CC BY
88
УДК 577.2
Поддержание стабильности генома у Heterocephalus glaber
И. О. Петрусева1, А. Н. Евдокимов', О. И. Лаврик1,2,3*
'Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 8
2Новосибирский национальный исследовательский государственный университет
Министерства образования и науки РФ, 630090, Новосибирск, ул. Пирогова, 1
3Алтайский государственный университет Министерства образования и науки РФ, 656049,
Барнаул, просп. Ленина, 61
*E-mail: lavrik@niboch.nsc.ru
Поступила в редакцию 11.05.2017
Принята к печати 30.08.2017
РЕФЕРАТ Heterocephalus glaber (голый землекоп) - одна из перспективных моделей для изучения функционирования систем поддержания стабильности генома, в том числе и за счет эффективной репарации повреждений ДНК. H. glaber отличается высокой продолжительностью жизни, повышенной устойчивостью к раковым заболеваниям и рядом других уникальных фенотипических черт. На протяжении по крайней мере 80% жизни это животное не проявляет признаков старения и сохраняет способность к размножению. H. glaber привлекает большое внимание исследователей, занятых изучением молекулярных основ высокой продолжительности жизни и устойчивости к развитию опухолей. Несмотря на то что H. glaber обитает в условиях постоянного генотоксического (окислительного и др.) стресса, его геном и протеом отличаются стабильностью и эффективностью функционирования. В соматических клетках H. glaber отсутствует «ре-пликативное» старение, при этом в фибробластах существует дополнительный p53/pRb-зависимый механизм раннего контактного торможения, контролирующий пролиферацию клеток, а также механизм их arf-зависимого старения. Уникальные фенотипические черты и выявленные особенности функционирования генома, транскриптома и протеома, присущие H. glaber, указывают на высокую прочность и эффективное функционирование молекулярных машин, противостоящих накоплению повреждений в его геноме. В представленном обзоре проанализированы результаты изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе высокой продолжительности жизни H. glaber и его способности сопротивляться развитию опухолей. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА Heterocephalus glaber, онкоустойчивость, стабильность генома и протеома, репарация ДНК.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ОП - окислительные повреждения; GPX1 - глутатионпероксидаза; GSH - восстановленный глутатион; РКТ - раннее контактное торможение; HA - гиалуроновая кислота; HAS2 - гиалу-ронсинтаза 2; PARP - поли(ADP-рибоза)-полимераза; PARG - поли(ADP-рибоза)-гликогидролаза.
ВВЕДЕНИЕ
Повреждения ДНК, обусловленные воздействием внешних факторов и нормальных метаболических процессов, возникают с частотой от 1000 до 1 млн на клетку живого организма в день [1]. В результате поврежденным оказывается всего 0.00017% человеческого генома, состоящего из 3 млрд п. н., однако повреждение критически важных генов (таких, как гены белков-супрессоров опухолей) может приводить к серьезным нарушениям в функционировании клеток. Эффективная работа систем репарации ДНК, противостоящих накоплению повреждений, вносит существенный вклад в поддержание стабильности генома, которое является одной из критически
важных функций клетки. Накопление повреждений ДНК и мутаций увеличивает риск развития рака и связано со старением [2-4]. У человека дефекты в работе систем репарации ДНК ассоциированы с рядом генетически обусловленных заболеваний [1-4]. Кроме того, высокая консервативность путей репарации позволяет считать эффективность работы систем, отвечающих за удаление повреждений из ДНК, одной из основ долголетия [2-7]. Количество экспериментальных исследований, посвященных поиску корреляции между активностью систем репарации ДНК и максимальной продолжительностью жизни, невелико [8, 9]. Сложность подобных исследований и противоречивые результаты, получаемые при их
проведении, могли быть следствием как несовершенства методов оценки активности, так и некорректного выбора модельных систем [10].
В качестве одной из перспективных моделей для исследования функционирования систем поддержания стабильности генома, в том числе и за счет эффективной репарации повреждений ДНК, интерес представляет голый землекоп (Heterocephalus glaber). H. glaber - обитающее в норах на Юго-Востоке Африки (Эфиопия, Кения, Сомали) экстремально долго живущее мелкое млекопитающее, немногим превышающее по размерам мышь. Около 60 зоопарков мира, а также ряд лабораторий содержат колонии H. glaber. Это один из примерно 50 известных обитающих под землей травоядных грызунов, который является представителем исключительно редких истинно эусоциальных млекопитающих [11]. На фоне повышенного интереса к H. glaber журнал Science в 2013 году назвал его «позвоночным года». Продолжительность жизни H. glaber может достигать 32 лет, что в 10 раз больше, чем у мыши. Большую часть жизни (не менее 80%) это животное не имеет признаков старения и сохраняет способность к размножению [12-14], а механизмы защиты от раковых заболеваний, в том числе индуцированных [15], у него работают очень эффективно. В 2016 году впервые были зарегистрированы единичные случаи развития опухолей у содержавшихся в неволе особей [16]. H. glaber привлекает большое внимание научного сообщества, вовлеченного в изучение молекулярных основ высокой продолжительности жизни и устойчивости к развитию опухолей.
Заметное продвижение в этом направлении обеспечили исследования, выполненные с использованием созданных в лабораториях линий клеток H. glaber, а также биоинформатических и «омиксных» подходов [17-21]. Были открыты уникальные особенности процессов метаболизма H. glaber и их регуляции.
В данном обзоре мы попытались проанализировать результаты этих исследований, а также работ, выполненных с применением биохимических и моле-кулярно-генетических подходов, с целью составить представление о возможных особенностях работы систем репарации ДНК у H. glaber.
ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОМА И ТРАНСКРИПТОМА H. glaber С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОИНФОРМАТИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ
Развитие методов высокоэффективного полногеномного секвенирования предоставило беспрецедентную возможность выявления генетических отличий H. glaber, лежащих в основе его уникальных черт. Анализ данных, полученных при первом секвени-
ровании генома H. glaber, позволил обнаружить ряд характерных и важных особенностей, в частности, черты, говорящие о его повышенной стабильности [17]. Позже была получена и проанализирована еще одна версия генома [18] и создан web-портал Naked Mole Rat Genome Resource (http://www.nakedmole-rat.org). Сравнительный анализ полных транскрип-томов H. glaber и мыши выявил существенно более высокую транскрипционную активность некоторых генов H. glaber. В основном, это гены, ассоциированные с окислением-восстановлением и функционированием митохондрий. Обнаружено рекордное 300-и 140-кратное повышение уровня экспрессии генов Epcam и A2m, кодирующих внеклеточные белки. Уровни экспрессии генов, кодирующих белки репарации, у мыши и H. glaber различались не столь существенно [19].
Первые результаты глубокого (98.6%) секвени-рования генома самца H. glaber были опубликованы в 2011 году [17]. Тогда же появились данные о различиях в уровне экспрессии митохондриальных генов и генов, имеющих отношение к окислительно-восстановительной системе, у H. glaber и мыши [19]. На основе результатов секвенирования были предсказаны последовательности 22000 генов H. glaber. Анализ синтеничных областей хромосом H. glaber и человека позволил идентифицировать у H. glaber 750 приобретенных и 320 утраченных генов; 739 приобретенных и 448 утраченных генов выявлено у H. glaber при сравнении с мышью. Среди приобретенных генов 75.5% транскрибируются, а список утраченных включает много генов, имеющих отношение к функционированию рибосом и путям биосинтеза нуклеозидов. Среди псевдогенов у H. glaber преобладают гены, связанные со зрительной системой, обонянием, сперматогенезом и убиквитинированием белков [17]. Превращение этих генов в псевдогены (нефункциональные гены) коррелирует с ослабленными или подавленными у H. glaber физиологическими функциями [13] и к менее интенсивному, чем у мыши, накоплению убиквитинированных белков с возрастом [22].
С использованием GATK (Genome Analysis Toolkit, https://software.broadinstitute.org/gatk/) идентифицировано также 1.87 млн гетерозиготных одно-нуклеотидных полиморфизмов (SNP). Значение ну-клеотидного разнообразия составило 7 х 10-4 (среднее на нуклеотид), что гораздо ниже, чем в популяциях мыши или крысы и сравнимо с изменчивостью у человека. Низкий уровень изменчивости может отражать низкий эффективный размер популяции H. glaber, но может быть связан с высоким уровнем инбридинга, сниженной скоростью мутаций или высокой эффективностью работы систем репарации ДНК [17].
Предполагается, что со стабильностью генома коррелирует пониженное содержание транспозонов. Согласно [17] только 25% генома H. glaber представлено повторами, происходящими из транспозонов (у человека - 40%, у мыши - 37%, у крысы - 35%).
В число генов, подвергнутых действию положительного отбора, у землекопа, в отличие от крысы и мыши, входят Tepl и Terfl, вовлеченные в регуляцию длины теломер [23]. Длина теломер H. glaber невелика, они короче, чем у лабораторных мышей или крыс, и имеют примерно такую же длину, как те-ломеры человека. Ген Tert, кодирующий каталитическую субъединицу теломеразы, стабильно экспрес-сируется в соматических клетках H. glaber в любом возрасте. Активность теломеразы при этом невысока. В результате сравнительного исследования пришли к заключению, что между уровнями экспрессии теломеразы и размерами грызунов существует обратная корреляция, тогда как не найдено корреляции между длиной теломер и продолжительностью жизни [21, 24, 25]. Недавно выполненное детальное сравнение структуры генов теломеразной РНК (hgTerc) H. glaber и других видов выявило два основных отличия. Это замена A ^ G в первой петле псевдоузла P2b-p3, что соответствует нуклеотиду 111 в теломеразной РНК человека, и замена G ^ A в домене CR7-p8b (соответствует нуклеотиду 421 hTERC). В промо-торных участках гена hgTerc идентифицированы два сайта связывания факторов транскрипции: сайт взаимодействия с факторами семейства ETS, найденный в промоторных участках всех проанализированных генов, и сайт связывания фактора SOX17, уникальный для гена H. glaber. Еще одной отличительной чертой гена Terc H. glaber оказалось отсутствие одного из сайтов связывания Sp1 [26]. Таким образом, ген Terc H. glaber имеет уникальный полиморфизм и структуру промоторов.
Как показали результаты секвенирования РНК, выделенных из мозга, печени и почек новорожденного, молодого (4 года) и старого (20 лет) H. glaber, лишь у малого числа генов уровень экспрессии с возрастом изменялся. В мозге человека в процессе старения падал уровень экспрессии 33 генов, а у 21, наоборот, возрастал [27]. У H. glaber уровень экспрессии 32 из этих генов не изменялся существенно с возрастом: у 30 генов он был стабильным, и только у двух генов (Cyp46a1 и Smad3) он несколько возрастал [17]. Транскрипционная активность этих генов человека с возрастом снижалась [27].
Также был выполнен биоинформатический анализ 39 генов H. glaber, кодирующих ряд белков, ассоциированных с G^S-переходом, термогенезом и зрением, в том числе циклин Е1 (Ccnel), белок UCP1 (Ucpl) и гамма-кристаллин (y-crystallm), а также генов,
кодирующих белки, непосредственно участвующие в процессах метаболизма ДНК: мультифункциональ-ный белок репарации оснований АР-эндонуклеазу АРЕ1, большую субъединицу фактора репликации/ репарации RFC1 и топоизомеразу ТОР2А. ТОР2А контролирует топологию ДНК во время транскрипции и наряду с ТЕР1 и TERF1 является частью комплекса пяти белков альтернативного пути удлинения теломер. В результате сравнения с ортологами, представленными в геномах 36 млекопитающих, в генах Н. д1аЬег были найдены отличия, говорящие о присутствии 45 уникальных замен аминокислотных остатков в соответствующих белках [17].
Таким образом, первое предпринятое секвениро-вание [17] позволило выявить важные особенности генома Н. д1аЬег, хотя некоторые результаты позже уточнялись и пересматривались [18, 28, 29]. Так безволосый фенотип Н. д1аЬег был объяснен замещением консервативного аминокислотного остатка в белке, ассоциированном с ростом волос (HR) [17]. Такая интерпретация была основана на том, что подобные мутации в данном кодоне приводят к потере волосяного покрова у мыши, крысы и человека. Однако два других грызуна - дамараландский пескорой и морская свинка, также содержат эту мутацию в гене Нг, но имеют волосяной покров [29]. По-видимому, различия между генами Нг Н. д1аЬег и мыши/человека скорее отражают филогенетическую дивергенцию от мыши до человека [29, 30]. Отличия в структуре HAS2 (гиалуронсинтаза 2) Н. д1аЬег связывают с исключительной устойчивостью Н. д1аЬег к раку [31]. Однако некоторые из предположительно важных мутаций, найденных в гене, кодирующем Has2, одинаковы у нескольких видов, включая морскую свинку. Эти мутации не всегда ассоциированы с онкоустой-чивостью, их функциональные последствия скорее неизвестны [32]. Интересно, что высокомолекулярные гиалуронаны синтезируются также у онкоу-стойчивого долгоживущего землекопа Spalax даНЫ, однако его геном не содержит ни одной из мутаций, отнесенных к ключевым у Н. д1аЬег [33, 34]. Кроме того, под вопросом остается вывод [17] о пониженном содержании источника нестабильности - транспозо-нов - в геноме Н. д1аЬег по сравнению с мышью и человеком [28].
Сравнительный анализ группы генов, участвующих в поддержании стабильности генома у человека, мыши и землекопа, показал, что для генома Н. д1аЬег не характерно повышение числа копий генов [20]. В то же время ген СеЬрд, кодирующий фактор транскрипции, участвующий в регуляции процессов репарации, представлен тремя копиями, ген Tinf2 компонента шелтеринового комплекса - двумя. Кроме того, у Н. д1аЬег и человека, в отличие от мыши, в геноме
найден ген Rpa4, кодирующий аналог второй субъединицы белка RPA, состоящего из трех субъединиц (RPA1, RPA2 и RPA3) и участвующего во многих процессах, связанных с превращениями ДНК. Ранее полноразмерные кодирующие последовательности этого гена были обнаружены только у приматов и лошади [35]. Белки RPA4 и RPA2 могут экспрессиро-ваться одновременно, а соотношение их количества зависит от типа ткани. Гетеротример aRPA (альтернативный RPA, содержащий субъединицу RPA4 вместо RPA2) не способен поддерживать репликацию SV40 (распространенная модель для изучения процесса репликации in vitro), но имеет повышенное сродство к поврежденной ДНК, участвует в репарации, а также в активации процесса контроля клеточного цикла (стадии G2/M) [36-38].
Возросшее качество аннотаций генома позволило по результатам следующего секвенирования идентифицировать ~1800 некодирующих, ~42000 кодирующих участков ДНК и примерно столько же белков. В результате у H. glaber выявлен ряд особенностей в последовательностях генов, связанных с противостоянием канцерогенезу и старению [18]. Выявлены уникальные замены во фрагменте гена p53, который кодирует участок, участвующий в регуляции апопто-за, и в генах рецепторов гиалуронана CD44 и HMMR. Кроме того, р53 H. glaber содержит мотивы PXXP (P - пролина, Х - любая другая аминокислота), аналогичные PXXP р53 человека.
Исследование геномов и транскриптомов девяти видов африканских голых землекопов показало, что у этих видов положительной селекции подвержены гены, связанные с супрессией опухолей, регуляцией теломер, делением клеток, репарацией ДНК и ответом на воздействие стресса [30].
Современные биоинформатические подходы позволяют проводить полноценное направленное сравнение транскриптомов групп генов у различных видов животных. Известно, что печень - орган с высоким уровнем окислительного метаболизма и большим количеством спонтанно возникающих повреждений. Направленное сравнение уровней экспрессии генов, кодирующих белки репарации, в тканях печени долгоживущих видов (человека и H. glaber) и ко-роткоживущей мыши было проведено в работе [39]. Сравнение выборки из 130 генов выявило более высокую транскрипционную активность этих генов у долгоживущих видов. Среди 12 генов, уровень экспрессии которых не менее чем в 2 раза повышен и у человека, и у H. glaber, есть и ген опухолевого супрессора p53, важнейшего регулятора эксцизи-онных путей репарации. Повышен уровень экспрессии генов, кодирующих белки «мисматч» репарации (MSH3) и репарации оснований - ДНК-гликозилазы
(MUTYH, MBD4, NEIL1, NEIL2 и TDG), белки, участвующие в негомологичной рекомбинации (NHEJ1, Ku70, ДНК-полимеразы X - POLL и к - POLK), а также убиквитинлигазу UBE2N.
Большинство генов, кодирующих белки репарации, экспрессируются конститутивно и регулируются посттранскрипционными модификациями. Тем не менее, транскрипция некоторых генов этой группы индуцируется именно при генотоксическом стрессе, в том числе генов, кодирующих ключевые белки системы эксцизионной репарации нуклеоти-дов (NER): DDB1, DDB2, ERCC1, XPC, ERCC4 (XPF) и ERCC5 (XPG) [40]. С использованием специализированного алгоритма для сигнальных путей [41] показано, что у долгоживущих видов на генотоксическое воздействие более интенсивно реагируют пути, контролируемые ATM, BRCA1, p53 и PTEN [39].
РАННЕЕ КОНТАКТНОЕ ТОРМОЖЕНИЕ
Опубликовано большое количество результатов изучения биохимических особенностей H. glaber с целью поиска механизмов, лежащих в основе реализации необычных фенотипических признаков H. glaber, в том числе устойчивости к раку. Один из таких механизмов - уникальная система раннего контактного торможения (early contact inhibition) роста клеток H. glaber, открытая в 2009 году [31].
Контактное торможение - ключевой механизм, блокирующий деление клеток при достижении культурой клеток плотности, при которой они начинают контактировать друг с другом или с внеклеточным матриксом [42]. У человека и мыши регулярное контактное торможение управляется мембранными белками и происходит при повышении уровня экспрессии ингибитора циклинзависимой киназы (CDK) p27Klp1. P27Klp1 связывает комплексы циклин-CDK и останавливает клетки в фазе G1 клеточного цикла. Ключевые онкосупрессорные пути, пути Rb и p53, активируются продуктами генов Ink4a и Arf [43-46]. Белок p16INK4a - продукт гена Ink4a, связывается с CDK 4/6 и ингибирует ее, что, в свою очередь, приводит к активации Rb [43]. Продукт гена Arf активирует р53, связывая и ингибируя белок MDM2. Таким образом, гены Ink4a и Arf играют критическую роль в старении и защите от рака [44-48].
Для фибробластов H. glaber не характерно ре-пликативное старение, но в культуре они растут медленно и прекращают рост (деление) при низкой плотности, демонстрируя гиперчувствительность к появлению межклеточных контактов. Показано, что в этих клетках существует дополнительный механизм, контролирующий пролиферацию, названный «ранним контактным торможением» (РКТ). Первоначально предполагалось, что РКТ у H. glaber
M. musculus
Ж
) ■Щт
h/
-©л
tf Ш) Щ
Г
y—^ji O/U/ii Щ
I v г ш ( © ж .йг' :
е>г
г\ vi Л лчй)^ V
- З-Шшш
-Ъ\ 'I ЭД 'Г
А, 5 taw
¿-f
■■ 1 ' it
Я
¡Pi
ш
Плотность 0 клеток, 104/см2
5
H. glaber
Г
4Q
V 17
I
22
ГШ
/;г
о twffi --А^- Hi
p16Ink4a/p16ALTInk4a/b
Раннее контактное торможение
p27Kip1
11? Л 5
Кризис, некроз
Стандартное контактное торможение
pRb p53
Остановка клеточного цикла
Апоптоз
Рис. 1. Двухуровневое контактное торможение характерно для Н. д1аЬег, в отличие от одноуровневого у мыши. На основе данных, представленных в работах [31, 49]
ассоциировано, прежде всего, с повышенными уровнями белка р16ШК4а [31]. Основанием для такого предположения послужил тот факт, что в мутантных клетках H. glaber SFMut, спонтанно образующихся в процессе длительного культивирования и утративших способность к раннему контактному торможению, р16ШК4а не экспрессируется. С использованием рекомбинантных ДНК (плазмид), несущих гены, кодирующие мутантные формы большого Т-антигена SV40, инактивирующие либо р53 ^ТК1; pSG5 ЦГК1), либо pRb (LTKД434-444, pSG5 LTД434-444), либо ген белка дикого типа ^ЛТ; pSG5 LT), который подавляет активность и р53, и pRb, показано, что, в отличие от фибробластов мыши, способность фибробластов H. glaber к РКТ после трансфекции такими ДНК снижается в том случае, когда подавлена активность обоих белков-супрессоров. Возможность стандартного контактного торможения, в котором участвует р27 К1р1, лишь дублирует РКТ, проис-
ходящее при посредстве ингибитора киназ p16INK4a [31]. Позже с использованием данных секвенирова-ния РНК показали, что в культивируемых клетках и тканях H. glaber при экспрессии продукта альтернативного сплайсинга генов p15a, p15b и Arf локу-са Ink появляется белок, названный pALTINK4a/b. У мыши и человека белок pALTINK4a/b не выявлен. Экспрессия pALTINK4a/b индуцируется при РКТ и действии стрессов, таких, как УФ- или ионизирующее излучение, потеря прикрепления к субстрату и экспрессия онкогенов. Кроме того, pALTINK4a/b более эффективно индуцирует остановку клеточного цикла, давая клеткам больше времени на то, чтобы справиться с последствиями генотоксического воздействия, в том числе на репарацию повреждений ДНК до начала репликации. Двухуровневое контактное торможение, характерное для клеток H. glaber (в отличие от мыши и человека), может способствовать поддержанию стабильности его генома [49] (рис. 1).
ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНАЯ ГИАЛУРОНОВАЯ КИСЛОТА И ОНКОТРАНСФОРМАЦИЯ КЛЕТОК H. glaber
В соответствии с данными [32], раннее контактное торможение связано с сверхвысокомолекулярными (6-12 МДа) гиалуронанами (HA, hyaluronic acid), которые синтезируются в тканях и клетках H. glaber и выделяются во внеклеточное пространство. Ранее этот полисахарид был более известен как компонент внеклеточного матрикса, связанный с воспалением и раком. Фрагменты HA разной молекулярной массы выполняют разные функции: молекулы среднего размера (30-500 кДа) могут стимулировать деление клеток, а меньшего (< 50 кДа) - их миграцию. Короткие фрагменты HA связываются с рецепторами НА, такими, как CD44 и HMMR, индуцируют воспаление и активируют сигнальные пути, которые способствуют выживанию, миграции и инвазии как опухолевых, так и нормальных клеток. В нормальных биологических жидкостях человека присутствуют НА 1-8 МДа [50, 51]. У H. glaber накопление молекул со сверхвысокой молекулярной массой происходит благодаря низкой активности его гиалуронидаз и высокой процессивности гиалуро-нансинтазы 2 (HAS2), обладающей особой структурой активного центра. Синтезу сверхвысокомолекулярных полимеров НА способствует замена в HAS2 остатков аспарагина в позициях 188 и 301 на серин. Нарушения в работе сигнальных путей, снимающие ограничения для начала онкотрансформации фибро-бластов мыши, не приводят к трансформации клеток H. glaber. Если синтез высокомолекулярной HA остановлен в результате нокдауна HAS2 или происходит быстрая деградация HA в результате повышенного уровня экспрессии гиалуронидазы, то клетки H. glaber становятся доступными для трансформации [32].
РАННЕЕ КОНТАКТНОЕ ТОРМОЖЕНИЕ И НОВЫЙ ТИП СТАРЕНИЯ В КЛЕТКАХ H. glaber -«ИНДУЦИРОВАННОЕ СУПРЕССИЕЙ Arf СТАРЕНИЕ»
Открытый в 2009 году феномен раннего контактного торможения роста фибробластов H. glaber продолжает привлекать внимание исследователей. Помимо недавно обнаруженного белка pALTINK4a/b, продукта экспрессии альтернативно сплайсированной формы Ink4, участвующего в РКТ [49], был открыт еще один новый, специфичный для клеток H. glaber эффект - старение, индуцированное супрессией Arf. С использованием классических процедур клонирования и последующего секвенирования по Сэнгеру были определены кодирующие последовательности генов Ink4a и Arf H. glaber, получены лентивирусные конструкции, содержащие эти гены, и высокоспецифичные поликлональные антитела к соответствующим
белкам. Было показано, что в фибробластах H. glaber после повреждающих ДНК воздействий или после серии пассажей активируется эндогенная экспрессия Ink4a и Arf [52]. Повышение уровня экспрессии Ink4a или Arf вызывало остановку клеточного цикла в фибробластах H. glaber. Таким образом, экспериментально доказано, что консервативную функцию ингибиторов клеточного цикла у H. glaber выполняют гены, участвующие в создании эффекта раннего контактного ингибирования [52]. Эти результаты использовали при изучении механизмов, которые подавляют развитие опухолей из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток H. glaber (induced pluripotent stem cells, iPSCs) [53]. «Опухолеродность» iPSCs была проверена по способности формировать тератомы. Показано, что iPSCs H. glaber, подсаженные (привитые) в яички мыши, в отличие от множества других стволовых клеток, не образуют тератом, т.е. не являются опухолеродными. Это уникальное свойство базируется на видоспецифичной активации онкосупрессорного гена Arf и супрессорной мутации со сдвигом рамки считывания в экспрессиру-емом стволовыми клетками онкогене RAS (ERAS). Повышение уровня экспрессии гена Arf в iPSCs мыши заметно снижало их склонность к образованию опухолей. Найден связанный с клетками H. glaber механизм, который может защищать iPSCs и соматические клетки от супрессии Arf и, как следствие, образования опухолей. Показано также, что в iPSCs H. glaber осуществляется особый тип старения -«индуцированное супрессией Arf старение» (Arf suppression-induced senescence). Специфичное для H. glaber Arf-зависимое старение может действовать как второй способ защиты, индуцирующий старение (и последующую гибель) клеток путем подавления экспрессии Arf в клетках, в которых этот ген был де-репрессирован воздействием стрессоров [53].
АПОПТОЗ
Апоптоз - один из механизмов сопротивления онко-трансформации клеток. Способность клеток H. glaber вступать в апоптоз в ответ на генотоксические воздействия к настоящему моменту изучена недостаточно. При изучении механизма РКТ было показано, что уровень спонтанного апоптоза в фибробластах H. glaber невысок, он не превышает 7% у фибро-бластов кожи и 15% - у культуры легочных фибро-бластов и отличается особым типом регуляции [31]. Примерно двукратное повышение количества апоп-тотических клеток в этих культурах происходило после трансфекции плазмидами, несущими гены, кодирующие мутантные формы большого Т-антигена SV40, pSG5 LTK1 и pSG5 LTA434-444. Трансфекция культур фибробластов H. glaber плазмидой pSG5 LT,
несущей ген дикого типа, приводила к падению числа апоптотических клеток ниже контрольного уровня. При этом фибробласты мыши не давали выраженных ответов на такие воздействия [31]. Известно, что у мыши и человека апоптоз в той или иной степени индуцируется и при потере активности регулятора клеточного цикла pRb [54, 55]. Для выяснения механизма, который обеспечивает торможение роста фибробластов Н. д1аЬег при неактивном р53, трансфицированные (этими рекомбинантными плаз-мидами) фибробласты Н. д1аЬег культивировали в присутствии ингибитора каспаз Z-Vad-FMK. Рост фибробластов, трансфицированных pSG5 LTД434-444, в присутствии ингибитора апоптоза усиливался. Мутантный белок LTД434-444 инактивирует pRb, что нарушает механизм остановки клеточного цикла. Комбинация инактивации pRb и ингибирования апоптоза присутствием Z-Vad-FMK приводит к росту клеток до высокой плотности. Характер роста клеток, трансфицированных pSG5 LTK1, в присутствии ингибитора апоптоза не менялся. Z-Vad-FMK и LTK1 инактивируют р53, но при этом активным остается pRb, он включает остановку клеточного цикла и сдерживает пролиферацию [31].
Для устойчивых к раку слепышей Spalax ^ра1ах ehrenЬergi, S. даИИ) также характерен некротический путь гибели клеток [56]. У Spalax р53 отличается от р53 большинства родственных млекопитающих заменой аргинина в положении 174 на лизин. Эта специфическая мутация часто обнаруживается в опухолях человека [57]. Замена аргинина на лизин влияет на свойства ДНК-связывающего домена р53. Белок, содержащий такую замену, способен индуцировать остановку клеточного цикла, но не способен инициировать апоптоз. Мутация R174K в р53 снижает его способность активировать апоптозный каскад и активирует иммуновоспалительные процессы, стимулирующие развитие некроза, индуцируемого интерфероном-бета 1 [55, 56]. Тем не менее, некротическая смерть клеток Spalax также нуждается в функционировании пути, ассоциированного с активностью р53 [57-60]. В отличие от Spalax, в позиции 174 аминокислотной последовательности р53 Н. дЫЬег, как и в р53 нормальных клеток человека и мыши, находится остаток аргинина [18].
Изучение токсических воздействий на фибробла-сты Н. дЫЬег показало, что эти клетки более устойчивы к метилметансульфонату, параквату и низкому содержанию глюкозы в среде, при этом более чувствительны к Н202, ультрафиолету и ротенону, чем фибробласты мыши [61]. В другой работе было проведено сравнение апоптотического ответа культивируемых клеток артериального эндотелия Н. дЫЬег и лабораторной мыши на воздействие окислителя (Н202,
от 10-6 до 10-3 М) и повышенной температуры (42°С). Апоптотический ответ клеток Н. дЫЬег на действие Н202 был в 3-10 раз слабее, а их устойчивость к воздействию повышенной температуры была выше, чем у клеток мышиного эндотелия [62].
ВЫСОКАЯ ТОЧНОСТЬ ТРАНСЛЯЦИИ И РАСЩЕПЛЕННАЯ 28S рРНК
Одна из важных особенностей функционирования ключевых систем Н. дЫЬег - высокая точность процесса трансляции. При близкой скорости трансляции количество ошибочно включенных аминокислот в фи-бробластах Н. дЫЬег в 4 раза ниже, чем в фибробла-стах мыши [63]. Повышение точности трансляции в Н. дЫЬег связали с тем, что расщепленная на два фрагмента 28S рРНК (так препараты 28S рРНК Н. дЫЬег выглядят при электрофоретическом анализе в денатурирующих условиях) неким образом оптимизирует укладку и/или динамику большой субъединицы рибосомы [63]. Сравнение транскриптомов ряда грызунов показало, что разрушение 28S рРНК Н. дЫЬег происходит в результате удаления фрагмента специфической последовательности, расположенной в домене D6 предшественника 28S рРНК [64]. У Н. дЫЬег и ту-ко-туко (Ctenomys talarum) эти последовательности отличает высокая степень консервативности, его 288 рРНК также выглядит расщепленной, однако для ту-ко-туко повышенная точность синтеза белка не характерна [64]. Известно немало видов, в РНК которых выявлено подобное расщепление, что никак не коррелировало с продолжительностью их жизни. Неясно также, действительно ли 288 рРНК расщепляется в результате специфического сплайсинга, а фрагменты объединены в одну структуру только водородными связями, или расщепление - артефакт, возникающий при воздействии высокой температуры при выделении или анализе РНК [65-69]. Объяснение необычно высокой точности трансляции в Н. дЫЬег особенностью структуры 288 рРНК представляется, таким образом, спорным. Высокая точность процесса синтеза белков, безусловно, вносит вклад в стабильность протеома Н. дЫЬег, однако особенности молекулярных механизмов, ее определяющих, только предстоит изучить. В частности, у Н. дЫЬег совершенно не изучена первая стадия трансляции - аминоацилирование тРНК, которая в значительной степени определяет точность белкового синтеза [70].
ОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ И СТАБИЛЬНОСТЬ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ
Теория окислительного стресса рассматривает накопление в клетке окислительных повреждений (ОП) как один из факторов старения. По этой причине внимание исследователей привлекает вопрос о содержа-
нии ОП и особенностях механизмов антиоксидантной защиты у «долгожителя» H. glaber.
Одна из главных мишеней, в которых возникают ОП, это белки. Окислительные воздействия могут приводить к нарушению структуры и функций белков, в частности, инактивировать ферменты и способствовать образованию белковых агрегатов, содержащих ковалентные сшивки. Высокой чувствительностью к окислению отличаются SH-группы цистеина, способные формировать как обратимые (дисульфид S-S, сульфеновая кислота), так и необратимые повреждения (сульфиновая и сульфоновая кислоты) [22]. Другой распространенный тип ОП белков - карбонилирование, необратимая модификация боковых цепей остатков пролина, аргинина, лизина, треонина, цистеина и гистидина [71].
В качестве модельных систем для изучения ОП белков используют, в основном, лизаты тканей различных органов H. glaber и лабораторных мышей соответствующего физиологического возраста [22, 72-76]. Изучено содержание ОП цистеина и уровень карбонилирования, белков, а также влияние ОП на структуру и функционирование белков, а также активность ряда ферментов, участвующих в противостоянии накоплению окислительных повреждений.
Сравнение активности глутатионсинтетазы, ката-лазы, супероксиддисмутаз и глутатионпероксидазы (GPX1) показало, что в экстракте из печени молодой особи H. glaber активность всех ферментов, кроме GPX1, в 1.3-2 раза выше, чем в экстракте из печени мыши C57BL/6 соответствующего физиологического возраста. Активность GPX1 в экстракте H. glaber оказалась почти на порядок ниже [72]. В соответствии с более поздними данными у H. glaber резко снижен также уровень мРНК Gpxl и содержание соответствующего белка [19, 73].
Согласно [22], белки молодого H. glaber содержат в 1.6 раза больше как свободных SH-групп, так и обратимых ОП, таких, как S-S и сульфеновые производные цистеина, чем белки мыши (C57BL/6). Кроме того, у мышей количество ОП цистеина с возрастом возрастает в 3.4 раза, растет количество необратимых ОП цистеина и карбонильных повреждений, в то время как у H. glaber такие изменения отсутствуют [22, 72-76]. Это указывает на более эффективную работу противостоящих окислительному стрессу систем у H. glaber.
Анализ уровней карбонилирования белков в тканях H. glaber и мыши показал, что во всех образцах основными мишенями карбонилирования являются триозо-фосфатизомераза (TPI) и пероксиредоксин 1 (Prdx1). Белки H. glaber содержат в 1.5 раза больше карбонильных повреждений, но при этом лучше сохраняют ферментативную активность. Удельная активность
TPI в цитозольной фракции лизата ткани почки H. glaber была в 3 раза выше, чем у мыши. Кроме того, при действии окислительного стресса (аскорбат^е2+) TPI и Prdx1 H. glaber формируют меньше ковалентно сшитых белковых олигомеров [73, 74].
С использованием 4,4'-дианилино-1,1'-бинафтил-5,5'-дисульфоновой кислоты (BisANS) в качестве неполярного флуоресцентного зонда, взаимодействующего с гидрофобными остатками аминокислот на поверхности белковых глобул, показано, что белки H. glaber гораздо более устойчивы к денатурирующему воздействию 1 М мочевины, чем белки мыши. В частности, глицеральдегидфосфат-дегидрогена-за (GAPDH), в активный центр которой входят SH-группы, у H. glaber сохраняет 60% активности, в отличие от 10% у GAPDH мыши [22].
Сравнение распределения карбонилированных белков по субклеточным фракциям у долгоживущих, в том числе и H. glaber, и короткоживущих млекопитающих показало, что в ядре у долгоживущих животных, в отличие от короткоживущих, относительное содержание белков с ОП ниже, чем в цитоплазме [9, 76]. Это позволило предположить существование обратной корреляции между уровнем окислительных повреждений ядерных белков и продолжительностью жизни [76]. Однако детально это не изучено. Данные о содержании повреждений в белках, участвующих в процессе репарации ДНК, отсутствуют.
Результаты оценок, которые не различают типов повреждений или поврежденных молекул (белков, ДНК), происходящих из различных клеточных ком-партментов, могут маскировать истинную картину. Затрудняет анализ данных и путаница в названиях методов и препаратов, используемых в различных публикациях. Одной из причин противоречий может быть то, что высокий уровень ОП характерен только для определенных молекул (классов молекул) и/или компартментов клетки [76].
Кроме того, существуют противоречивые данные, касающиеся антиоксидантного статуса. Так, содержание GSH в тканях H. glaber в одной работе оценено как в 1.4 раза более низкое [77], в другой - как в 1.4 раза более высокое [22], чем у мыши. Такие противоречия не позволяют сравнивать антиоксидантный статус этих организмов. Кроме того, на результаты экспериментов с использованием экстрактов тканей органов, а также биологических жидкостей H. glaber может влиять феномен его эусоциальности [78].
УБИКВИТИН-ПРОТЕАСОМНАЯ СИСТЕМА И УНИВЕРСАЛЬНЫЙ ИНГИБИТОР ПРОТЕАЗ - АЛЬФА-2-МАКРОГЛОБУЛИН
Важную роль в поддержании содержания в клетке нужного количества активных белков правильной
структуры (протеостаза) играет убиквитин-протеа-сомная система [79].
Оценка протеолитической активности в сочетании с результатами вестерн-блот-анализа выявила более высокую химотрипсин-подобную (chymotrypsin like, ChT-L) и трипсин-подобную (trypsine-like, TL) про-теазную активность 26S и 20S протеасом в экстрактах ткани печени H. glaber. Показано, что удельная ChT-L активность протеасом H. glaber в 3-5 раз выше, чем у протеасом мыши [80]. Основная часть этой активности обеспечивается работой 26S протеасом. Кроме того, известно, что 20S протеасомы могут осуществлять убиквитин независимый гидролиз белков, содержащих ОП, например карбонилированных белков [79]. Это может способствовать поддержанию стабильной работы протеома H. glaber, уровень убиквитини-рования белков которого невысок и не увеличивается с возрастом. Содержание 19S регуляторных субъединиц и каталитических субъединиц иммунопротеа-сом (P5i и P2i) у H. glaber также выше, чем у мыши [80]. Кроме того, у H. glaber выше базовый уровень экспрессии ключевых шаперонов: HSP72, HSP40 и HSP25. Два из этих шаперонов входят в состав так называемого цитозольного фактора, который защищает протеа-сомы от ингибиторов и увеличивает эффективность их работы [81]. Наблюдаемое у H. glaber увеличение пептидазной активности и участие шаперонов в защите протеасом от действия ингибиторов не относятся к ранее известным функциям шаперонов. Все это может отражать высокий уровень контроля качества протеома у H. glaber.
С поддержанием протеостаза связан и многофункциональный белок плазмы крови - альфа-2-макроглобулин (A2m). Известно, что А2т человека способен связывать различные цитокины, факторы роста (TGF-P1, TNF-a, IL-1 в) и является универсальным ингибитором протеиназ (трипсина, химотрип-сина, эластазы и металлопротеиназ). Связывание A2m-протеиназных комплексов с рецептором LRP1 (CD91) запускает их быстрое удаление из крови и тканей путем рецепторзависимого эндоцитоза. Предполагается, что этот белок обладает функцией шаперона, предотвращающего агрегацию белков, а также способствует удержанию в клетках цинка, снижение концентрации которого с возрастом сопровождается развитием ряда заболеваний у человека [82-85]. Уровень транскрипции гена, кодирующего A2m в печени H. glaber, повышен в 140 раз по сравнению с уровнем в печени мыши [19]. Концентрация белка A2m в плазме крови H. glaber в 2-3 раза выше, чем в плазме крови человека. Вероятно, с этим связана протеолитическая активность плазмы крови H. glaber, пониженная по сравнению с активностью в плазме крови человека [86].
Еще одна важная особенность H. glaber - постоянная активность сигнального пути, регулируемого фактором Nrf2, который активирует транскрипцию более 200 генов, принимающих участие в антиокси-дантном и противовоспалительном ответе организма на эндогенные и экзогенные воздействия [87].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ: СТАБИЛЬНЫЙ ГЕНОМ, СТАБИЛЬНЫЙ УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, СТАБИЛЬНЫЙ ПРОТЕОМ, ЭФФЕКТИВНАЯ РЕПАРАЦИЯ ДНК
Одной из основ поддержания стабильности генома считается эффективная работа систем репарации ДНК. К характерным особенностям генома H. glaber относятся повышенная стабильность его структуры и функционирования, которые сохраняются на протяжении всей жизни. Стабильностью отличается и его белковая система (протеом). Высокая точность трансляции, повышенный уровень экспрессии ключевых шаперонов и постоянно активные про-теасомы в сочетании с высоким уровнем экспрессии A2m способствуют поддержанию в клетках H. glaber пула эффективно функционирующих белков. Экспериментально доказана устойчивость ряда белков H. glaber к денатурирующим воздействиям и их способность сохранять функциональную активность в условиях постоянного окислительного стресса. Все это, а также повышенный уровень экспрессии ряда генов, кодирующих белки репарации, и интенсивность ответа сигнальных путей на повреждение позволяют предполагать, что эффективность работы систем репарации ДНК у H. glaber должна быть высока. С таким предположением согласуются, в частности, результаты исследований, в которых были использованы клетки млекопитающих с различной продолжительностью жизни. Скорость УФ-индуцированного синтеза ДНК в фи-бробластах долгоживущего белоногого (оленьего) хомячка (Peromyscus leucopus) была в 2.5 раза выше, чем скорость синтеза ДНК в фибробластах мыши (Mus musculus) [8]. В фибробластах мутантной мыши-долгожителя (Snell dwarf mice) удаление УФ-повреждений происходит более эффективно, чем в фибробластах мыши с нормальной продолжительностью жизни [9]. Сравнение активности поли(ADP-рибоза)-полимераз (PARP) в моноядерных лейкоцитах крови 13 видов млекопитающих выявило положительную корреляцию между уровнем активности PARP и максимальной продолжительностью жизни, характерной для этих млекопитающих. В частности, активность PARP в клетках человека была в 5 раз выше, чем в клетках крысы. При этом содержание соответствующего белка не отличалось, а отсутствие в условиях эксперимента значимой видоспецифичной деградации полимера
Рис. 2. Стабильный уровень экспрессии белков, стабильный протеом, повышенная интенсивность ответа на повреждение и эффективная репарация ДНК как составляющие устойчивости H. glaber к геноток-сическим воздействиям
поли(ADP-рибозы) позволило исключить искажение результатов оценки активности PARP вследствие работы PARG (поли(ADP-рибоза)-гликогидролаза). Высказано предположение, что более высокая способность к поли(ADP-рибозил)ированию может вносить вклад в эффективное поддержание целостности и стабильности геномов долгоживущих видов [88].
Вполне вероятно, что активность процессов поли(ADP-рибозил)ирования, регулирующего различные механизмы репарации [89], повышена и у экстремально долгоживущего H. glaber, однако экспериментальные доказательства этого факта на сегодняшний день отсутствуют.
Очевидно, что в основе уникальных фенотипиче-ских характеристик H. glaber [90] лежат особенности устройства и регуляции работы его генома и проте-ома.
Для изучения этих особенностей используются модельные системы различной степени сложности с использованием все более широкого набора методов [91]. Недавно в исследовании, проведенном с использованием фибробластов 16 видов млекопитающих, было показано, что для долгоживущих млекопитающих характерен повышенный уровень экспрессии генов, кодирующих белки, имеющие отношение к репарации ДНК [92]. Моделирование и анализ стабильности генных сетей, связывающих возраст, устойчивость к стрессу и замедленное физиологическое старение, показали, что стабильность простейшей модельной генной сети резко возрастает при введении в расчеты такого параметра, как «эффективная репарация». Кроме того, согласно результатам моделирования, вклады в стабильность генной сети процессов репарации ДНК и процессов, обеспечивающих
присутствие в клетке эффективно функционирующих белков («поддержание протеостазиса», «репарация протеома»), в равной степени существенны, а сами эти процессы взаимосвязаны [7].
Можно, таким образом, полагать, что молекулярные «машины», противостоящие накоплению повреждений в геноме Н. дЫЬег, включая механизмы репарации ДНК, функционируют с высокой эффективностью. Мы попытались проиллюстрировать этот вывод схемой, представленной на рис. 2. Однако отсутствие исследований процесса индукции апоптоза при различных генотоксических воздействиях и экспериментальных данных о работе систем репарации
ДНК образует своего рода белое пятно в знаниях о реальном вкладе этих процессов в долголетие и он-корезистентность Н. дЫЬег. Сравнительная оценка функциональной активности систем репарации ДНК представляется в этой связи весьма важной и актуальной задачей. •
Авторы выражают глубокую благодарность академику В.П. Скулачеву за прочтение обзора и ценные замечания.
Работа поддержана Российским научным фондом (грант № 14-24-00038).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Scharer O.D. // Angew. Chem. Int. 2003. V. 42. № 26. P. 2946-2974.
2. Vijg J., Suh Y. // Annu. Rev. Physiol. 2013. V. 75. P. 645-668.
3. Hoeijmakers J.H.J. // N. Engl. J. Med. 2009. V. 361. № 15. P. 1475-1485.
4. Friedberg E.C., Aguilera A., Geliert M., Hanawalt P.C., Hays J.B., Lehmann A.R., Lindahl T., Lowndes N., Sarasin A., Wood R.D. // DNA Repair (Amst.). 2006. V. 5. № 8. P. 986-996.
5. Hanawalt P.C. // Mech. Ageing Dev. 2008. V. 129. P. 503-505.
6. Promislow D.E. // J. Theor. Biol. 1994. V. 170. P. 291-300.
7. Kogan V., Molodtsov I., Menshikov L.I., Reis R.J.S., Fedichev P. // Sci. Repts. 2015. V. 5. № 13589. P. 1-12.
8. Hart R.W., Sacher G.A., Hoskins T.L. // J. Gerontol. 1979. V. 34. P. 808-817.
9. Salmon A.B., Ljungman M., Miller R.A. // J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 2008. V. 63. № 3. P. 219-231.
10. Hanawalt P.C. // Environ. Mol. Mutagen. 2001. V. 38. № 23. P. 89-96.
11. Begall S., Burda H., Schleich C. Subterranean Rodents: News from Underground. Berlin Heidelberg: Springer, 2007.
12. Gorbunova V., Seluanov A., Mao Z., Hine C. // Nucl. Acids Res. 2007. V. 35. № 22. P. 7466-7474.
13. Buffenstein R. // J. Comp. Physiol. B. 2008. V. 178. № 4. P. 439-445.
14. Gorbunova V., Bozzella M.J., Seluanov A. // AGE. 2008. V. 30. № 2. P. 111.
15. Liang S., Mele J., Wu Y., Buffenstein R., Hornsby P.J. // Aging Cell. 2010. V. 9. № 4. P. 626-635.
16. Delaney M.A., Ward J.M., Walsh T.F., Chinnadurai S.K., Kerns K., Kinsel M.J., Treuting P.M. // Vet. Pathol. 2016. V. 53. № 3. P. 691-696.
17. Kim E.B., Fang X., Fushan A.A., Huang Z., Lobanov A.V., Han L., Marino S.M., Sun X., Turanov A.A., Yang P., et al. // Nature. 2011. V. 479. № 7372. P. 223-227.
18. Keane M., Craig T., Alfoldi J., Berlin A.M., Johnson J., Seluanov A., Gorbunova V., Di Palma F., Lindblad-Toh K., Church G.M., et al. // Bioinformatics. 2014. V. 30. № 24. P. 35583560.
19. Yu C., Li Y., Holmes A., Szafranski K., Faulkes C.G., Coen C.W., Buffenstein R., Platzer M., de Magalhas J., Church G.M. // PLoS One. 2011. V. 6. № 11. P. e26729.
20. MacRae S.L., Zhang Q., Lemetre C., Seim I., Calder R.B., Hoeijmakers J., Suh Y., Gladyshev V.N., Seluanov A., Gorbunova V., et al. // Aging Cell. 2015. V. 14. № 2. P. 288-291.
21. Seluanov A., Hine C., Bozzella M., Hall A., Sasahara T.H.,
Ribeiro A.A., Catania K.C., Presgraves D.C., Gorbunova V. // Aging Cell. 2008. V. 7. № 6. P. 813-823.
22. Perez V.I., Buffenstein R., Masamsetti V., Leonard S., Salmon A.B., Mele J., Andziak B., Yang T., Edrey Y., Friguet B., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. № 9. P. 3059-3064.
23. Rubtsova M.P., Vasilkova D.P., Malyavko A.N., Naraikina Y., Zvereva M.I., Dontsova O.A. // Acta Naturae. 2012. V. 4. № 2. P. 44-61.
24. Gomes N.M.V., Ryder O.A., Houck M.L., Charter S.J., Walker W., Forsyth N.R., Austad S.N., Venditt C., Pagel M., Shay J.W., et al. // Aging Cell. 2011. V. 10. № 5. P. 761-768.
25. Gorbunova V., Seluanov A. // Mech. Ageing Dev. 2009. V. 130. № 12. P. 3-9.
26. Evfratov S.A., Smekalova E.M., Golovin A.V., Logvina N.A., Zvereva M.I., Dontsova O.A. // Acta Naturae. 2014. V. 6. № 2. P. 41-47.
27. Hong M.G., Myers A.J., Magnusson P.K., Prince J.A. // PLoS One. 2008. V. 3. № 8. P. e3024.
28. Lewis K.N., Soifer I., Melamud E., Roy M., McIsaac R.S., Hibbs M., Buffenstein R. // Mammalian Genome. 2016. V. 27. P. 259-278.
29. Delsuc F., Tilak M.K. // Genome Biol. Evol. 2015. V. 7. № 3. P. 768-774.
30. Davies K.T., Bennett N.C., Tsagkogeorga G., Rossiter S.J., Faulkes C.G. // Mol. Biol. Evol. 2015. V. 32. № 12. P. 3089-3097.
31. Seluanov A., Hine C., Azpurua J., Feigenson M., Bozzella M., Mao Z., Catania K.C., Gorbunova V. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. № 46. P. 19352-19357.
32. Faulkes C.G., Davies K.T.J., Rossiter S.J., Bennett N.C. // Biol. Lett. 2015. V. 11. № 20150185. P. 1-8.
33. Tian X., Azpurua J., Hine C., Vaidya A., Myakishev-Rempel M., Ablaeva J., Mao Z., Nevo E., Gorbunova V., Seluanov A. // Nature. 2013. V. 499. № 7458. P. 346-349.
34. Manov I., Hirsh M., Iancu T.C., Malik A., Sotnichenko N., Band M., Avivi A., Shams I. // BMC Biol. 2013. V. 11. № 91. P. 1-17.
35. Mullins D.N., Crawford E.L., Khuder S.A., Hernandez D.A., Yoon Y., Willey J.C. // BMC Cancer. 2005. V. 5. P. 141.
36. Haring S.J., Humphreys T.D., Wold M.S. // Nucl. Acids Res. 2010. V. 38. № 3. P. 846-858.
37. Kemp M.G., Mason A.C., Carreira A., Reardon J.T., Haring S.J., Borgstahl G.E.O., Kowalczykowski S.C., Sancar A., Wold M.S. // J. Biol. Chem. 2010. V. 285. № 7. P. 4788-4797.
38. Mason A.C., Roy R., Simmons D.T., Wold M.S. // Biochemistry. 2010. V. 49. № 28. P. 5919-5928.
39. MacRae S.L., Croken M.M., Calder R.B., Aliper A.,
Milholland B., White R.R., Zhavoronkov A., Gladyshev V.N., Seluanov A., Gorbunova V., et al. // Aging (Albany NY). 2015. V. 7. № 12. P. 1171-1184.
40. Christmann M., Kaina B. // Nucl. Acids Res. 2013. V. 41. № 18. P. 8403-8420.
41. Buzdin A.A., Zhavoronkov A.A., Korzinkin M.B., Venkova L.S., Zenin A.A., Smirnov P.Y., Borisov N.M. // Front. Genet. 2014. V. 5. P. 1-20.
42. Abercrombie M. // Nature. 1979. V. 281. № 5729. P. 259-262.
43. Serrano M., Hannon G.J., Beach D. // Nature. 1993. V. 366. № 6456. P. 704-707.
44. Hannon G.J., Beach D. // Nature. 1994. V. 371. № 6494. P. 257-261.
45. Quelle D.E., Zindy F., Ashmun R.A., Sherr C.J. // Cell. 1995. V. 83. № 6. P. 993-1000.
46. Serrano M., Lin A.W., McCurrach M.E., Beach D., Lowe S.W. // Cell. 1997. V. 88. № 5. P. 593-602.
47. Gil J., Peters G. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2006. V. 7. № 9. P. 667-677.
48. Campisi J. // Aging Cell. 2008. V. 7. № 3. P. 281-284.
49. Tian X., Azpurua J., Ke Z., Augereau A., Zhang Z.D., Vijg J., Gladyshev V.N., Gorbunova V., Seluanov A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015. V. 112. № 4. P. 1053-1058.
50. Cowman M.K., Lee H.-G., Schwertfeger K.L., McCarthy J.B., Turley E.A. // Front. Immunol. 2015. V. 6. № 261. P. 1-8.
51. Schwertfeger K.L., Cowman M.K., Telmer P.G., Turley E.A., McCarthy J.B. // Front. Immunol. 2015. V. 6. P. 236.
52. Miyawaki S., Kawamura Y., Hachiya T., Shimizu A., Miura K. // Inflammation Regeneration. 2015. V. 35. № 1. P. 42-50.
53. Miyawaki S., Kawamura Y., Oiwa Y., Shimizu A., Hachiya T., Bono H., Koya I., Okada Y., Kimura T., Tsuchiya Y., et al. // Nat. Commun. 2016. V. 7. P. 11471.
54. Martel C., Batsche E., Harper F., Cremisi C. // Cell Death Differ. 1996. V. 3. P. 285-298.
55. Morgenbesser S.D., Williams B.O., Jacks T., DePinho R.A. // Nature. 1994. V. 371. P. 72-74.
56. Shams I., Malik A., Manov I., Joel A., Band M., Avivi A. // J. Mol. Biol. 2013. V. 425. № 7. P. 1111-1118.
57. Ashur-Fabian O., Avivi A., Trakhtenbrot L., Adamsky K., Cohen M., Kajakaro G., Joel A., Amariglio N., Nevo E., Rechavi G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. № 33. P. 12236-12241.
58. Avivi A., Ashur-Fabian O., Joel A., Trakhtenbrot L., Adamsky K., Goldstein I., Amariglio N., Rechavi G., Nevo E. // Oncogene. 2007. V. 26. № 17. P. 2507-2512.
59. Malik A., Korol A., Weber M., Hankeln T., Avivi A., Band M. // BMC Genomics. 2012. V. 13. P. 1-20.
60. Band M., Ashur-Fabian O., Avivi A. // Cell Cycle. 2010. V. 9. № 16. P. 3347-3452.
61. Salmon A.B., Sadighi A.A., Buffenstein R., Miller R.A. // J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 2008. V. 63. P. 232-241.
62. Labinskyy N., Csiszar A., Orosz Z., Smith K., Rivera A., Buffenstein R. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2006. V. 291. P. 2698-2704.
63. Azpurua J., Ke Z., Chen I.X., Zhang Q., Ermolenko D.N., Zhang Z.D., Gorbunova V., Seluanov A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. V. 110. № 43. P. 17350-17355.
64. Fang X., Seim I., Huang Z., Gerashchenko M.V., Xiong Z., Turanov A.A., Zhu Y., Lobanov A.V., Fan D., Yim S.H., et al. // Cell Reports. 2014. V. 8. № 5. P. 1354-1364.
65. Melen G.J., Pesce C.G., Rossi M.S., Kornblihtt A.R. // EMBO J. 1999. V. 18. № 11. P. 3107-3118.
66. Winnebeck E.C., Millar C.D., Warman G.R. // J. Insect Sci. 2010. V. 10. P. 1-7.
67. McCarthy S.D., Dugon M.M., Power A.M. // Peer J. 2015. V. 3. P. e1436.
68. Ishikawa H., Newburgh R.W. // J. Mol. Biol. 1972. V. 64. № 1. P. 135-144.
69. Fujiwara H., Ishikawa H. // Nucl. Acids Res. 1986. V. 14. № 16. P. 6393-6401.
70. Yadavalli S.S., Ibba M. // Adv. Protein Chem. Struct. Biol. 2012. V. 86. P. 1-43.
71. Nystrom T. // EMBO J. 2005. V. 24. P. 1311-1317.
72. Andziak B., O'Connor T.P., Buffenstein R. // Mech. Ageing Dev. 2005. V. 126. № 11. P. 1206-1212.
73. Kasaikina M.V., Lobanov A.V., Malinouski M.Y., Lee B.C., Seravalli J., Fomenko D.E., Turanov A.A., Finney L., Vogt S., Park, T.J., et al. // J. Biol. Chem. 2011. V. 286. № 19. P. 1700517014.
74. Andziak B., O'Connor T.P., Qi W., DeWaal E.M., Pierce A., Chaudhuri A.R., van Remmen H., Buffenstein R. // Aging Cell. 2006. V. 5. № 6. P. 463-471.
75. De Waal E.M., Liang H, Pierce A., Hamilton R.T., Buffenstein R., Chaudhuri A.R. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2013. V. 434. № 4. P. 815-819.
76. Bhattacharya A., Leonard S., Tardif S., Buffenstein R., Fischer K.E., Richardson A., Austad S.N., Chaudhuri AR. // Aging Cell. 2011. V. 10. № 4. P. 720-723.
77. Andziak B., Buffenstein R. // Aging Cell. 2006. V. 5. № 6. P. 525-532.
78. Новиков Е.А., Кондратюк Е.Ю., Бурда Г. // Зоол. журн. 2015. Т. 94. № 1. С. 119-124.
79. Сорокин А.В., Ким Е.Р., Овчинников Л.П. // Успехи биол. химии. 2009. Т. 49. С. 3-76.
80. Rodriguez K.A., Edrey Y.H., Osmulski P., Gaczynska M., Buffenstein R. // PLoS One. 2012. V. 7. № 5. P. e35890.
81. Rodriguez K.A., Osmulski P.A., Pierce A., Weintraub S.T., Gaczynska M., Buffenstein R. // Biochim. Biophys. Acta. 2014. V. 1842. № 11. P. 2060-2072.
82. Sottrup-Jensen L. // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. № 20. P. 11539-11542.
83. Birkenmeier G., Muller R., Huse K., Forberg J., Glaser C., Hedrich H., Nicklisch S., Reichenbach A. // Exp. Neurol. 2003. V. 184. № 1. P. 153-161.
84. Borth W. // FASEB J. 1992. V. 6. № 15. P. 3345-3353.
85. Isaac L., Florido M.P., Fecchio D., Singer L.M. // Inflamm Res. 1999. V. 48. № 8. P. 446-452.
86. Thieme R., Kurz S., Kolb M., Debebe T., Holtze S., Morhart M., Huse K., Szafranski K., Platzer M., Hildebrandt T.B., et al. // PLoS One. 2015. V. 10. № 6. P. e0130470.
87. Lewis K.N., Wason E., Edrey Y.H., Kristan D.M., Nevo E., Buffenstein R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015. V. 112. № 12. P. 3722-3727.
88. Grube K., Bürkle A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. № 24. P. 11759-11763.
89. Ходырева С.Н., Лаврик О.И. // Молекуляр. биология. 2016. Т. 50. № 4. С. 655-673.
90. Skulachev V.P., Holtze S., Vyssokikh M.Y., Bakeeva L.E., Skulachev M.V., Markov A.V., Hildebrandt T.B., Sadovnichii V.A. // Physiol. Rev. 2017. V. 97. № 2. P. 699-720.
91. Dziegelewska M., Holtze S., Vole C., Wachter U., Menzel U., Morhart M., Groth M., Szafranski K., Sahm A., Sponholz C., Dammann P., Huse K., Hildebrandt T., Platzer M. // Redox Biol. 2016. V. 8. P. 192-198.
92. Ma S., Upneja A., Galecki A., Tsai Y.M., Burant C.F., Raskind S., Zhang Q., Zhang Z.D., Seluanov A., Gorbunova V., et al. // Elife. 2016. V. 5. pii: e19130.
