CC BY
74
УДК 615.9:677.51
М.П. Сутункова
подавление развития вредных эффектов хризотил-асбеста комплексом биопротекторов (экспериментальное исследование)
ФГУН Екатеринбургский медицинский научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих
промпредприятий Роспотребнадзора (Екатеринбург)
В экспериментах на инбредных крысах и линейных мышах показано, что сдвиги клеточного состава бронхоальвеолярного лаважа крыс, связанные с цитотоксичностью хризотил-асбеста при его интратрахеальном. введении, развитие гистологической картины, асбестоза и соответствующие ему изменения массы, легких и. содержания в них оксипролина и. липидов, а также образование микроядер в клетках костного мозга у мышей при. внутрибрюшинном введении асбеста значимо ослаблены под влиянием биопротекторного комплекса, в состав которого входят глютамат, метионин и п.оливи.т.ам.и.н.н.о-п.оли.м.инеральн.ы.й препарат, группы. «Витрум».
Ключевые слова: хризотил-асбест, цитотоксичность, фиброгенность, микроядерный тест, биопротекторы
iNHiBiTioN of harmful EFFEcTs of cHRYsoTiLE Asbestos wiTH A complex oF BiOPROTEKTORS (an experimental study)
M.P. Sutunkova
FSSI Ekaterinburg Medical Scientific Centre of Prophylaxis and Health Protection in Industrial Workers,
Ekaterinburg
It is shown in experiments on inbred, rats and linear mice that a bioprotective complex composed, of glutamate, methionine and multivitamin and. multimineral preparation of the VITRUM group reduces significantly: (a) changes in the cellular composition, of the bronchoalveolar lavage fluid, from rats that are associated, with the cytotoxicity of chrysotile asbestos administered, intratracheally; (b) the retention of asbestos dust in the pulmonary tissue, the development of the histological features of asbestosis and. related, changes in the mass of the lungs and their hydroxyproline and lipid contents within the framework of a long-term, experiment; (c) some integral indices of the impact of asbestos on the organism; (d) the formation of micronuclei in bone marrow cells in mice administered asbestos intraperitoneally.
Key words: chrysotile asbestos, cytotoxicity, fibrogennost, micronucleus test, bioprotektory
Вредное действие асбестовых волокон на организм разнообразно. У работающих в контакте с хризотил-асбестом наблюдается развитие специфического фиброза легочной ткани — асбестоза, а также утолщений плевры и хронического бронхита. Наибольшую озабоченность вызывает обусловленное асбестовой экспозицией развитие злокачественных новообразований различной локализации, но, в первую очередь, рака бронхов и легких, а также мезотелиом плевры и, реже, брюшины. В настоящее время во всем мире профессиональной экспозиции асбестом подвержены около 125 млн. человек, ежегодно 100 тыс. умирают от асбестообусловленных заболеваний. В связи с этим является актуальной задача повышения резистентности организма к неблагоприятным эффектам асбеста.
На протяжении многих лет коллективом отдела токсикологии и биопрофилактики Екатеринбургского медицинского научного центра профилактики и охраны здоровья рабочих промышленных предприятий (д.м.н., проф. Б.А. Кацнельсон, д.м.н., проф. Л.И. Привалова, д.б.н. Т.Д. Дегтярева и др.) осуществляются теоретическая разработка, экспериментальное моделирование, контролируемое испытание и широкое внедрение в практику мето-
дов так называемой биологической профилактики [1—6, 8]. Под последней нами понимается комплексное воздействие на организм, направленное на повышение его резистентности к вредному действию загрязнителей производственной среды и среды обитания. Было показано, в частности, что «биопрофилактический комплекс» (БПК), то есть комбинация биопротекторов разнонаправленного действия, рационально подобранная с учетом, как их фармакодинамических характеристик, так и особенностей токсикодинамики и токсикокинети-ки тех вредных веществ, от которых предполагается защитить организм, как правило, более эффективен, чем изолированные биопротекторы.
Обосновывая состав БПК, который было бы целесообразно испытать на эффективность по отношению к вредным эффектам асбеста, мы, прежде всего, остановились на глютаминате натрия (далее
— глютамат), учитывая давно показанную необычайно высокую способность глютамата к защите альвеолярного макрофага от циотоксического действия кварца и, в связи с этим, от задержки его в легких и трахео-бронхиальных лимфоузлах и от силикотического фиброгенеза [1, 2, 7, 10].
Исходя из наличия общих патогенетических звеньев у асбестоза и силикоза, решено было
включить в состав испытываемого БПК также йод
— другой биопротектор, ранее успешно испытанный как средство, тормозящее фиброгенез при экспериментальном силикозе [11, 12]. Предположительно данный эффект связан с нормализацией биоэнергетических процессов (нарушенных в повреждаемом кварцевыми частицами макрофаге) через влияние йода на гормональную функцию щитовидной железы.
В механизмах повреждающего действия пылевых частиц на клетку определенную роль играет индукция перекисного окисления липидов и других свободно-радикальных процессов [1]. Известна и роль свободных кислородных радикалов в повреждении ДНК и, вероятно, в инициации канцерогенеза, в том числе асбестового. Поэтому от включения биологических антиоксидантов в умеренных дозировках в состав БПК можно ожидать не только потенцирования антицитотоксического-антифиброгенного действия при асбестозе, но и антимутагенного (а прогностически — антиканцерогенного) эффекта.
Целью эксперимента являлось обоснование состава БПК, причем не только эффективного, но к тому же доступного и безопасного для последующего практического использования. Профилактические дозы йода, а также таких антиоксидантов, как селен и витамины А, С и Е, решено было включить в БПК в форме готового поливитаминно-полиминерального комплекса «ВИТРУМ Кидс». Дополнительно в состав БПК решено было ввести метионин, который играет активную роль в липидном метаболизме, нарушаемом при пневмокониозах [1], а также представляет интерес как один из компонентов антиоксидантной системы организма.
методика
Во всех экспериментах использовался один и тот же образец измельченного в дробилке, а затем растертого в агатовой ступке хризотил-асбеста Баженовского месторождения (Урал), в котором 40,9 % всех частиц составляли таковые с соотношением длины к ширине 3 : 1, относимые к волокнистым; из них 74,2 % имели длину > 5 мкм. Среди неволокнистых частиц, напротив, преобладали (87,1 %) таковые с линейными размерами до 5 мкм. Подобная дисперсометрическая характеристика, в целом, типична для витающей пыли в воздухе рабочих помещений асбестообогатительных фабрик.
Для изучения сдвигов клеточного состава жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛЖ), проводившегося через 24 часа после экспозиции, указанный образец вводили интратрахеально ин-бредным белым крысам-самкам весом 150 — 220 г в виде взвеси, содержащей 10 мг асбеста в 1 мл стерильного физ. раствора. Для изучения хронических эффектов крысам вводили таким же путем по 50 мг асбеста однократно, и они были выведены из эксперимента путем быстрой декапитации спустя 2 или 6 месяцев. В кратковременном эксперименте участвовали 3 группы по 10 крыс: контрольная; получившая только асбест; получившая асбест
после месячного курса БПК. В хроническом эксперименте — 4 группы: контрольная (26 крыс); получившая БПК (20 крыс); получившая асбест (32 крысы); получившая асбест на фоне действия БПК (32 крысы) на протяжении всего экспериментального периода. Всем крысам контрольной группы, не получавшим асбеста, интратрахеально ввели по 1 мл стерильного физ. раствора.
В состав БПК входили: глутаминат натрия в виде питья 1,5%-го раствора, получаемого путем предварительной нейтрализации раствора глутаминовой кислоты гидрокарбонатом натрия (средний объем раствора, выпиваемого одной крысой, составлял 10—12 мл); препарат «ВИТРУМ Кидс» (Юнифарм, США), дозировка которого рассчитывалась, исходя из приводимой в литературе потребности лабораторных крыс в основных витаминах, и составила добавляемые к пище 4 растертых таблетки препарата в день на 52 крысы; метионин в дозе 50 мг на крысу (также добавкой к пище). В кратковременном эксперименте БПК давали крысам ежедневно по 7 раз, а в хроническом — по 5 раз в неделю.
Микроядерный тест был поставлен на мышах линии Віаск (самцах весом 18 — 22 г), которым асбест вводился однократно в брюшную полость в дозе 10 мг в 0,5 мл физ. раствора за 24 часа до умерщвления и взятия костного мозга из бедренной кости [15]. Всего обследовано 3 группы по 12 мышей: контрольная (стерильный физ. раствор внутрибрюшинно); получившая только асбест; получившая асбест после 3-недельного воздействия БПК по 6 раз в неделю. В данном эксперименте глю-тамат также давался с питьевой водой; дозировка «ВИТРУМ Кидс» составила 1 растертую таблетку к пище, рассчитанную на 40 мышей; дозировка метионина — 12,5 мг на мышь. Микроядерный тест проводился совместно с к.б.н. О.Ю. Бересневой.
Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к Приказу Минздрава СССР от 12.08.1977 г. № 755).
Оценка влияния хризотил-асбеста на организм производилась в два срока исследования с помощью показателей, широко использующихся в исследованиях и рекомендованных как хорошо воспроизводимые и адекватные.
результаты
Информативным показателем сравнительной устойчивости легочных макрофагов к действию асбестовой пыли под влиянием БПК может служить нейтрофильный сдвиг свободной клеточной популяции глубоких дыхательных путей, который является реакцией на действие продуктов разрушения альвеолярных макрофагов, образующихся при воздействии цитотоксичных частиц [1, 13, 14].
Как видно из цитологической характеристики БАЛЖ, у крыс сравниваемых групп (табл. 1) при введении асбеста общее количество клеток увеличилось, в основном, за счет 6-кратного усиления
притока нейтрофильных лейкоцитов (НЛ), наряду с небольшим (и статистически не значимым) увеличением числа альвеолярных макрофагов (АМ), которые не только мобилизуются на свободную поверхность дыхательных путей, но и разрушаются здесь под действием пылевых частиц.
Такой характер реакции альвеолярного фагоцитоза, типичный для действия цитотоксичной пыли [1, 13, 14], интегрально оценивается почти 5-кратным и статистически высоко значимым увеличением коэффициента НЛ/АМ.
Защита альвеолярных макрофагов от повреждения асбестовой пылью позволяет ожидать более активного освобождения легких от ее частиц. Действительно, в хроническом эксперименте, несмотря на то, что при задержке в легких интратрахе-ально введенной большой дозы пыли доступность ее фагоцитарному механизму самоочищения значительно ограничена. Мы обнаружили не только снижение этой задержки к 6-месячному сроку по сравнению с 2-месячным, но и то, что в оба срока она оказалась ниже в группе «асбест + БПК» по сравнению с группой «асбест». Масса пыли (оцениваемая как масса зольного остатка легочной ткани после растворения его в 0,5 н НС1) равнялась, соответственно указанным срокам, в группе «асбест» 20,4 ± 1,25 мг и 17,7 ± 1,38 мг, а в группе «асбест + БПК» — 17,0 ± 1,44 мг и 14,4 ± 0,63 мг; различие между данными по срокам статистически значимо при р < 0,05 во второй группе, различие между группами — в оба срока.
Вместе с тем, защита от цитотоксического действия пыли приводит к ослаблению интенсивности патологических изменений, инициируемых повреждением легочных макрофагов [1, 2, 9, 10].
Это проявляется в оба срока хронического эксперимента ослаблением таких типичных для пневмо-кониозов сдвигов, как повышение коэффициента массы легких и интенсивности биосинтеза коллагена в них, оцениваемого по содержанию общего оксипролина, корригированного по массе тела. Как видно из таблицы 2, это ослабление в той или иной степени имеет место по обоим показателям в оба срока, а по содержанию оксипролина в 6-месячный срок оно статистически значимо. Сам по себе БПК не вызывал значимых отличий изучаемых показателей от контрольных.
В пользу того, что вызываемое действием БПК ослабление синтеза коллагена связано не только со снижением задержки пыли в легких, но и с ослаблением вызываемого ею фиброгенеза, свидетельствует снижение показателя «удельного прироста» содержания оксипролина, который у каждой крысы рассчитывается как разность между содержанием оксипролина в ее легких и средним его содержанием в легких крыс контрольной группы того же срока, деленная на массу пыли в легких той же крысы. Среднее значение данного показателя в 2-месячный срок оказалось равным в группе асбест 96,8 ± 11,5 мкг/мг, а в группе «асбест + БПК» — 74,4 ± 18,6 мкг/мг; в 6-месячный срок
— соответственно 206,7 ± 16,8 и 149,6 ± 7,4 мкг/ мг, причем во второй срок разница между группами статистически высоко значима (р < 0,01 по ^критерию Стьюдента).
Как через 2, так и особенно через 6 месяцев после введения асбеста ослабленное под влиянием БПК развитие пневмокониотических изменений в легких было отмечено и при гистологическом исследовании (к.м.н. И.Е. Валамина). Если при
Таблица 1
Основные цитологические характеристики БАЛЖ через 24 часа после интратрахеального введения крысам
хризотил-асбеста (х ± Sх)
Группы крыс, получавших Число клеток х 106 НЛ/АМ
общее нл АМ
Асбест 24,65 ± 4,8* 12,34 ± 2,8* 6,11 ± 1,2 1,95 ± 0,2*
Асбест + БПК 18,45 ± 4,7 6,07 ± 1,9*' 6,53 ± 1,6 0,85 ± 0,1*'
Контрольная 10,9 ± 2,5 2,02 ± 0,6 5,2 ± 1,6 0,4 ± 0,03
примечание: * - статистически значимое различие с контрольной группой; • - с группой «Асбест» (р < 0,05 по критерию Стьюдента).
Таблица 2
Влияние асбеста и БПК на массу легких и содержание в них оксипролина (х ± Sх)
Группы крыс, получивших Масса сухих легких, мг на 100 г массы тела Содержание оксипролина в лёгких, мкг (на 100 г массы тела)
2 мес. 6 мес. 2 мес. 6 мес.
Асбест 200 ± 17* 217 ± 13* 4547± 321* 6438 ± 396*
Асбест+БПК 190 ± 15* 206 ± 9* 3531 ± 453 5373 ± 171'*
БПК 121 ± 3 145 ± 7 2459 ± 200 3644 ± 206
Контрольная 124 ± 6 159 ± 14 2439±126 3247±142
примечание: * - статистически значимое различие с контрольной группой; • - с группой «Асбест» (р < 0,05 по критерию Стьюдента).
действии одного асбеста клеточно-пылевые узелки пронизаны плотной сетью из утолщенных арги-рофильных волокон (рис. 1) и нежной сеточкой тонких коллагеновых волокон, то на фоне действия БПК в них обнаруживается лишь небольшое количество тонких аргирофильных (рис. 2) и коллагеновых волокон.
Полуколичественная (4-балльная) оценка накопления фосфолипидов в легочных макрофагах при окраске срезов суданом черным В выявила следующие значения средне-взвешенного балла: контрольный (на оба срока вместе) 0,91 ± 0,03; при действии асбеста — 2,03 ± 0,09 через 2 месяца и 2,23 ± 0,17 через 6 месяцев (статистически значимо выше контрольного показателя, р < 0,05); на фоне БПК — соответственно, 1,45 ± 0,03 и 1,69 ± 0,04 (статистически значимо ниже, чем без БПК; р < 0,05). При оценке содержания суммарных липидов в легких по потере сухой массы после экстракции эфиром в аппарате Сокслет наблюдалось типичное для экспериментальных пневмокониозов увеличение его под влиянием асбеста (например, к 6-месячному
рис. 1. Типичный узелок в легких крысы через 6 месяцев после интратрахеального введения асбеста. Серебрение по Гомори. Ув. 400.
рис. 2. Типичный узелок в легких крысы через 6 месяцев после интратрахеального введения асбеста на фоне действия БПК. Серебрение по Гомори. Ув. 400.
Таблица 3
Эффективность антимутагенного действия БПК, оцененная в микроядерном тесте на костном мозге мышей (х ± Sх)
Группы животных, получивших Количество микроядер на 103 полихроматофильных эритроцитов
Асбест 3,900 ± 0,019*
Асбест + БПК 2,818 ± 0,009*'
Контроль 1,285 ± 0,006
примечание: * - статистически значимое различие с контрольной группой;• - с группой «Асбест» (р < 0,05 по Р-критерию Фишера).
сроку 65,З ± 4,0 мг против З7,4 ± 2,З мг в контроле; р < 0,001), и ограничение этого сдвига на фоне БПК (52,9 ± 2,9; отличие от показателя при действии одного асбеста значимо при р < 0,05). Сам по себе БПК не изменил контрольного показателя (З4,5 ± 2,5).
Как видно из таблицы З, число микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей, получивших внутрибрюшинно асбест, статистически значимо увеличилось в 2,З раза по сравнению с контролем. Предварительное воздействие БПК статистически значимо снижает этот мутагенный эффект.
Механизмы канцерогенного действия асбеста все еще служат предметом дискуссии. Многими авторами признается его генотоксичность (мутагенность), то есть асбест рассматривается как инициатор канцерогенеза. Согласно обзору литературы, приводимому IPCS(1998), генотоксичность асбеста, подтвержденная многими экспериментами на клеточных культурах и проявляющаяся хромосомными аберрациями, анафазными аномалиями, сестринскими хроматидными обменами, мутациями, может быть связана не только с прямым влиянием на ДНК, но и с образованием активных кислородных радикалов. Хотя в этом обширном литературном обзоре нет сведений о мутагенности асбеста in vivo, а образование микроядер in vitro упоминается как показанное только в одной работе (на человеческих клетках бронхиального эпителия). Вместе с тем полученные нами положительные результаты микроядерного теста на мышах согласуются с результатами другого исследования. Ослабление же генотоксического эффекта асбеста под влиянием БПК, показанное нами впервые, может быть предположительно объяснено торможением свободнорадикальных процессов, обусловленных действием антиоксидантов, входящих в его состав.
заключение
Таким образом, интратрахеальное введение пыли хризотил-асбеста крысам вызывает развитие пневмокониотического процесса, который проявляется типичными гистопатологическими изменениями, увеличением массы легких, повышением содержания оксипролина и липидов в них. Судя по показателям цитологического анализа жидкости бронхоальвеолярного лаважа, хризотил-асбест проявляет выраженные цитотоксические свойства,
вероятнее всего, лежащие в основе развития вышеназванных изменений. Наряду с этим, в микроядер-ном тесте на мышах показано мутагенное действие хризотил-асбеста. Прием биопрофилактического комплекса, состоящего из глутамината натрия, метионина и поливитаминно-полиминерального препарата, значимо снизил показатели цитотоксичности, фиброгенности и мутагенности хризотил-асбеста.
литература
1. Аронова Г.В. Йодистый калий как противо-силикотическое средство (экспериментальные данные) / Г.В. Аронова, Б.А. Кацнельсон // Гиг. труда. и проф. бол. - 1982. - № 11. - С. 47-48.
2. Биологическая профилактика комбинированного действия токсичных металлов и органических веществ / Т.Д. Дегтярева [и др.] // Гигиена и санитария. - 2007. - № 3. - С. 37-40.
3. Биологическая профилактика как комплексное воздействие, повышающее резистентность организма к действию вредных факторов производственной среды / Б.А. Кацнельсон [и др.] // Вест. Уральской мед. академ. науки. - 2005. - № 2.
- С. 70-76.
4. Кацнельсон Б.А. Принципы биологической профилактики профессиональной и экологически обусловленной патологии от воздействия неорганических веществ / Б.А. Кацнельсон, Т.Д. Дегтярева, Л.И. Привалова. - Екатеринбург, 1999. - 106 с.
5. Кацнельсон Б.А. Разработка средств, повышающих устойчивость организма к действию неорганических загрязнителей производственной и окружающей среды / Б.А. Кацнельсон, Т.Д. Дегтярева, Л.И. Привалова // Росс. хим. журнал - 2004.
- Т. 48, № 2. - С. 65-71.
6. Микроядерный анализ и цитогенетическая нестабильность / Н.Н. Ильинских [и др.] - Томск, 1992. - 270 с.
7. Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом: методические рекомендации. - М., 2001. — 21 с.
8. Пневмокониозы: патогенез и биологическая профилактика / Б.А. Кацнельсон [и др.]. — Екатеринбург, 1995. — 325 с.
9. Подходы к организации массовой биологической профилактики вредного влияния химического загрязнения среды обитания на здоровье детского населения и к оценке ее эффективности (опыт Свердловской области): пособие для врачей.
- Екатеринбург, 2005. — 44 с.
10. Тормозящее действие йода на развитие экспериментального силикоза при перкутанном воздействии / Ю.В. Пластинина [и др.] // Мед. труда и пром. экология. — 1996. — № 7. — С. 16 — 20.
11. A further experimental study of antisilicotic effect of glutamate / K.I. Morosova [et al.] // Brit. J. In-dustr. Med. - 1984. - Vol. 41, N 4. - P. 518-525.
12. Correlation between cytotoxicity and fi-brogenicity of silicosis-inducing dusts Medic / В.А. Katsnelson [et al.] // Lavoro. - 1984. - Vol. 75, N 6. - P. 450-462.
13. IPCS (International Programme on Chemical Safety). Environmental Health Criteria 2003. Chrysotile asbestos / Geneva: World Health Organization, 1998.
- 197 p.
14. On the relationship between activation and the breakdown of macrophages in pathogenesis of silicosis / L.I. Privalova [et al.] // Medic. Lavoro. - 1995. -Vol. 86, N 6. - P. 511-521.
15. Response of a phagocyte cell system to products of macrophage breakdown as a probable mechanism of alveolar phagocytosis adaptation to deposition of particles of different cytotoxicity / L.I. Privalova [et al.] // Environ. Health Perspect. - 1980. - Vol. 35.
- P. 205-218.
сведения об авторах:
ФГУН Екатеринбургский Медицинский научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий Роспотребнадзора. Екатеринбург, ул. Попова, 30.
Сутункова Марина Петровна, научный сотрудник, отдел токсикологии и биопрофилактики. Тел 8 (343) 371-20-84, факс. 8 (343) 371-87-40, [email protected].
