CC BY
60
Паразиты растений
УДК 632.651
ПОДДЕРЖАНИЕ ИЗОЛЯТОВ ЗОЛОТИСТОЙ КАРТОФЕЛЬНОЙ НЕМАТОДЫ GLOBODERA ROSTOCHIENSIS В ЛАБОРАТОРНЫХ
УСЛОВИЯХ*
О.К. БУТЕНКО, В.Д. МИГУНОВА кандидаты биологических наук А.А. ШЕСТЕПЕРОВ доктор биологических наук
Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии
имени К.И. Скрябина
*Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 07-04-01566
Основополагающие параметры, такие как, растение хозяин, влажность, температура, кислотность и др., для поддержания изолятов золотистой картофельной нематоды Globodera rostochiensis в лабораторных условиях рассматриваются с разных позиций и модификаций существующих методик.
Ключевые слова: Globodera rostochiensis, золотистая картофельная нематода, лабораторные условия.
Золотистая картофельная нематода Globodera rostochiensis уже более ста лет является объектом многостороннего и детального изучения [1-4]. Одной из проблем при ее исследовании является получение чистой культуры G. rostochiensis.
В литературе есть много сведений по выращиванию и поддержанию численности G. rostochiensis в лабораторных условиях [5-15].
В настоящее время наиболее целесообразным при культивировании G. rostochiensis считают применение метода закрытых контейнеров «closed containers» [13]. Метод модифицирован и точно описан Матвеевой [7].
Целью нашей работы было обобщение знаний о методах создания и поддержания культур G. rostochiensis на основе литературных данных.
Общие принципы культивирования нематод растений и почвы. Общие принципы создания и поддержания культуры фитонематод, в т. ч. и G. rostochiensis, сводятся к регулированию физических и химических параметров окружающей среды. Специфические особенности определяются отношениями нематод G. rostochiensis с растением-хозяином - картофелем.
Одним из общих условий культивирования нематод растений является поддержание оптимальной влажности [4], которая для цистообразующей картофельной нематоды составляет 70-80 % от общей влагоемкости почвы [1, 9]. Фитонематоды могут проявлять активность при диапазоне температур от +8 до +50 °С, однако оптимальными для их развития считают температуру +1528 °С [1].
Третьим необходимым условием для успешного культивирования фи-тонематод является нейтральная или кислая реакция культуральной среды
[9].
Особенности культивирования G. rostochiensis. В лабораторных условиях при соблюдении технологических регламентов можно получать по четыре генерации G. rostochiensis в год [1].
Поскольку нематоды G. rostochiensis являются облигатными паразитами растений картофеля, то все специальные методы их успешного культивирования обязательно включают контакт нематод с тканями растения-хозяина - восприимчивых сортов или диких форм Solanum spp. [2]. Выделяемые в почву растениями-хозяевами вещества привлекают особей G. rostochiensis, что вызывает у них активный выход из цист. Самую высокую активность проявляют корневые диффузаты растений картофеля в возрасте до 6 нед [14].
Известны попытки культивирования нематод G. rostochiensis на картофельных клубнях [14]. Для этого маленькие клубни с удаленными глазками разрезали пополам. На срез наливали водную суспензию личинок 2-го возраста. Инвазированные половинки клубней содержали во влажном песке с целью обеспечения развития и размножения нематод.
Наибольшее распространение получили методы культивирования G. rostochiensis на проростках картофеля. От одного клубня картофеля берут 3-4 ростка [7]. Используют проростки 2- и 10-суточного возраста при выращивании на пенистом агаре [12]. С этой целью теплый раствор 4%-ного агара, содержащий 0,01 % стрептомицина, тщательно взбивают до образования пенистой массы с обилием пузырьков.
В последнее время в качестве субстрата для культивирования G. rostochiensis рекомендуют стерильный песок [7, 13]. Можно применять и компост, однако повышение в субстрате доли песка привело к увеличению зараженности растений [6]. Иногда вегетационные сосуды заполняют смесью стерильной почвы и дренажа в соотношении 6 : 1 для снижения плотности почвы [7]. Во время культивирования G. rostochiensis можно использовать вазоны или темные пластиковые мешки с зараженной почвой массой 1-2 кг [9].
Во избежание проникновения света в вегетационные сосуды и резервуары с питательным раствором рекомендуют покрывать их алюминиевой фольгой [8]. До появления всходов растений-хозяев в сосудах песок смачивают водой, после появления всходов воду в резервуаре заменяют питательным раствором.
В случае если сосуды заполняют смесью стерильной почвы и дренажа, то в каждый сосуд добавляют 3 г комплексного удобрения (NPK + микроэлементы), и растения в дальнейшем поливают водой. Если удобрение не используют, то применяют питательный раствор Кнопа, содержащий все элементы минерального питания [7].
В предыдущие годы была рекомендована питательная смесь Роббинса [8] следующего состава:
1) макроэлементы (г/л): MgSO4 - 49,2; K2SO4 - 35,0; KH2PO4 - 13,6; Ca(NOs)2 • 4H2O - 118,0;
2) микроэлементы (мг/л): FeCl3 • 6H2O - 3050; H3PO3 - 2860; ZnSO4 • 7H2O - 220; MnSO4 • 4H2O - 200; CuSO4 • 5H2O - 78; CoCh • 6H2O - 89; Na2MoO4 • 2H2O - 51.
Макроэлементы по очереди растворяют в 1 литре дистиллированной воды. Для приготовления раствора микроэлементов в колбе объемом 1 литр примерно в 0,5л воды растворяют все соли, кроме H3PO3, которую растворяют отдельно в 200 мл воды с нагреванием и прибавляют к раствору, затем его объем доводят до 1 л. Растворы следует хранить отдельно в темноте. Для полива растений из растворов макро- и микроэлементов делают разбавления, для чего на 1 л поливочной воды берут 10 мл приготовленного раствора макроэлементов и 1 мл раствора микроэлементов [8].
Однако в связи с тем, что в экспериментах с фитопаразитическими нематодами в условиях вегетационных опытов необходимо исключать возможность выхода подвижных стадий нематод во внешнюю среду, например в резервуар с питательным раствором, использование вышеописанного метода ограничено.
Условия наиболее полной изоляции нематод G. rostochiensis в вегетационных сосудах реализуются в методике «закрытых контейнеров» [13].
Независимо от используемой методики культивирования, растения заражают личинками изучаемых видов нематод после образования достаточного количества корней. Суспензию инвазионных личинок G. rostochiensis добавляют в ямки на поверхности песка. С этой целью почву сосудов рекомендуют инокулировать суспензией яиц и личинок или «полными» цистами испытуемой популяции картофельной нематоды из расчета 15 яиц и личинок на 1 г субстрата [8, 9].
В сосудах выращивают 1-2 растения картофеля восприимчивых сортов (синеглазка, воротынский ранний, детскосельский, приекульский ранний, красная роза и др.) [9, 10]. Это позволяет поддерживать жизненную активность G. rostochiensis даже при очень низких плотностях популяции (менее одной цисты на 0,5 л).
Таким образом, любая технология культивирования G. rostochiensis в искусственных условиях, включает следующие процессы:
- выращивание растения-хозяина - картофель восприимчивых к заражению сортов или диких форм;
- инвазирование вегетирующих растений нематодами;
- поддержание условий, необходимых для нормального функционирования системы нематоды - растение-хозяин.
По данным Матвеевой, лабораторные исследования, проводимые в закрытых контейнерах и горшечной культуре, позволяют сократить число вариабельных признаков в опыте и более легко оценить коэффициент размножения популяций G. rostochiensis на сортах картофеля [7, 13]. Использование данной методики при изучении паразито-хозяинных отношений, может быть рекомендовано к широкому применению, т. к.:
- позволяет строго контролировать температуру и влажность;
- легка в использовании;
- не требует усилий для поддержания культуры.
Среди особенностей данной методики необходимо отметить, что вегетационные сосуды, используемые для культивирования G. rostochiensis, должны быть прозрачными; цисты G. rostochiensis перед заражением выдерживают в растворе корневых диффузатов картофеля с целью инициации вы-лупления личинок; контейнеры с внесенным инокулюмом G. rostochiensis и
укорененными растениями картофеля плотно закрывают крышкой и помещают в темную камеру.
Матвеева приводит точные параметры создания культуры G. rosto-chiensis по методу «closed containers» [7]. Преимущества данной методики заключаются в следующем:
- методика не требует большой затраты сил на проведение и поддержание эксперимента;
- прозрачные стенки сосудов позволяют следить за ходом развития нематоды. Например, при появлении первых белых самок на корнях растений можно провести исследования популяции нематод (хода развития личинок внутри корней, используя для этого методику прокраски нематод внутри корней кислым фуксином, или выделение самцов из песка для определения половой структуры популяции).
Недостаток этой методики в том, что полученные данные трудно сравнивать с результатами полевых испытаний. Чтобы преодолеть эту проблему, используют горшечный эксперимент для массового скрининга клонов Solanum на устойчивость к G. rostochiensis [7].
Матвеева приводит подробное описание горшечного эксперимента -собственной модификации метода «closed containers». Отличительными особенностями горшечного эксперимента от методики «closed containers» являются использование клубней элиты (миниклубни) или проростков клубней, подготовленных специальным образом; выращивание растений картофеля в пластиковых стаканчиках объемом 250 мл со стерильным песком и питательным раствором Кнопа.
Литература
1. ДеккерХ. Нематоды растений и борьба с ними. - М.: Колос, 1972. - 444 с.
2. Кирьянова Е.С., Краль Э.Л. Паразитические нематоды растений и меры борьбы с ними. - В 2т. - Л.: Наука, 1971. - Т. 1. - 522 с.
3. КостюкН.А. // Тр. ГЕЛАН СССР. - 1968. - Вып. 19. - С. 101-109.
4. Костюк Н.А. // Матер. науч. конф. Всемс. о-ва гельминтол. - 1968. -Ч. 1. - С. 146-149.
5. Костюк Н.А. // Итоги науки. Сер. Биология. Зоология (нематоды растений). - М., 1971. - С. 92-117.
6. Кралль Э.Л. // Итоги науки и техники. Сер. Защита растений. - М.: ВИНИТИ, 1984. - Т. 4. - С. 114-163.
7. Матвеева Е.М. Методика проведения экспериментальных исследований для скрининга сортов картофеля на устойчивость к картофельной цис-тообразующей нематоде (КЦН) / В кн. Паразитические нематоды растений и насекомых. - М.: Наука, 2004. - С. 137-139.
8. Роосма Э.П., Рийспере А.Ю. Метод песчаных культур для проведения опытов с фитопаразитическими нематодами / Методические рекомендации по проведению исследований в фитогельминтологии. - М.: ВАСХНИЛ, 1988. - С. 43-46.
9. Савотиков Ю.Ф., Шестеперов А.А., Тихонова Л.В. Рекомендации по выявлению и мерам борьбы с очагами глободероза картофеля. - М.: Госагро-пром РСФСР, 1986. - 126 с.
10. Migunova V.D., Butenko K.O., Shesteperov A.A. // Russian J. of Nema-tology. - 2005. - V. 13, № 2. - P. 51-52.
11. Myers R.F. // Nematologyca. - 1969. - V.15, № 1. - P. 144-152.
12. Ouden H.D. // Tijd. Prantenzienten. - 1958. - V. 64, № 3. - P. 269-272.
13. Phillips M.S., Forrest J.M.S., Farrer L.A. // Ann. of Applied Biology. -1980. - N 96.
14. Widdowson E. // Nematologica. - 1958. - № 3. - P. 6-14.
15. Williams T.D. // Euphytica. - 1963. - V. 12, № 3. - P. 277-284.
Support of isolates of potato golden nematode Globodera rostochiensis under laboratory conditions
K.O. Butenko, V.D. Migunova, A.A. Shesteperov
The base parameters for support of Globodera rostochiensis - present a host-plant (Solanum spp., potato), soil moisture, temperature, pH and others are discussed. Different recommendations for support of G. rostochiensis under laboratory conditions and modifications of methods are proposed.
Российский паразитологический журнал, 2008, № 4
