CC BY
310
ISSN 0202-5493. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ.
УДК 633.854.78:632.4
Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных
ПОДБОР ОПТИМАЛЬНОЙ МЕТОДИКИ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ МИЦЕЛИЯ ГРИБОВ
РОДА ALTERNARIA ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР
культур. Вып. 2 (159-160), 2014
С.А. Рамазанова,
кандидат биологических наук
М.В. Ивебор,
кандидат сельскохозяйственных наук
С.Л. Саукова,
кандидат биологических наук
Н.М. Арасланова,
кандидат сельскохозяйственных наук
Т.С. Антонова,
доктор биологических наук
Россия, 350038, г. Краснодар, ул. им. Филатова, д. 17
Тел.: (861) 275-86-53
E-mail: ramazanov1969@mail.ru
Ключевые слова: Alternaría Nees, выделение ДНК, молекулярные маркеры, ISSR, ПЦР
Выполнено сравнение разных методик выделения ДНК из мицелия грибов рода Alternaría Nees, выращенного на разных питательных средах. Установлено, что оптимальным является выделение ДНК при помощи коммерческого набора реагентов QIAGEN Dnseay Plant MiniKit (Германия). Пригоден также модифицированный метод M.E. Zolan and P.J. Pukkila (1986) с добавлением АЪОэ на стадии гомогенизации. Выделены шесть ISSR-праймеров, инициирующих амплификацию полиморфных фрагментов ДНК у видов Alternaría Nees, встречающихся на подсолнечнике в Краснодарском крае. Эти ISSR-локусы могут быть использованы для изучения меж- и внутривидовой изменчивости грибов рода Alternaría.
UDC 633.854.78:632.4
Choice of optimal methodology for DNA isolation from mycelium of Alternaría species for PCR Ramazanova S.A., candidate of biology Ivebor M.V., candidate of agriculture Saukova S.L., candidate of biology Araslanova N.M., candidate of agriculture Antonova T.S., doctor of biology
FGBNU VNIIMK
17, Filatova str., Krasnodar, 350038, Russia Tel.: (861) 275-86-53 ramazanov 1969@mail.ru
Key words: Alternaría Nees, DNA isolation, molecular markers, ISSR, PCR
The different methods of DNA isolation from mycelium of fungi of Alternaría Nees species cultivated on different mediums were compared. The optimal appeared to be DNA isolation by means of commercial reagents QIAGEN Dnseay Plant MiniKit (Germany). The method of Zolan and Pukkila (1986) modified with application of AbO3 at the stage of ho-mogenization is also suitable. There are isolated six ISSR-primers initiating amplification of polymorphous DNA fragments in Alternaría Nees species which are observed on sunflower in Krasnodar region. These ISSR-loci can be used for studying of inter- and intraspecific variability of fungi of Alternaría species.
Род Alternaría Nees представляет собой большую и разнообразную по биологическим характеристикам группу микромице-тов, многие из которых распространены очень широко. В частности, описаны 11 видов этого рода, паразитирующих на подсолнечнике, способных инфицировать как растения, так и семена [1; 2]. Идентификация многих видов Alternaría вызывает ряд трудностей, таких как сходство морфологических характеристик разных видов, внутривидовая вариабельность признаков, номенклатурная путаница и отсутствие полноценных русскоязычных определительных ключей, учитывающих современную систематику рода.
В ходе исследования часто не удается определить вид некоторых изолятов по морфологическим признакам. Для достоверной идентификации таких изолятов необходимо применение современных молекулярных методов анализа ДНК гриба. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет преодолеть эти трудности, однако эффективность данного методического приема напрямую зависит от способа выделения ДНК из клеток.
Клеточная стенка грибов состоит из нескольких слоев содержащих белки в форме ковалентно связанных с углеводами гликопротеинов, глюканов и хитина, это и определяет сложности в экстракции ДНК. Из-за недостаточной очистки препаратов ДНК от белков полимеразная цепная реакция может блокироваться полностью или частично, т.е. результаты могут быть невоспроизводимы.
Целью данной работы было оптимизировать методику выделения ДНК из мицелия грибов рода Alternaría, выращенного на разных питательных средах, и выявить стабильный, воспроизводимый полиморфизм амплифицированных фрагментов, пригодных для создания системы молекулярных маркеров и идентификации разных видов патогена, встречающихся на подсолнечнике в Краснодарс-ком крае.
Материал и методы. Объектом исследований послужили 30 образцов мицелия грибов рода Alternaría, выделенных из листьев, стеблей и семян подсолнечника. С целью изучения эффективности различных методов выделения ДНК гриба для проведения ПЦР применяли сравнительный анализ трех способов выделения: наборы QIAGEN Dnseay Plant MiniKit (Германия), Diamond DNA Plant Kit D (Россия), метод основанный на использовании лизирующего буфера, содержащего гексадецилтриметиламмоний бромид (СТАВ) [3] с добавлением оксида алюминия и без него (табл. 1). В качестве материала для выделения ДНК использовали мицелий, выращенный на двух разных питательных средах: а) в пластиковых чашках Петри на картофельно-морковном агаре (КМА) с последующим соскабливанием; б) на жидкой среде Чапека с последующим фильтрованием.
Концентрацию ДНК в полученном препарате определяли визуально по интенсивности свечения пробы объемом 10 мкл в ультрафиолетовом свете в 1%-ном агароз-ном геле с добавлением 2 мкл бромистого этидия. Электрофорез проводили при напряжении 100-120 V в течение 40 мин.
Для ПЦР анализа применяли 12 ISSR-праймеров (табл. 2) [10].
Полимеразную цепную реакцию выполняли в реакционной смеси (25 мкл) следующего состава: 67 мМ Трис-HCl (рН 8,8); 16,6 мM сульфата аммония; 1,53,0 мM MgCh; 0,01 % Tween 20; по 0,2 hM дезоксирибонуклеозидфосфатов; по 10 пМ праймеров; 10 нг матричной ДНК и 1 ед. рекомбинантной термоста-
бильной ДНК-полимеразы («Сибэнзим», Россия). Реакции проводили в термоцик-лере S1000TM (BioRad, США) при следующих температурных режимах: начальная денатурация при 94 °С в течение 2 мин, далее 35 циклов с последовательной сменой температур: денатурация при 94 °С в течение 60 сек, отжиг праймера при N °С - 60 сек, элонгация при 72 °С -80 сек, где N - температура отжига каждого праймера - представлена в таблице 2.
Электрофорез продуктов амплификации проводили в геле, содержащем 2 % агарозы и ТАЕ-буфер, с использованием камеры для горизонтального электрофореза SE-2 (Хеликон, Россия). Гели окрашивали бромистым этидием. Для визуализации и документирования результатов электрофореза применяли систему цифровой документации видеоизображения BIO-PRINT (Vilber Lourmat, Франция).
Таблица 1
Методы, использованные для выделения ДНК из мицелия грибов рода Alternaría
№ п/п Вид Метод экстракции ДНК Питательная среда
1 A. alternata QIAGEN Dnseay Plant MiniKit (Германия) ср. Чапека
2 A. alternata Diamond DNA Plant Kit D (Россия) - // -
3 A. tenuissima QIAGEN Dnseay Plant MiniKit - // -
4 A. tenuissima Diamond DNA Plant Kit D - // -
5 A. tenuissima QIAGEN Dnseay Plant MiniKit - // -
6 A. tenuissima Diamond DNA Plant Kit D - // -
7 A. helianthiinficiens QIAGEN Dnseay Plant MiniKit - // -
8 A. helianthiinficiens Diamond DNA Plant Kit D - // -
9 A. tenuissima QIAGEN Dnseay Plant MiniKit - // -
10 A. tenuissima Diamond DNA Plant Kit D - // -
11 A. infectoia Diamond DNA Plant Kit D - // -
12 A. infectoia Diamond DNA Plant Kit D - // -
13 A. tenuissima Diamond DNA Plant Kit D - // -
14 A. tenuissima Diamond DNA Plant Kit D - // -
15 Ulocladium sp Diamond DNA Plant Kit D - // -
16 Ulocladium sp Diamond DNA Plant Kit D - // -
17 A. tenuissima СТАВ КМА*
18 Stemphillium СТАВ - // -
19 A. tenuissima СТАВ - // -
20 Stemphillium СТАВ - // -
21 A. tenuissima СТАВ, Al2Ü3 - // -
22 Alternaria sp СТАВ, Al2Ü3 - // -
23 Alternaria sp СТАВ, A2Ü3 - // -
24 Alternaria sp СТАВ, Al2Ü3 - // -
25 A. infectoia СТАВ, Al2Ü3 - // -
26 A. tenuissima СТАВ, Al2Ü3 - // -
27 A. infectoia СТАВ, A2Ü3 ср. Чапека
28 A. arborescens СТАВ, Al2Ü3 - // -
29 Alternaria sp СТАВ, A2Ü3 - // -
30 A. tenuissima СТАВ, Al2Ü3 - // -
Результаты и обсуждение. Для исследования по подбору оптимальной методики экстракции ДНК из мицелия гриба были выбраны два коммерческих набора реактивов: QIAGEN Dnseay Plant MiniKit (Германия), предназначенный для выделения ДНК из растений, общепризнанный «золотым стандартом» в области пробо-подготовки, и Diamond DNA Plant Kit D (Россия), созданный для выделения ДНК из засушенных растений, семян и грибов. Не удалось получить качественные препараты ДНК с использованием набора Diamond, несмотря на входящую в состав его методики обработку ферментом протеина-зой К, рекомендуемой многими авторами [4-9]. Полученная ДНК не гибридизова-лась ни с одним из праймеров и в результате не удалось получить продукты реакции амплификации. На рисунке 1 представлены фореграммы с праймером GAA6 продуктов амплификации ДНК, выделенной с помощью наборов QIAGEN и Diamond. В случае экстракции с использованием набора Diamond продукты амплификации не были получены так же ни с одним из изученного набора праймеров.
Рисунок 1 - Электрофоретические спектры продуктов амплификации ДНК грибов рода Alternaría с праймером GAA6 при употреблении разных методик выделения: 1-5 - QIAGEN; 6-9 - Diamond. Стрелками указаны полиморфные фрагменты ДНК. М -маркер молекулярного веса; 1 - A. Alternata; 2, 3, 5 - A. tenuissima; 4 - A. Helianthiinficiens
Из четырех апробированных вариантов экстракции ДНК лучший результат удалось получить при использовании набора 01ЛОБК. На рисунке 2 представлена фо-реграмма продуктов амплификации ДНК, выделенной с набором QIAGEN и методом СТАВ без использования оксида алюминия. Во втором варианте качество полученной ДНК было хуже, что позволило получить продукты амплификации, но при этом не было выявлено полиморфных фрагментов.
Рисунок 2 - Электрофоретические спектры продуктов амплификации ДНК грибов рода Alternaría с праймером GACA4 при употреблении разных методик выделения: 1-5 - QIAGEN; 6-9 СТАВ. Стрелками указаны полиморфные фрагменты ДНК. М - маркер молекулярного веса; 1 - A. Alternata; 2, 3, 5 - A. tenuíssíma; 4 - A. helianthimficiens
Препараты ДНК хорошего качества удалось получить и при выделении ДНК методом СТАВ, но с добавлением оксида алюминия. Выделенная таким способом ДНК производила продукты реакции c ISSR-праймерами, и при этом были выявлены полиморфные фрагменты. Не имело значения, как выращен мицелий, - на твердых, агаризованных, или жидких средах. Таким образом, лучшего качества препараты ДНК удалось получить при использовании двух способов её выделения и очистки: с применением коммерческого набора для экстракции ДНК - QIAGEN, и с использованием СТАВ с добавлением
оксида алюминия. Причем, учитывая стоимость комплекта необходимых буферов и реагентов QIAGEN, предпочтительнее применять второй способ.
Выделенные всеми четырьмя способами образцы ДНК гриба были апробированы с некоторыми универсальными прай-мерами, разработанными для наиболее распространенных видов Alternaría. Проведенные реакции амплификации показали, что ДНК, экстрагированная с применением набора Diamond, не производила продуктов реакции с ними и в дальнейшем ПЦР с этими образцами ДНК не проводилась. Матричная ДНК, полученная остальными методами, хорошо ги-бридизовалась со специфичными праймерами, и были получены четкие, хорошо воспроизводимые фракции, представленные на рисунке 3.
Рисунок 3 - Электрофоретические спектры продуктов амплификации ДНК грибов рода Alternaría с парой праймеров AAR3, AAF2 при употреблении разных методик
выделения: 1-5 - QIAGEN; 6-9 СТАВ; 10-9 - СТАВ с AI2O3. М - маркер молекулярного веса. К - отрицательный контроль
Для выявления молекулярно-генети-ческого полиморфизма у разных видов Alternaría был проведен скрининг 12 ISSR-локусов (табл. 2). Такие простые повторяющиеся последовательности распределены по всему геному эукариот и успешно используются для выявления различий между разными видами микро-мицетов [10; 11; 12]. Как описано выше, в реакциях амплификации с этими прайме-рами использовалась матричная ДНК,
выделенная двумя способами: набором QIAGEN и с использованием СТАВ с Al2O3. Как показано в таблице 2, из 12 проанализированных ISSR-праймеров шесть давали продукты амплификации, причем во всех случаях были выявлены полиморфные фракции у образцов ДНК разных видов гриба.
Таблица 2
Характеристика ISSR-локусов, использованных для получения полиморфных фрагментов ДНК, у грибов рода Alternaría, паразитирующих на подсолнечнике
В ходе эксперимента по ISSR-локусам GAA6 и GACA4 были выявлены полиморфные фракции ДНК у изолята A. he-líanthíínfícíens. На рисунках 1 и 2 эти фракции показаны стрелками на дорожке под номером 4. По локусу GAA6 выявлено две полиморфных фракции, которых нет у изолятов A. alternata (дорожка 1) и A. tenuissima (дорожки 2, 3, 5) (рис. 1). А по локусу GACA4 выявлено три фракции, отличающие этот изолят от остальных (рис. 2). Однако при проведении ПЦР с несколькими образцами ДНК одного вида Alternaría так же обнаружены полиморфные фракции. Например, у образцов A. tenuíssíma, представленных на рисунках 1 и 2 (дорожки 2, 3, 5). Несмотря на это, изученные ISSR-локусы пригодны для выявления меж- и внутривидовых различий у грибов рода Alternaría.
Заключение. Таким образом, для грибов рода Alternaría, распространённых на подсолнечнике, наиболее подходящим способом выделения ДНК являются методики QIAGEN Dnseay Plant MiniKit
(Германия) и СТАВ с добавлением Al203 на стадии гомогенизации.
Выявлены шесть ISSR-праймеров, инициирующих амплификацию полиморфных фрагментов ДНК у видов Alternaria Nees, встречающейся на подсолнечнике в Краснодарском крае.
Исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ и Администрации Краснодарского края, грант №13-04-96586.
Список литературы
1. Ганнибал Ф.Б. Видовой состав, систематика и география возбудителей альтернариозов подсолнечника в России // Вестник защиты растений. -2011. - № 1. - С. 13-19.
2. Ивебор М.В., Антонова Т.С., Саукова С.Л. К вопросу о возбудителях альтернариоза подсолнечника // Масличные культуры: Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. - 2013. - Вып. 1 (153-154). - С. 90-100.
3. Zolan M.E., Pukkila P.J. Inheritance of DNA methylation in Corpinus cinereous // Mol. Cell Biol. -1986. - Т. 6. - № 1. - Р. 195-200.
4. Ганнибал Ф.Б. Мониторинг альтернариозов сельскохозяйственных культур и идентификация грибов рода Alternaria. - СПб: ВИЗР, 2011. - 71 с.
5. Chen X.M., Line R.F., Leung H. Relationship between virulence variation and DNA polymorphism in Puccini a striiformis // Phytopathology. - 1993. - V. 83. - P. 1489-1497.
6. Тютерев С.Л., Евстигнеева Т.А. Биохимические методы исследования индуцированной болезнеустойчивости растений. - СПб: ВИЗР, 2001. -67 с.
7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. - М.: Мир, 1984.- 480 с.
8. Crowhurst R.N., Hawthorne B.T., Rikkerink E.H., Templeton M.D. Differentiation of Fusarium solani f. sp. cucurbitae races 1 and 2 by random amplification of polymorphic DNA. - Curr. Genet. -1991. - № 20 (5) - P. 391-396.
9. Goodwin P.H., Annis S.L. Rapid identification of genetic variation and Pathotype of Leptosphaeria masculans by random amplification of polymorphic DNA assay // Applied Environmental Microbiology. -1991. - V. 57 (9). - P. 2482-2486.
10. Intelmann F., Spring O. Analysis of total DNA by minisatellite and simple-siquence repeat primers for the use of population studies in Plasmopara halstedii // Can. J. Microbiol. - 2002. - V. 48. - P. 555-559.
11. Thanos M., Schönian G., Schweynoch W., Gräser C. [et al.]. Rapid identification of Candida Species by DNA fingerprinting with PCR // J. Clin. Microbiol. - 1996. - V. 34 (3). - P. 615-621.
Наличие
Прай-мер Темпе- или от-
Последовательность праймеров 5' - 3' ратура сутст-
отжига вие полиморфизма
CA8 CAC ACA CAC ACA CAC A 53 +
CAC5 CAC CAC CAC CAC CAC 53 Нет отжига
CT8 CTC TCT CTC TCT CTC T 50 Нет отжига
GAA6 GAA GAA GAA GAA GAA GAA 53 +
GACA4 GAC AGA CAG ACA GAC A 53 +
GATA4 GAT AGA TAG ATA GAT A 53 Нет отжига
GGAT4 GGA TGG ATG GAT GGA T 53 +
GTG5 GTC GTC GTC GTC GTC 50 +
TCC5 TCC TCC TCC TCC TCC 53 Нет отжига
TG10 TGT GTG TGT GTG TGT GTG TG 53 Нет отжига
T3B AGG TGG GGG GTT GGA ATC C 53 Нет отжига
М13 GAG GGT GGN GGN TCT 53 +
ISSN 0202-5493. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 2 (159-160), 2014
12. Zézé A., Sulistyowat E., Ophel-Keller K., Barker S. and Smith S. Intersporal genetic variation of Gi-gaspora margarita, a vesicular arbuscular mycorrhizal fungus, revealed by M13 minisatellite-primed // Appl. Environ. Vicrobiol. - 1997. - V. 63 (2). - P. 676-678.
References
1. Gannibal, F.B. Vidovoy sostav, sistematika i geografiya vozbuditeley alternariozov podsolnechnika v Rossii / F. B. Gannibal // Vestnik zaschiti rasteniy. -2011. - № 1. - S. 13-19.
2. Iwebor M.V. K voprosu o vozbuditelyah alter-narioza podsolnechnika / M.V. Iwebor, T.S. Antono-va, S.L. Saukova // Maslichnie kul'turi: Nauch.-teh. byul. VNIIMK - 2013. - Vip. 1 (153-154). - S. 90100.
3. Zolan, M.E., Inheritance of DNA methylation in Corpinus cinereous / M.E. Zolan, P.J. Pukkila // Mol. Cell Biol. - 1986. - T. 6. - № 1. - P. 195-200.
4. Gannibal F.B. Monitoring alternariozov sel'skohozyaystvennyh kul'tur i identifikatsiya gribov roda Alternaria / F. B. Gannibal // SPb: VIZR, 2011. -71 s.
5. Chen, X. M. Relationship between virulence variation and DNA polymorphism in Puccini's striiformis / X.M. Chen, R.F. Line, and H. Leung // Phytopathology. - 1993. - V. 83. - P. 1489-1497.
6. Tyuterev, S.L. Biohimicheskie metody issledo-vaniya indutsirovannoy bolezneustoychivosti rasteniy / S.L.Tyuterev, T.A. Evstigneeva // SPb: VIZR, 2001. - 67 s.
7. Maniatis, T. Moleculyarnoe klonirovanie / T. Maniatis, E. Frich, Dg. Sembruk // M.: Mir, 1984. -480 s.
8. Crowhurst, R.N. Differentiation of Fusarium solani f. sp. cucurbitae races 1 and 2 by random amplification of polymorphic DNA / R.N. Crowhurst, B.T. Hawthorne, E.H. Rikkerink, M.D. Templeton // Curr. Genet. - 1991. - № 20 (5). - P. 391-396.
9. Goodwin, P.H. Rapid identification of genetic variation and Pathotype of Leptosphaeria maculans by random amplification of polymorphic DNA assay / P.H. Goodwin, S.L. Annis // Applied Environmental Microbiology. - 1991. - V. 57 (9). - P. 2482-2486.
10. Intelmann, F. Analysis of total DNA by minisatellite and simple-siquence repeat primers for the use of population studies in Plasmopara halstedii / F. Intelmann, O. Spring // Can. J. Microbiol. - 2002. -V. 48. - P. 555-559.
11. Thanos, M. Rapid identification of Candida Species by DNA fingerprinting with PCR / M. Thanos, G. Schönian, W. Schweynoch, C. Gräser [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 1996. - V. 34 (3). - P. 615621.
