УДК 667.272/.276
Цоголакян А.Р., Красноштанова А.А.
ПОДБОР УСЛОВИЙ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ПИГМЕНТОВ ИЗ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ
Цоголакян Анжелика Рубеновна - студентка 3 курса факультета биотехнологии и промышленной экологии; Красноштанова Алла Альбертовна - доктор химических наук, доцент, профессор кафедры биотехнологии; ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева», Россия, Москва, 125480, ул. Героев Панфиловцев, дом 20; aak28@yandex.ru.
В статье рассмотрены различные способы выделения пигментов водорослей для их дальнейшей переработки. Исследовано влияние методов экстракции на качественный и количественный состав пигментов из бурой водоросли. Рассмотрено изменение состава пигментов при сорбции на оксиде алюминия. Ключевые слова: бурые водоросли, пигменты, фукоксантин, экстракция, спектрофотометрия.
SELECTION OF CONDITIONS FOR THE EXTRACTION OF PIGMENTS FROM BROWN ALGAE
Tsogolakyan A.R., Krasnoshtanova A.A.
D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russian Federation
In the article various methods of extraction of algal pigments for their further processing are considered. The influence of extraction methods on qualitative and quantitative composition of pigments from brown algae has been studied. The change in the composition of pigments during sorption on aluminum oxide has been considered. Key words: brown algae, pigments, fucoxanthin, extraction, spectrophotometry
Введение
К отделу Бурые водоросли относятся многоклеточные высокоорганизованные растения. Общее число видов достигает 1500. Распространены они в морях и океанах всего мира, преимущественно в прибрежных мелководьях, но также вдали от берегов, например в Саргассовом море. Некоторые глубоководные виды встречаются на глубине 180200 м. Бурые водоросли - важный компонент бентоса. Для них характерна бурая окраска слоевища - от оливково-желтой до темно-бурой. Это обусловлено смесью разных пигментов: хлорофилла, каротиноидов, фукоксантина. Среди бурых водорослей можно наблюдать эволюцию от микроскопических нитчатых организмов до гигантов, достигающих иногда 30-50 м длины и более [1].
Бурые водоросли представляют медицинскую ценность, богаты минеральными солями и микроэлементами: Fe, V, Zr, Мо, Со, Mg, Са, Мп, а также отличаются большим содержанием йода. Кроме полисахарида альгиновой кислоты, ценными соединениями в составе микроводорослей являются пигменты, каротиноиды, биоактивные молекулы с антиоксидантной, антивирусной и
противоопухолевой активностью [2].
Морские бурые водоросли характеризуются уникальным составом природных биоактивных соединений, которые широко востребованы в различных отраслях, в том числе пищевой и медицинской [3]. Показана перспективность использования бурой водоросли как сырья для выделения пигментов - фукоксантина, фикоэритрина и хлорофилла С. Данные пигменты активно участвуют в процессах фотосинтеза в водорослях и являются резервными белками. Пигменты фикоэритрин, фикоцианин являются безвредными натуральными красителями и представляют интерес
для пищевой и косметической промышленности. Кроме этого, они могут быть использованы в медицине в качестве иммуностимуляторов и при создании новых диагностических препаратов [4]. Фукоксантин - широко распространенный каротиноид, входящий в состав бурых водорослей. Полезные функциональные свойства фукоксантина как биологически активного вещества привлекают к нему внимание ученых. Доказана противоопухолевая активность фукоксантина, его способность к подавлению роста раковых клеток. На его основе производят ряд препаратов, которые применяют при лечении рака прямой кишки, печени и меланомы. Фукоксантин ингибирует рост in vitro клеток нейробластомы человека, рака предстательной железы, рака толстой кишки, лейкоза крови человека
[5].
Цель работы - подбор условий выделения пигментов из бурых водорослей в условиях их дальнейшей глубокой переработки биомассы микроводорослей.
В качестве объекта исследования в работе использовали бурые водоросли рода Fucus Vesiculosus. В работе будут рассмотрены различные пигменты, содержащиеся в бурых водорослях. Все они имеют максимумы поглощения в видимой области спектра, значения которых приведены в табл. 1.
Таблица 1. Максимумы поглощений для пигментов
Пигмент Длина волны (Xmax), нм
фикоэритрин 490, 546, 576
фукоксантин 425,450, 475
фикоцианин 618
хлорофилл a 420, 660
хлорофилл b 435, 643
хлорофилл c 445, 625
Хлорофилл d 450,690
Экспериментальная часть
Для получения пигментов бурых водорослей сначала осуществляли экстракцию этиловым спиртом. Идентификацию проводили спектрофотометрическим методом при разных длинах волн.
На первом этапе исследования были взяты навески сухих водорослей массой по 5г, которые смешивали с этиловым спиртом в различных соотношениях. Экстракцию проводили при 45°С в течение 1 ч и отделяли экстракт от биомассы фильтрованием. Предварительные исследования спектра поглощения спиртового экстракта в диапазоне длин волн от 200 до 700 нм показали, что он характеризуется наличием 2-х пиков - при 400 нм (каротиноиды) и 685 нм (хлорофиллы). Поэтому далее для всех получаемых экстрактов измеряли поглощение именно при этих длинах волн [6]. Данные по влиянию гидромодуля этилового спирта на величину оптической плотности экстрактов при 400 и 685 нм приведены в табл. 2
Таблица 2. Влияние соотношения водоросли: этиловый спирт на оптическую плотность __ экстрактов
Длина волны (X), нм 400 нм 685 нм
Соотношение Оптическая плотность
водоросли:этанол
1:5 0,985 0,5806
1:10 0,0121 0,2750
1:14 0,0209 0,2098
1:20 0,0469 0,1005
По этим данным можно сделать вывод о том, что наибольшее выделение пигментом происходит при соотношении водоросли: этиловый спирт 1:5, которое было выбрано в качестве наилучшего. Меньшее соотношение брать нецелесообразно, поскольку перемешивание такой суспензии крайне затруднено.
Следующим этапом было подбор температуры, которую варьировали в интервале от 25°С до 55°С. Продолжительность экстракции также, как и в предыдущем опыте составила 1 ч. Результаты приведены в табл. 3
Таблица 3. Влияние температуры на оптическую плотность этанольных экстрактов водорослей
Из представленных данных видно, что при увеличении температуры выделение пигментов наиболее эффективно, однако ее повышение выше 50оС нецелесообразно, так как при этом возможна деструкция пигментов.
С целью повышения эффективности процесса экстракции на следующем этапе был опробован метод дезинтеграции биомассы водорослей,
суспендированной в этиловом спирте, с целью извлечения пигментов. В ходе исследований варьировали время обработки. Результаты приведены в табл. 4
Таблица 4. Влияние времени дезинтеграции биомассы
водорослей на выход каротиноидов
Длина волны (X), нм 400 нм
Время, мин Оптическая плотность
0,5 0,4889
1 0,6741
2 0,9205
3 0,9681
5 1,056
По данной таблице можно сделать вывод, что при дезинтеграции на раствор выделяется большее количество пигмента. Однако данный метод нельзя назвать эффективным, так как при этом экстракт загрязняется посторонними примесями, что потребует его дальнейшей очистки от них.
Поэтому в качестве наилучших условий извлечения пигментов были выбраны: водоросли и этиловый спирт в соотношении 1:5, при 45°С в течение 1 ч. Следующим этапом работы было изучение условий разделение пигментов в полученном экстракте. Согласно литературным данным отделить хлорофиллы от каротиноидов возможно путем добавления гексана в щелочной среде. При этом каротиноиды переходят в гексан, а хлорофиллы остаются в спирте. При проведении эксперимента к полученному спиртовому экстракту добавляли гексан в соотношении 0,5:1, 1:1, 2:1, 3:1. Для создания щелочной среды к смеси добавляли несколько капель раствора гидроксида калия. Полученные фракции разделяли в делительной воронке, для каждой фракции определяли оптическую плотность при длинах волн, отвечающих поглощению пигментов и каротиноидов. Полученные результаты приведены в табл. 5. Из полученных данных видно, что данный метод не позволяет эффективно разделять пигменты.
Длина волны (X), нм 400 нм
Температура, °С Оптическая плотность
25 0,1068
40 0,2950
55 0,3450
Таблица 5. Значения оптической плотности этанольной и гексановой фракций экстракта бурых водорослей
Длина волны, нм 618 490 546 576 420 660 435 643 445 625 450 690
Гексан 0,319 0,105 0,062 0,056 0,209 0,005 0,161 0,002 0,153 0,025 0,146 0,002
Спирт 0,141 0,240 0,241 0,0544 1,767 0,874 0,236 0,163 0,174 0,148 0,149 0,169
Далее была проведена оценка эффективности экстракции пигментов ацетоном, поскольку авторами работы [7] доказаны существенные различия в спектрах оптического поглощения ацетонового и водно-ацетонового экстрактов. Соотношение вода-ацетон экстракта взято 1:1. Время инкубации -1 час. Спектр поглощения для полученных экстрактов приведен на Рис.1.
i,* ■
100 450 500 550 600 550 700
Длина ВОЛНЫ, НЛП
Рисунок 1. Спектры оптического поглощения водно-ацетоновых (1) и ацетоновых экстрактов (2).
Как можно видеть, интенсивность полос оптического поглощения и каротиноидных фракций (Х—450 нм), и хлорофилловых (Х—665 нм) водорослей в водно-ацетоновом экстракте выше в сравнении со спиртовым. Однако разделение хлорофилла и каротиноидов в этом случае также не происходит.
На заключительном этапе исследований было исследовано разделение пигментов методом сорбции на оксиде алюминия. Элюцию проводили этиловым спиртом. Было собрано две фракции, для каждой из которых был получен спектр поглощения в видимой области спектра, представленный на Рис. 2. и Рис. 3.
/
t ф а
й N \. /> \
400 450 500 550 600 650 700 ДлИНЗ ВОЛНЫ; нм
Рисунок 2. Спектры поглощения исходного спиртового экстракта водорослей.
400 450 500 550 600 650 700 Длина волны,нм
Рисунок 3. Спектры оптического поглощения фракций, полученных после сорбции на оксиде алюминия - пики фукоксантина и хлорофилла С (!) и фикоэритрина (2).
Из полученных данных видно, что на Рис.2, пики соответствуют: фукоксантину при 425 нм и 450 нм, фикоэритрину при 490 нм и 546 нм и хлорофиллу С при 445 нм и 625 нм.
Из Рис.3 следует, что фракционирование на оксиде алюминия позволяет получить две фракции: фикоэритрина и смеси фукоксантина и хлорофилла С.
Заключение
В результате проведенных исследований можно сделать вывод, что при выделении пигментов наилучшими экстракциями являются спиртовая и водно-ацетоновая. Для разделения уже полученных пигментов наиболее эффективным оказался метод сорбции на оксиде алюминия.
Исследование методов выделения пигментов бурых водорослей из раствора будет предметом дальнейших исследований. Также планируется изучение извлечения из отработанной биомассы водорослей полисахаридов и белков.
Список литературы
1. С. Г. Мамонтов, В. Б. Захаров, Т. А. Козлова; Г., под ред. С. Г. Мамонтов Биология: учебник для студ. высш. учеб. заведений. - 2-е изд. - Москва: Академия, 2008. - 576 с.
2. Биологически активные экстракты из бурых водорослей Laminaria japon^ и их радиационная стабильность / А. А. Ревина [и др.] // Сопроводительная фитотерапия в онкологии : материалы 2-й междунар. науч.-практ. конф., Москва, 23 мая 2015 г. / под ред. В. Ф. Корсуна . - М., 2015. - C. i45-i46.
3. А. В. Подкорытова, А. Н. Рощина, Морские бурые водоросли — перспективный источник БАВ для медицинского, фармацевтического и пищевого применения // ТРУДЫ ВНИРО. 2021 г. Т. 186. № 4. С. i56-i72.doi.org/i0.36038/2307-3497-202i-i86-i56-i72.
4. С. В. Суховерхов Новый подход к получению пигментов из красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis. Изучение влияния температурной обработки и сроков хранения на их качественный и количественный состав // Вестник ТГЭУ. - 2005. - №4. - С. 66-76.
5. Е. Е. Федотова, В. П. Корчагин, Д.. Д. Вингородова Использование бурых водорослей Sargassum Pallidum в качестве сырья для выделения фукоксантина // Известия ТИНРО. - 2020. - №Том 200, вып. 4. - С. 1008-i0i5.
6. Каленик Т.К., Добрынина Е.В., Остапенко В.М., Тори Ясуёши, Хироми Юро Исследование пигментов сине-зеленой водоросли спирулины платенсис для практического использования в технологиях кондитерских изделий // Вестник ВГУИТ. 2019. Т. 81. № 2. С. 170-i76. doi:i0.209i4/23i0-i202-20i9-2-i70-i76
7. Ревина А. А, Тхан Тайк Физико-химические свойства и антиокислительная активность каротиноидов и хлорофиллов из морских водорослей: дис. д-р. физ. хим. наук: 02.00.04. - Москва, 2017. - i5i с.
i77