литературными данными: вортман-нин — 0,5 мкМ [6], H-7 — 30 мкМ [7], ролипрам — 10мкМ [8].
Методом проточной цитофлюориметрии (FACSCallibur, Becton Dickinson) оценивалось относительное содержание CD34+ популяции среди клеток костного мозга; оценивали клеточный цикл по содержанию ДНК в клетках, окрашенных пропидиумом иодидом (Propidium iodide, 4 мкг/мл, Sigma) [9]. Для этого использовали мононуклеарные клетки, предварительно обработанные FITC-меченными анти-CD34 моноклональными антителами (PharMingen, San Diego, США). Среди CD34+ клеток (зеленая флюоресценция) определяли относительное содержание клеток с диплоидным (клетки в G0/G1 фазах клеточного цикла) и гипердиплоидным (клетки в S/G2M фазах клеточного цикла) набором ДНК. Апопто-тические клетки, ДНК которых подвергалась фрагментации, формировали характерный
гиподиплоидный пик (оранжевая флюоресценция).
Для определения числа коммитированных предшественников клетки костного мозга в концентрации 2,5х104/мл инкубировались в метилцеллюлозной среде М 3434 (Stem Cell Technology, Canada), содержащей фактор стволовых клеток (SCF), эритропоэтин, IL-3, IL-6. Гранулоцитарно-макрофагальные и эритроид-ные колонии (КОЕ-ГМ, БОЕ-Э, КОЕ-Э) подсчитывались под микроскопом после 14-дневной инкубации при температуре 37 °С, во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2.
Для статистической обработки данных применяли методы корреляционного и дисперсионного анализа. Сравнение рядов проводили методом непараметрической статистики с использованием критерия Mann-Whitney (Statistica 5).
Результаты исследования
В последние годы накапливаются данные об изменениях функциональной активности ГСК при АИЗ; делаются предположения о патогенетической роли этих изменений [10, 11], что дает основание рассматривать гемопоэтические предшественники как возможную мишень для терапевтических воздействий. Для изучения возможности коррекции функциональной активности ГСК Fas-дефектных мышей MRLlpr/lpr с нарушенным апоптозом клеток использовались препараты, направленные на стимуляцию апоптоза: вортманнин, H7 и ролипрам. Показано (табл.), что все анализируемые препараты усиливали апоптоз костномозговых CD34+ клеток: вортманнин — в виде тенденции, H7 и ролипрам — достоверно. При этом усиление апоптоза в присутствии H7 и ролипрама ассоциировалось с тенденцией к снижению количества клеток, находящихся в S/G2M фазах клеточного цикла. При анализе корреляцион-
ных связей выявлены различия модулирующей активности анализируемых веществ. Так, в контрольной группе (без воздействий) уровень апоптоза обратно коррелирует с долей G°/G1 клеток. В присутствии вортманнина эта связь еще сильнее. На фоне H7 уровень апоптоза обратно коррелирует не только с количеством клеток в G°/Gj, но и с индексом соотношения клеток в G°/Gj и S/G2M. Т.е. усиление апопто-за в присутствии данного модулятора ассоциировано с изменением клеточного цикла. И хотя ролипрам также достоверно усиливает апоптоз, это не отражается на соотношении клеток в G°/Gj и S/G2M (между уровнем апоптоза и IND связи нет). Таким образом, из трех препаратов, усиливающих апоптоз, только H7 меняет при этом клеточный цикл.
Известные к настоящему времени данные об участии PI3K в гемо- и лимфопоэзе позволяют предполагать, что нарушения в регуляции этого сигнального пути, приводящие к его гиперактивации, могут вызывать развитие аутоиммунных или опухолевых заболеваний [12, 13, 14]. Ингибитор PI3K ворманнин подавляет диффе-ренцировку, усиливая пролиферацию миелоид-ных предшественников; в отношении эрит-роидных предшественников, напротив, наблюдается снижение их пролиферации при подавлении активности PI3K — таким образом, PI3K является одним из внутриклеточных регуляторов соотношения числа эритроидных и мие-лоидных предшественников [15]. Н7 — ингибитор РКС, фосфорилирущей митохондриальные антиапоптотические белки Bcl-2. Эритроидная дифференцировка CD34+ клеток в присутствии эритропоэтина и SCF сопровождается повышением уровня РКСа и РКСр, а миелоидная — даун-регуляцией этих изоформ. Ингибиторы PKC подавляют эритроидную дифференциров-ку клеток CD34+ [16]. Ролипрам — ингибитор PDE4 и активатор протеинкиназы А — усиливает апоптоз через дефосфорилирование проа-поптотического белка Bad. Обработка ролип-рамом in vitro дозозависимо снижает число ге-мопоэтических колоний и повышает уровень апоптоза гемопоэтических предшественников у больных бронхиальной астмой, но не влияет на колониеобразование и выживаемость донорских гемопоэтических предшественников [17].
Исследовалась возможность коррекции с помощью вышеперечисленных воздействий дифференцировочных потенций стволовых кроветворных клеток старых больных мышей MRL lpr/lpr, в костном мозге которых отме-
40 п
35-
контроль вортманнин Н7 ролипрам
■ - БОЕ-Э+КОЕ-Э □ - КОЕ-ГМ
* достоверные различия с контролем (р<0,05).
Рис. Влияние ингибиторов PI3K (вортманнин), РКС (Н-7) и PDE4 (ролипрам) на формирование гемопоэтических колоний в костном мозге старых мышей MRL-lpr/lpr
чается значительное повышение числа эрит-роидных (БОЕ-Э+КОЕ-Э) колоний [4]. Показано (рис.), что все препараты снижают количество эритроидных колоний, при этом воздействие вортманнина и H7 приводило к достоверному снижению числа (БОЕ-Э+КОЕ-Э).
Полученные нами данные о коррекции функциональных параметров ГСК при аутоиммунной патологии (мыши MRL-lpr/lpr) позволяют предполагать возможность исследования роли стимуляторов апоптоза в терапии АИЗ (в том числе при трансплантациях клеток костного мозга).
Литература
1. Nagata S., Suda T.Fas and Fas ligand: lpr and gld mutations//Immunol. Today. 1995. 16: 39-43.
2. Watanabe-Fukunaga R., Brannan C.I., Copeland N.G. et al. Lymphoproliferation disorder in mice explained by defects in Fas antigen that mediates apoptosis //Nature. 1992.356:314-317.
3. Феофанова Н.А., Топоркова Л.Б., Тихонова М.А. и др. Клеточный цикл костномозговых CD34+ клеток в процессе развития аутоиммунного заболевания у мышей MRLMpJ/lpr. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2006. (3): 154-156.
Feofanova N.A., Toporkova L.B., Tikhonova M.A. etc. Cellular cycle of intramedullary CD34+ cells in the process of development of autoimmune disease of mice MRLMpJ/lpr // Kletochnye tekhnologii v biologii I meditsine. 2006.(3): 154-156.
4. Toporkova L.B., Dubrovskaya V.V., Sakhno L.V. et al. Hematopoietic progenitor colony formation in the
immunopathogenesis of the autoimmune disorder in MRL/MpJ-lpr mice. Russ. J. Immunol. 2002. Vol. 7. P. 245-250.
5. Колесникова О.П., Кудаева О.Т., Логинов В.А. и др. Показатели эритро- и иммунопоэза в развитии аутоиммунных заболеваний, индуцированных хронической реакцией трансплантат против хозяина //ВестникАМН СССР. 1991. 12. :13-16.
Kolesnikova O.P., Kudaeva O.T., Loginov V.A. etc. Indexes of erythro- and immunopoesis in development of autoimmune diseases induced by transplant chronic reaction against host //Vestnik AMNSSSR. 1991. 12: 13-16.
6. Sui X., Krantz S., You M, Zhao Z.Synergistic activation of MAP kinase (ERK1/2) by erythropoietin and stem cell factor is essential for expanded erythropoiesis. Blood. 1998. Vol. 92. P. 1142-1149.
7. Ohkusu K., Isobe K., Hidaka H., Nakashima I. Elucidation of the protein kinase C-dependent apoptosis pathway in distinct subsets of T lymphocytes in MRLlpr/lprmice. Eur J. Immunol. 1995. Vol. 25. P. 3180-3186.
8. Moon E, Lerner A. PDE4 inhibitors activate a mitochondrial apoptotic pathway in chronic lymphocytic leukemia cells that is regulated by protein phosphatase 2A. Blood. 2003. Vol. 101. P. 4122-4130.
9. Ayala A., Herdon C.D., Ayala C.A., et al. Differential induction of apoptosis in lymphoid tissues during sepsis: variation in onset, frequency, and the nature of the mediators. Blood. 1996. Vol. 87. P. 4261-4275.
10. Wang X., Hisha H., Cui W. et al. The characteristics of hematopoietic stem cells from autoimmune-prone mice and the role of neural cell adhesion molecules
in abnormal proliferation of these cells in MRL/lpr mice. Haematologica. 2007. Vol. 92. P. 300-307.
11. AndryushkovaA.A., Kuznetsova I.A., Bineva V.N. et al. Formation of different abzymes in autoimmune-prone MRL-lpr/lpr mice is associated with changes in colony formation of haematopoietic progenitors. J. Cell. Mol. Med. 2007. Vol. 11. P. 531-551.
12. Oak J.S., Fruman D.A. Role of phosphoinositide 3-kinase signaling in autoimmunity. Autoimmunity. 2007. Vol. 40. P. 433-441.
13. Patel R.K., Mohan C. PI3K/AKT signaling and systemic autoimmunity. Immunol. Res. 2005. Vol. 31. P. 47-55.
14. Fleischer A., Ghadiri A., Dessauge F. et al. Modulating apoptosis as a target for effective therapy. Mol. Immunol. 2006. Vol. 43. P. 1065-1079.
15. Lewis J.L., Marley S.B., Ojo M, Gordon M.Y. Opposing effects of PI3 kinase pathway activation on human myeloid and erythroid progenitor cell proliferation and differentiation in vitro. Exp. Hematol. 2004. Vol. 32. P. 36-44.
16. Myklebust J.H., Smeland E.B., Josefsen D., Sioud M. Protein kinase C-alpha isoform is involved in erythropoietin-induced erythroid differentiation of CD34(+) progenitor cells from human bone marrow. Blood. 2000. Vol. 95. P. 510-518.
17. Wang C.H., Lin H.C., Lin C.H. et al. Effect of theophylline and specific phosphodiesterase IV inhibition on proliferation and apoptosis of progenitor cells in bronchial asthma. Br. J. Pharmacol. 2003. Vol. 138. P. 1147-1155.
REGULATION OF FUNCTIONAL ACTIVITY OF HEMATOPOIETIC STEM CELL IN MRLLPR/LPR MICE VIA INTRACELLULAR SIGNALING PATHWAYS
Nataliya Aleksandrovna FEOFANOVA, Lyudmila Borisovna TOPORKOVA, Marina Aleksandrovna TIKHONOVA, Elena Removna CHERNYKH, Georgi Aleksandrovich NEVINSKY, Vladimir Aleksandrovich KOZLOV, Irina Anatol'evna ORLOVSKAYA
SI RIfor clinical immunology of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences 14, Yadrintsevskaya str., Novosibirsk, 630099
Autoimmune-prone MRL-lpr/lpr mice carrying mutation in the lpr gene have defects in apoptosis of different cell types, in particular hematopoietic cells. To search the approaches for correction of functional activity of hematopoietic stem cells in MRL-lpr/lpr mice we used chemicals known to induce apoptosis: wortmannin (phosphoinositide 3-kinase inhibitor), rolipram (phosphodiesterase 4 inhibitor), H7 (proteinkinase C inhibitor). All these chemicals enhanced apoptosis of CD34+ cells; rolipram and H7 tended to decrease the number of CD34+ cells in S/G2M phase. Incubation of bone marrow cells with all chemicals led to reduction of erythroid colonies number being increased in the aged MRL-lpr/lpr mice.
Feofanova N.A. — junior scientist, laboratory of immune biology of stem cell
Toporkova L.B. — candidate of Biological Sciences, senior researcher, laboratory of immune biology of stem cell
Tikhonova M.A. — candidate of Biological Sciences, senior researcher, laboratory of cellular immune therapy
Chernykh E.P. — doctor of Medical Sciences, professor, head of laboratory of cellular immune therapy
Nevinsky G.A. — doctor of Chemical Sciences, professor, head of laboratory of reparations enzymes
Kozlov V.A. — doctor of Medical Sciences, professor, academician of RAMS, director
Orlovskaya A.I. — doctor of Medical Sciences, professor, head of laboratory of immune biology of stem cell,
e-mail: [email protected]
