CC BY
102
Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. - 2010. - Вип. 18, т. 1. - С. 15-19. Visnyk ofDnipropetrovsk University. Biology. Ecology. - 2010. - Vol. 18, N 1. - P. 15-19.
УДК 579.852.11:632.937
О. А. Дрегваль, Н. В. Черевач, А. І. Вінніков
Дніпропетровський національний університет ім. Олеся Гончара
ПІДБІР ОПТИМАЛЬНИХ РЕЖИМІВ КИСЛОТНОСТІ СЕРЕДОВИЩА ТА АЕРАЦІЇ ПРИ ГЛИБИННОМУ КУЛЬТИВУВАННІ
BACILLUS THURINGIENSIS ТА BEAUVERIA BASSIANA
Досліджено вплив кислотності середовища та інтенсивності аерації на ріст та спороутворення Bacillus thuringiensis та Вeauveria bassiana - основних компонентів комплексного мікробного інсектицидного препарату «Бактофунгін». Оптимальним значенням початкового pH середовища для B. thuringiensis є 7,0, для В. bassiana - 6,0-7,0. Максимальна продуктивність досліджуваних мікроорганізмів спостерігалась в одному діапазоні аерації - 7-14 ммоль О2/л/год. Підібрані умови культивування необхідні для отримання комплексного біопрепарату на основі асоціації B. thuringiensis та В. bassiana.
О. А. Дрегваль, Н. В. Черевач, А. И. Винников
Днепропетровский национальный университет им. Олеся Гончара
ПОДБОР ОПТИМАЛЬНЫХ РЕЖИМОВ КИСЛОТНОСТИ СРЕДЫ И АЭРАЦИИ ПРИ ГЛУБИННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ
BACILLUS THURINGIENSIS И BEAUVERIA BASSIANA
Изучено влияние кислотности среды и интенсивности аэрации на рост и спорообразование Bacillus thuringiensis и Вeauveria bassiana - основных компонентов комплексного микробного инсектицидного препарата «Бактофунгин». Оптимальным значением начального pH среды для B. thuringiensis является 7,0, для В. bassiana - 6,0-7,0. Максимальная продуктивность исследуемых микроорганизмов наблюдалась в одном диапазоне аэрации - 7-14 ммоль О2/л/ч. Подобранные условия культивирования необходимы для получения комплексного биопрепарата на основе ассоциации B. thuringiensis и В. bassiana.
O. A. Dregval, N. V. Cherevach, A. I. Vinnikov
Oles’ Honchar Dnipropetrovsk National University
SELECTION OF OPTIMUM CONDITIONS OF MEDIUM ACIDITY AND AERATION FOR SUBMERGET CULTIVATION OF BACILLUS THURINGIENSIS AND BEAUVERIA BASSIANA
The paper deals with the influence of medium pH and aeration rate on growth and sporulation of Bacillus thuringiensis and Вeauveria bassiana, which are main constituents of the complex microbial insecticide. It was established optimal medium pH for B. thuringiensis - 6.0 and for В. bassiana - 6.0-7.0. The maximum productivity of the studied microorganisms was observed in the same range of aeration - 714 mmol Oyl/h. The selected conditions of cultivation are necessary for the production of complex biological insecticide based on the association of B. thuringiensis and B. bassiana.
© О. А. Дрегваль, Н. В. Черевач, А. І. Вінніков, 2010
Вступ
Найбільш розповсюджені мікроорганізми, яких використовують як засоби боротьби з комахами-шкідниками - ентомопатогенні бактерії Bacillus thuringiensis та гриби Вeauveria bassiana. Промислове культивування B. thuringiensis направлене на отримання високого виходу спорокристалічного комплексу, а В. bassiana - на отримання конідій (при поверхневому способі культивування) чи бластоспор (при глибинному культивуванні), що визначає інсектицидну активність препаратів. Перевагу віддають глибинному культивуванню, оскільки накопичення спорового матеріалу відбувається за короткий час і дозволяє легко підтримувати стерильність виробництва [3]. Крім складу живильного середовища велике значення для росту та спороутворення мікроорганізмів мають інтенсивність аерації та початкове значення рН живильного середовища.
Відомо, що В. thuringiensis належить до факультативних анаеробів. Літературні дані стосовно потреб у кисні на різних стадіях культивування цих бактерій неоднозначні. За даними одних авторів, відбувається різке збільшення газообміну на початку експоненціальної стадії росту [і], за іншими - під час спороутворення використовується більше кисню, ніж в експоненціальній фазі [4]. Деякі автори пропонують підтримувати інтенсивність аерації на постійному рівні протягом усього процесу культивування [іі], хоча існують і технології східчастих режимів, коли аерацію змінюють залежно від потреб культури у кисні [і; 4]. Відносно початкового рН живильного середовища відомо, що для бактерій групи В. thuringiensis воно повинно знаходитись у діапазоні 6,5-7,3, але повідомлялось про існування кислотостійких варіантів штамів, які добре ростуть при рН 5,2-6,0 [7; 9]. Із літературних джерел відомо, що збудник білої мускардини B. bassianct - аеробний організм, проте вплив аерації на накопичення бластоспор при глибинному культивуванні досліджено недостатньо. Більшість штамів цих грибів ростуть у діапазоні рН від 5,0 до 8,0 з оптимумом у кислій області (5,0-5,6), але існують штами, для яких оптимальним значенням рН є 6,0-7,0 [5; S; 10].
Мета даної роботи - підібрати оптимальні значення початкового рН середовища та інтенсивність аерації при глибинному культивуванні B. thuringiensis та B. bassiam -продуцентів комплексного інсектицидного біопрепарату «Бактофунгін».
Матеріал і методи досліджень
У роботі використовували штами ентомопатогенних бактерій B. thuringiensis В-10 (ІМВ В-7186) та грибів В. bassiana F-6 (ІМВ F-100043) із колекції культур мікроорганізмів кафедри мікробіології та вірусології ДНУ ім. Олеся Гончара. Бактерії та гриби вирощували в середовищі такого складу (%): зелена патока - 1,5, кукурудзяний екстракт - 1,3, гумат - 0,44, (NH4)2HPO4 - 0,232, K2HPO4 - 0,051. Початкове значення рН середовища встановлювали додаванням розчинів соляної кислоти або лугу. Вимірювання рН проводили за допомогою мілівольтметра (рН-121). Значення рН, що досліджували: 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0. Інтенсивність надходження кисню змінювали за допомогою вирощування у різному об’ємі живильного середовища в конічних колбах на 500 мл і балонах на і л. Ступінь аерації оцінювали сульфітним методом [6]. Засів B. thuringiensis здійснювали нічною бульйонною культурою в кількості і x 107 кл./мл, В. bassiana - рідинною культурою, отриманою на глюкозо-крохмальному живильному середовищі у кількості і x 106 бластоспор/мл. Бактерії та гриби вирощували на мікробіологічній качалці (200 об./хв.) при температурі +2S °С. Концентрацію клітин B. thuringiensis визначали за допомогою методу нефелометрії на 22-24-й годині культивування. Вимірювали оптичну густину суспензій бактерій на фотоелектроколори-
16
метрі КФК-2МП при 540 нм, кількість клітин у 1 мл визначали за калібрувальним графіком. Відсоток ендоспор у культуральній рідині на кінець культивування визначали за допомогою мікроскопічного дослідження фіксованих і пофарбованих карболовим фуксином мазків. Кількість бластоспор В. Ъаъъгапа в 1 мл культуральної рідини визначали підрахунком в камері Горяєва на третю та четверту добу вирощування. У кінці культивування вимірювали рН культуральної рідини.
Результати та їх обговорення
При початковому рН 4,0 ріст В. thuringiensis В-10 пригнічувався, ендоспори не утворювались (рис. 1а). При рН 5,0 відзначалось пригнічення росту протягом першої доби культивування, спороутворення починалось тільки через 40 год., а закінчувалося лише через 72 год., тоді як при рН 6,0-8,0 диференціація відбувалась у звичайний для цієї культури термін (20-48 год.). Слід зазначити, що досліджуваний штам виявився відносно кислотостійким, що пов’язано з підлуговуванням середовища у процесі росту культури до рН 5,8 при початковому 5,0 та до 6,7 при початковому 6,0.
4 5 6 7 3
g Значення початкового pH
Рис. 1. Вплив початкового pH живильного середовища на накопичення клітин B. thuringiensis (а) та бластоспор B. bassiana (б)
Осадча зі співавторами [7] також повідомляли про існування кислотостійких варіантів штаму B. thuringiensis - продуцента біопрепарату «Бактокуліцид», які добре розвивалися при рН 5,2-6,0. Автори цієї роботи відмічали повніше використання основних компонентів живлення, збільшення виходу біомаси, синхронність спороутворення, високий вихід спорокристалічного комплексу при вирощуванні кислотостійких варіантів
17
у середовищі з кислим початковим значенням рН. У наших дослідженнях оптимальним рН для В. thuringiensis В-10 виявилось значення 7,0, при якому відбувалося найбільше накопичення клітин і повніший процес спороутворення. Утворення бластоспор В. Ъassianа Б-6 відзначалося в усьому досліджуваному діапазоні рН (рис. 16).
Кислі середовища гриб підлуговував, наближаючи значення рН до нейтрального, у нейтральному середовищі підлуговування було незначним, а в лужному відбувалося невелике підкислення. Оптимум рН для В. Ъassianа перебував у діапазоні 6,0-7,0, оскільки при цих значеннях кислотності утворювалося найбільше бластоспор.
Дослідження впливу інтенсивності аерації на ріст та спороутворення В. thuringiensis показало, що бактерії здатні рости в усьому діапазоні, який вивчався (565 ммоль О/л/год.), але найбільша продуктивність культури відмічалася при вирощуванні від 7 до 14 ммоль О2/л/год. (рис. 2а).
5 7 9 14 16 21 65
Інтенсивність аерації, ммоль Ог/л/год
9,4
3.6
*
і------------------------------г~
б
9 14 16 21 65
Інтенсивність аерації, ммоль О^/п/тод,
Рис. 2. Вплив інтенсивності аерації на накопичення клітин B. thuringiensis (а) та бластоспор B. bassiana (б)
Подальше збільшення інтенсивності аерації дещо знижувало накопичення клітин бактерій. Подібне явище спостерігали Ігнатенко зі співавторами при вирощуванні B. thuringiensis subsp. galleriae при рівні аерації вище 60 мг О2/л/хв. (112 ммоль О2/л/год.) [2]. Спороутворення B. thuringiensis В-10 відмічалось у всьому діапазоні аерації на рівні 93,0-95,2 %. Накопичення бластоспор B. bassiarn в процесі культивуван-
а
ня відмічалось у всьому досліджуваному діапазоні аерації (рис. 2б). Найбільша продуктивність культури відмічалась при вирощуванні від 7 до 14 ммоль О2/л/год. Вищі рівні аерації (21 і 65 ммоль О2/л/год.), як і нижчі (5 ммоль О2/л/год.), знижували накопичення бластоспор.
Висновки
Оптимальним значенням початкового рН середовища для культивування штаму Bacillus thuringiensis В-10 (ІМВ В-71Б6) є 7,0, для Вeauveria bassiarwwi F-6 (ІМВ F-100043) -6,0-7,0. Найбільша продуктивність досліджуваних бактерій і грибів спостерігається в одному діапазоні аерації - 7-14 ммоль О2/л/год. Установлені параметри культивування необхідні для отримання комплексного біоінсектицидного препарату на основі асоціації B. thuringiensis та В. bassiana.
Бібліографічні посилання
1. Влияние интенсивности массообмена по кислороду на рост Bacillus thuringiensis var. dendrolimus / В. И. Огарков, В. С. Муратов, А. А. Мялкин и др. // Биотехнология. - 19S9. -Т. 5, № 2. - С. 164-167.
2. Влияние температуры и аэрации на рост и спорообразование Bacillus thuringiensis / Ю. Н. Игнатенко, З. В. Сахарова, М. П. Ховрычев и др. // Микробиология. - 19S3. - Т. 52, вып. 5. - С. 716-71S.
3. Волова Т. Г. Биотехнология. - Новосибирск : Изд-во СО РАН, 1999. - 252 с.
4. Оптимизация условий аэрации в процессе культивирования Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki шт. z-52 с использованием интегральной квазидинамической модели / В. В. Лаврикова, В. А. Ириков, Т. Г. Юдина и др. // Биотехнология. - 1992. - № 2. - С. 61-65.
5. Пат. 21725SS Российская Федерация, МПК7 A01N63/04, C12N1/14, C12N1/14, C12R1:645. Штамм гриба Beauveria bassiana (Bals) Vuill ВКМ F-3732D, используемый для получения эн-томопатогенных препаратов / А. И. Пахтуев, Б. В. Прилепский, Ф. Н. Чегодаев; заявитель и патентообладатель Бердский завод биологических препаратов. - № 2000133361/13; заявл. 27.12.2000, опубл. 27.0S.2001.
6. Практикум по микробиологии / Под ред. Н. С. Егорова. - М. : Изд-во Моск. ун-та, 1976. -307 с.
7. Рост и развитие продуцента бактокулицида в зависимости от рН среды / А. И. Осадчая, В. С. Подгорский, С. Ф. Прокопченко и др. // Микробиол. журн. - 1990. - Т. 52, № 1. - С. 24-27.
S. Doundji-Mtiche B. Effect of some physicochemical and nutritional factors on the mycelium growth
and sporulation of entomopathogenic fungus Beauveria bassiana / B. Doundji-Mtiche, F. Z. Bissaad // Ninth Arab Congress of Plant Protection, 19-23 November 2006, Damascus, Syria. - Р. 202.
9. Icgen Y. Regulation of crystal protein biosynthesis by Bacillus thuringiensis: I. Effects of mineral elements and pH / Y. Icgen, B. Icgen, G. Ozcengiz // Res. Microbiol. - 2002. - Vol. 153, N 9. -P. 599-604.
10. Karthikeyan A. Effect of different media and pH on the growth of Beauveria bassiana and its parasitism on eating Caterpillars / A. Karthikeyan, V. Shanthi, A. Nagasathya // Research Journal of Agriculture and Biological Scinces. - 200S. - Vol. 4, N 2. - Р. 117-119.
11. Scale-up approach for fermentation process of production of Bacillus thuringiensis var. kenyae based biopesticide / R. G. Muley, S. Sarkar, B. L. Bhan et al. // J. Sci. and Ind. Res. - 1999. - Vol. 5S, N 10. -P. 7S1-7S4.
Надійшла до редколегії 29.06.2010
