CC BY
122
УДК 602.3:579.8
DOI 10.18286/1816-4501-2015-3-69-75
ПОДБОР ПЕРСПЕКТИВНОГО ПРОИЗВОДСТВЕННОГО ШТАММА BACILLUS ANTHRACIS ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ФАГОВОГО БИОПРЕПАРАТА
Феоктистова Наталья Александровна, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
Васильев дмитрий Аркадьевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
климушкин Евгений Иванович, аспирант кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина»
432017, г. Ульяновск, б. Новый Венец, 1; 8(8422)55-95-47; e-mail: feokna@yandex.ru
ключевые слова: вирулентный бактериофаг, Bacillus anthracis, биологические свойства, специфичность, литическая активность, спектр литического действия, изменение литической активности при хранении.
В статье представлены результаты исследований по подбору перспективного производственного авирулентного штамма Bacillus anthracis для культивирования специфического вирулентного бактериофага. Установлено, что при культивировании на штамме Bacillus anthracis Шуя-15 литическая активность составляет 1,0х108±0,1х108БОЕ в 1 мл фаголизата; при высеве на мясо-пептонном агаре (МПА) образуются негативные колонии с четким краем и прозрачным центром, что чрезвычайно важно при их визуальном подсчете в случае постановки реакции нарастания титра фага (РНФ).
Введение
Специфическое взаимодействие бактериофагов с бактериальной клеткой-хозя-ином дает непосредственную возможность использовать их для идентификации и индикации бактерий гомологичного вида. В отличие от множества искусственно созданных систем для определения и дифференциации различных структур бактериальных клеток, основанных на использовании антител (серологические реакции различных типов) или на амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР), здесь мы имеем систему, возникшую в ходе эволюции, когда бактериофаг специфически распознает свои рецепторы на бактериальной клеточной стенке, адсорбируется на ней, связываясь исключительно с клетками гомологичного хозяина и дает литическую продуктивную инфекцию [1].
Согласно нормативным документам по лабораторной диагностике сибирской язвы у животных и людей, а также для обнаружения данного возбудителя в сырье животного происхождения и объектах внешней среды ранее использовали ветеринарные биопрепараты: «Бактериофаг сибиреязвенный «К» ВИЭВ» (ТУ 46-21-123-75), «Бактериофаг
сибиреязвенный «Гамма-МВА» (ТУ 46-21181-75), предлагаемые в 60-х годах ХХ века, и ныне применяемые «Бактериофаг ВНИ-ИВВиМ сибиреязвенный диагностический» (ТУ 10-09.39-90), «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий» (ТУ 9386-013-01897080-2009), диагностическая эффективность которых, по мнению авторов, и по настоящий день не подлежит сомнению. Однако выделение новых бактериофагов, специфичных к возбудителю сибирской язвы, и изучение их биологических свойств позволит не только расширить знания в области биологии фагов, но и сконструировать в дальнейшем новый биопрепарат с более широким спектром действия по сравнению с аналогами [2].
В сфере биотехнологии актуальны задачи, связанные с конструированием новых бактериофаговых биопрепаратов и усовершенствованием технологического процесса их изготовления, включая отбор и использование высокочувствительных бактериальных штаммов - продуцентов.
Целью наших исследований был подбор перспективного производственного
штамма B. anthracis для культивирования специфического бактериофага.
Задачи исследований:
- изучение литической активности сибиреязвенного бактериофага на бактериальных штаммах коллекции,
- определение спектра литического действия сибиреязвенного бактериофага на бактериальных штаммах коллекции,
- выявление специфичности действия сибиреязвенного бактериофага на бактериальных штаммах коллекции,
- изучение возможных изменений показателей литической активности сибиреязвенного бактериофага при хранении на потенциально перспективных производственных бактериальных штаммах коллекции.
Объекты и методы исследований
Вакцинные штаммы B. anthracis-СТИ и B. anthracis 55-ВНИИВВиМ, авирулентные штаммы B. anthracis - Шуя-15 и B. anthracis 34 F2, 12 штаммов бактерии B. mycoides, 52 штамма бактерий B. cereus и B. thuringiensis, B. subtilis - 6 штаммов, B. mesentericus (pumi-lus) - 8 штаммов, B. coagulans - 3 штамма, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина».
Сибиреязвенный бактериофаг, выделенный и селекционированный авторами в 2015 году.
Изучение биологических свойств изучаемого бактериофага проводили с использованием методик, апробированных сотрудниками кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина» в ходе собственных многолетних исследований [3-12].
Литическая активность бактериофага и спектр литического действия определяли методом Аппельмана на питательном бульоне для культивирования микроорганизмов (ФС 42-0049-00) (Адамс, 1961), концентрацию фаговых частиц - методом A. Gratia (Gratia, 1936) на двухслойном МПА (производства ФГУН ГНЦ ПМБ г. Оболенск, Московская область). Основные биологические свойства бактериофагов изучали по схеме,
предложенной Золотухиным С.Н. [13].
Контроль специфической активности препаратов бактериофагов проводили с помощью специально подобранных наборов контрольных штаммов. Концентрацию микробных клеток определяли с помощью оптического стандарта мутности (ОСО 4228-85 на 10 ед. производства ГИСК им. Л.А. Тарасевича).
Результаты исследований
Каждая культура B. anthracis, которую мы использовали для подбора перспективного производственного штамма для наработки нового сибиреязвенного бактериофага (вакцинные штаммы B. anthracis-СТИ и B. anthracis 55-ВНИИВВиМ, авирулентные штаммы B. anthracis - Шуя-15 и B. anthracis 34 F2), хранилась в виде столбика мягкого 0,7 % мясо-пептонного агара, засеянного уколом при температуре 2-40С. При данном способе хранения индикаторная культура нуждается в относительно регулярных пересевах 1 раз в 3-4 месяца.
Литическая активность бактериофага определялась методом титрования на жидкой среде (метод Аппельмана) и посевом в верхнем слое мягкого агара (метод агаровых слоев). Посев последовательных разведений фагового препарата с целью повышения точности эксперимента проводили в двух повторностях.
Изучение литической активности методом Аппельмана проводили по следующей схеме: набирали ряд из 12 пробирок, содержащих по 4,5 мл мясо-пептонного бульона (МПБ). В первую из них добавляли сибиреязвенный бактериофаг в количестве 0,5 мл, тщательно перемешивали другой пипеткой и в количестве 0,5 мл переносили в следующую пробирку, из второй - 0,5 мл в третью и т.д. В 10 пробирках сибиреязвенный бактериофаг разводили 1:10; 1:100; 1:1000 и т.д. до 10-10 (из этой пробирки после перемешивания выливали 0,5 мл разведения с целью соблюдения количественного единства в эксперименте). В 11 пробирок, включая и контроль культуры, содержащих только 4,5 мл МПБ, вносили 0,2 мл суточной культуры анализируемых бактериальных культур, в 12 пробирку с 4,5 МПБ добавляли только 0,5
мл сибиреязвенного бактериофага, затем ставили все 12 пробирок в термостат при показателях температуры 370С, после чего учитывали результаты через 18 часов культивирования.
Учет вели в титрах, вызывающих пол-ныи лизис бактериальной культуры и в процентах, сопоставляя суммарное количество баллов в опытной и контрольной пробах.
За титр бактериофага при определении методом Аппельмана принимали то наибольшее разведение его, которое вызывает полный лизис соответствующих микроорганизмов - B. anthracis.
Результаты исследований представлены в табл. 1.
Литическую активность выделенных бактериофагов оценивали также по их способности вызывать лизис бактериальной культуры на плотной питательной среде методом агаровых слоев. Накануне опыта по чашкам Петри разливали 1,5%-ный мясо-пептонный агар (МПА) в ламинарном боксе. Перед использованием чашки дополнительно подсушивали в термостате при 370С 15-20 минут. Индикаторную культуру выращивали в условиях термостата в течение 18-20 часов при 370С на МПБ. Стерильный 0,7% МПА, разлитый в пробирки по 2,5 мл, расплавляли на водяной бане и остужали до 46-480С. Затем в пробирку с 2,5 мл 0,7%-ного МПА вносили 0,2 мл индикаторной культуры и 0,2 мл бактериофага разведений бактериофага, приготовленных следующим образом (на-
бирается ряд из 10 пробирок, содержащих по 4,5 мл МПБ; в первую из них добавляется сибиреязвенный бактериофаг в количестве 0,5 мл, тщательно перемешивается другой пипеткой и в количестве 0,5 мл переносится в следующую пробирку, из второй - 0,5 мл в третью и т.д. В серии пробирок бактериофаг разводится 1:10; 1:100; 1:1000 и т.д. до 1010 (из этой пробирки после перемешивания выливаем 0,5 мл разведения с целью соблюдения количественного единства в эксперименте).
Содержимое каждой пробирки с 0,7%-ным МПА, 02 мл фага и 0, 2 мл индикаторной культуры быстро и тщательно перемешивали вращением в ладонях и выливали на поверхность 1,5%-ного МПА. Смесь осторожными движениями распределяли по поверхности МПА, чашки Петри оставляли на горизонтальной поверхности стола до полного застывания верхнего слоя МПА, затем инкубировали посевы в термостате при 370С в течение 18 часов.
Результаты исследований представлены в таблице 1 и на рисунках 1-3.
Важной характеристикой изучаемого бактериофага B. anthracis является спектр литического действия в пределах вида. Для изучения данного показателя использовали 4 штамма бактерий B. anthracis. Применялась методика «стекающая капля» (рисунок 4). На чашку Петри с накануне разлитым в нее 1,5%-ным МПА наносили газон исследуемой культуры (B. anthracis-СТИ, B. anthracis 55-ВНИ-
Рис. 1 -Формирование негативных колоний сибиреязвенного бактериофага на B. anthracis 34 F2
oil
lilii
eon
ИВВиМ, B. anthracis Шуя-15 и B. anthracis 34 F2). Бактериальный газон подсушивали в условиях термостата в течение 20-30 минут при 370С. Затем чашку Петри с подготовленным газоном делили на два сектора: «опытная» дорожка и контроль на механическое повреждение газона. На «опытную» дорожку наносили по 1-2 капли исследуемого сибиреязвенного бактериофага, на «контрольную» дорожку - стерильный МПБ в том же количестве, что и сибиреязвенный бактериофаг.
Посевы помещали в термостат на 18 часов инкубации при 370С. Опыт демонстрирует (табл. 1), что спектр литического действия изучаемого сибиреязвенного бактериофага на четырех штаммах составляет 100 %.
Важнейшей характеристикой бактери-
офага, составляющего биопрепарата для индикации и идентификации бактерий, является его специфичность в пределах вида. Изучение специфичности выделенного бактериофага B. anthracis мы проводили на культурах гомологичного рода: B. mycoides - 12 штаммов, B. ce-reus - 50 штаммов, B. thuringiensis - 2 штамма, B. subtilis - 6 штаммов, B. mesentericus (pumi-lus) - 8 штаммов, B. coagulans- 3 штамма. Наиболее важной, по мнению авторов, характеристикой выделенного и селекционированного сибиреязвенного фага была специфичность по отношению к штаммам B. anthracis и отсутствие способности лизировать культуры B. mycoides, B. cereus, B. thuringiensis, которые составляют группу близкородственной ассоциации бацилл, получивших в литературе название «группа «Bacillus cereus»» [10,14].
Исследования проводили методом нанесения фага на газон бактериальной культуры методом «стекающая капля». Экспериментальным путем нами установлено, что на чашках Петри, засеянных культурами Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mesentericus (pumilus), Bacillus coagulans, зон лизиса при нанесении выделенного и селекционированного нами сибиреязвенного фага на газон вышеназванных культур при визуальном осмотре обнаружено не было. Полученные результаты свидетельствуют, что выделенный и селекционированный нами бактериофаг строго специфичен в пределах вида B. anthracis и может составлять биопрепарат для индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы.
Опытным путем установлено, что в течение 3 месяцев показатели литической активности исследуемого бактериофага осталась без изменений, на штамме Bacillus anthracis Шуя-15 - 1,0х108±0,1х108 БОЕ в 1 мл фаголизата, на штамме Bacillus anthracis 55-ВНИИВВиМ -1,9х106±0,1х106 БОЕ в 1 мл фаголизата, на штамме Bacillus anthracis-СТИ - 1,4х107±0,1х107 БОЕ
\
Рис. 4 - Метод определения спектра литического действия «стекающая капля» сибиреязвенного бактериофага на B. anthracis Шуя-15
в 1 мл фаголизата, на штамме Bacillus anthracis 34 F2 - 3,0х108±0,1х108 БОЕ в 1 мл фаголизата. Исследования сибиреязвенного бактериофага, укупоренного в стерильные флаконы без добавления консерванта, который хранился в условиях бытового холодильника (2-40С), про-
таблица 1
основная характеристика биологических свойств изучаемого сибиреязвенного бактериофага
№ Название изучаемого биологического свойства бактериофага Результат изучения характерных биологических свойств сибиреязвенного бактериофага на бактериальной культуре
В. anthracis Шуя-15 B. anthracis 55-ВНИИВВиМ B. anthracis-СТИ B. anthracis 34 F2
1 Литическая активность, БОЕ (бляшкообразующих единиц) / мл (по методу агаровых слоев) 1,0х108± 0,1х108 1,9х106± 0,1х106 1,4х107± 0,1х107 3,0х108± 0,1х108
2 Литическая активность(по методу Аппельмана) 10-7 10-5 10-6 10-7
3 Спектр литического действия Лизис культур - B. anthracis-СТИ, B. anthracis 55-ВНИИВВиМ, B. anthrads-Шуя-15 и B. anthracis 34 F2
4 Специфичность Не лизирует - B. mycoides - 12 штаммов, B. cereus - 50 штаммов, B. thuringiensis - 2 штамма, B. subtilis - 6 штаммов, B. mesentericus (pumilus) - 8 штаммов, B. coagulans - 3 штамма.
5 Показатель литической активности при хранении в условиях бытового холодильника 2-4 0С в течение 3 месяцев 1,0х108± 0,1х108 1,9х106± 0,1х106 1,4х107± 0,1х107 3,0х108± 0,1х108
водили методом агаровых слоев (табл.1).
Выводы
Проведенные исследования по изучению основных показателей биологических свойств сибиреязвенного бактериофага позволили установить, что изучаемый бактериофаг при культивировании на различных штаммах B. anthracis имеет литическую активность, которая не изменяется при хранении в условиях бытового холодильника (2-40С) без добавления консерванта. На основании полученных данных установлено, что для достижения поставленной цели в качестве перспективного производственного штамма рекомендовано применять штамм B. anthracis Шуя-15, на котором при высеве на МПА образуются негативные колонии с четким краем и прозрачным центром, что чрезвычайно важно при визуальном подсчете колоний в случае постановки реакции нарастания титра фага. Культивирование изучаемого бактериофага на вышеназванном штамме дает литическую активность - 1,0х108±0,1х108 БОЕ в 1 мл фаголизата. При аналогичных исследованиях показатель на штамме B. anthracis 34 F2 составляет 3,0х108±0,1х108 БОЕ в 1 мл фаголизата. Однако визуальная характеристика негативных колоний, полученных на индикаторной культуре данного бактериального штамма, возможно, затруднит оценку результатов в РНФ. Поэтому применение штамма B. anthracis 34 F2 в качестве перспективного и производственного возможно при условии сравнения показателей в случае постановки РНФ на обоих штаммах.
Показатели использования двух остальных вакцинных сибиреязвенных штаммов для указанной нами цели выявили их недостаточность.
Установлено, что выделенный и селекционированный нами бактериофаг строго специфичен в пределах вида B. anthracis и не лизирует культуры B. subtilis, B. mycoi-des, B. megaterium, B. cereus, B. thuringiensis, B. mesentericus (pumilus), B. coagulans. Выше названные характеристики сибиреязвенного бактериофага, выделенного и селекционированного авторами в 2015 году, свидетельствуют, что он может быть использован для конструирования биопрепарата по фагоинди-
кации и фагоидентификации бактерий Bacillus anthracis.
Полученные данные расширяют представление о методических подходах к конструированию и изготовлению фаговых препаратов. Они включают подбор перспективного производственного бактериального штамма из коллекции штаммов-проду-центов по репродукции бактериофагов при сохранении их основных биологических свойств, требуемых при использовании РНФ. Практическая значимость работы определяется разработанными эффективными микробиологическими и технологическими приемами, позволяющими адаптировать процессы изготовления бактериофага к условиям массового производства биопрепаратов. Создание нового комплексного фагового препарата расширяет арсенал антибактериальных сибиреязвенных средств.
Научные исследования проводятся при финансовой поддержке государства в лице Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (программа «УМНИК»).
Библиографический список
1. Бакулов, И.А. Сибирская язва (антракс). Новые страницы в изучении «старой» болезни / И.А. Бакулов, В.А. Гаврилов,
B. В. Селиверстов. - Владимир, Изд-во. «Посад», 2001. -281 с.
2. Биологические свойства сибиреязвенного бактериофага / Н.А. Феоктистова, Е.И. Климушкин, Д.А. Васильев, К.В. Белова // Вестник ветеринарии. - 2015. - № 3 (74). -
C. 46-49.
3. Калдыркаев, А.И. Разработка системы фаговаров бактерий Bacilluscereus для идентификации и мониторинга данного микроорганизма / А.И. Калдыркаев, Н.А. Феоктистова, А.В. Алешкин // Бактериофаги микроорганизмов значимых для животных, растений и человека. - Ульяновск, НИИЦ-МиБ,2013. - С. 211-225.
4. Характеристика биологических свойств бактериофагов вида Bacillus subtilis / Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, И.Н. Хайруллин, Н.А. Феоктистова, А.И. Калдыркаев, М.А. Юдина, А.Х. Мустафин // Вестник Улья-
новской государственной сельскохозяйственной академии. - 2011. - № 1. - С. 79-83.
5. Садеева, Н.Т. Выделение фагов бактерий вида Bacilluscereus / Н.Т. Садеева, Е.В. Меркулова, Н.А. Феоктистова, М.А. Юдина [и др.] // В сборнике: Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии: материалы V-й Всероссийской (с международным участием) студенческой научной конференции. - Ульяновск: ГСХА, 2012. - С. 14-17.
7. Феоктистова, Н.А. Методы выделения бактериофагов рода Bacillus / Н.А. Феоктистова, В.А. Макеев, М.А. Юдина, А.И. Кал-дыркаев // Вестник ветеринарии. - 2011.- № 4 (59). - С. 88-89.
8. Феоктистова, Н.А. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов бактерий Bacillus subtilis / Н.А. Феоктистова / В книге: «Бактериофаги микроорганизмов значимых для животных, растений и человека». - Ульяновск, НИИЦ-МиБ, 2013. - С. 186-197. (315 с.)
9. Феоктистова, Н.А. Распространение Bacillus cereus и Bacillus mycoides в объектах санитарного надзора / Н.А. Феоктистова, А.И. Калдыркаев, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2014. - № 1 (25). - С. 68-76.
10. Биосенсорная детекция бактерий рода Bacillus в молоке и молочных продуктах
для предупреждения их порчи / Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, Н.А. Феоктистова, А.В. Алешкин // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.
- 2013. - №4 (24). - С. 36-43.
11. Феоктистова, Н.А. Разработка схемы исследования материала с целью выделения и ускоренной идентификации бактерий видов Bacillussubtilis и Bacilluscereus / Н.А. Феоктистова, А.И. Калдыркаев, А.Х. Мустафин // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. - 2011.
- Т. 4. - № 32-1. - С. 288-290.
12. Юдина, М.А. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов бактерий вида Bacillus mesenteri-cus/ М.А. Юдина, Н.А. Феоктистова // Бактериофаги микроорганизмов значимых для животных, растений и человека. - Ульяновск, НИИЦМиБ, 2013. - С. 197-211.
13. Золотухин, С.Н. Создание и разработка схем применения диагностических биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий: автореф. дисс. .. д -ра биологических наук / С.Н. Золотухин. - Ульяновск, 2007. - 39 с.
14. Васильев, Д.А. Бактериофаги рода Bacillus: монография / Д.А. Васильев, Н.А. Феоктистова, С.Н. Золотухин, А.В. Алешкин
- Ульяновск, УГСХА им. П. А. Столыпина, НИИЦМиБ, 2013. - 80 с.
