CC BY
52
УДК 57.042.2
О. В. Павлова*, А. А. Московцев**, Т.С. Клементьева**, А.Н. Мыльникова*, И.Н. Соловьева*
*Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20 , корп. 1
**Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук, Москва, Россия 125315, Москва, ул. Балтийская, д. 8 ** e-mail: bioinf@mail.ru
ПОДАВЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ РИБОНУКЛЕАЗЫ IRE1 - НОВЫЙ ПОДХОД В ТЕРАПИИ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Фермент IRE1 является важным элементом сигнальной системы клетки, активирующейся при накоплении в эндоплазматическом ретикулуме неверно свернутых белков (белков с ненативными конформациями, БНК). Кроме цитопротективной функции, IRE1 так же может инициировать синтез проапоптотических белков. Суть нашей работы заключалась в поиске ингибиторов IRE1, описании их структуры и демонстрации возможности использования их в качестве противораковых препаратов.
Ключевые слова: фермент IRE1; ингибиторы IRE1; цитотоксичность; цитопротектор; ответ на неправильную упаковку белка; эндоплазматический ретикулум (ЭПР).
В последнее время онкологические заболевания находят все большее распространение среди людей всех возрастов. Значительные усилия направлены на поиск эффективных противораковых препаратов. Основными недостатками таких препаратов являются низкая специфичность и лекарственная устойчивость опухолевых клеток - фактор, существенно снижающий эффективность противоопухолевой терапии. Одним из направлений в исследовании принципиально новых лекарственных средств, обладающих большей эффективностью и специфичностью, является поиск соединений, способных ингибировать рибонуклеазу ШЕ1.
1ЯЕ1 - это фермент с двойной активностью, имеющий трансмембранный, серин-треонин киназный и эндорибонуклеазный домены. (рис.1) В неактивной форме он связан с шапероном ОКР78 ЭПР. Во время стресса ЭПР, ШЕ1 переходит в активированную форму. мРНК гена ХВР1 транспортируется из ядра клетки в цитоплазму и проходит цитоплазматический сплайсинг, который осуществляется с помощью 1ЯЕ1. Сплайсированный белок ХВР1 ^ХВР1) перемещается в ядро и контролирует транскрипцию шаперонов, а также генов, которые вовлекаются в деградацию белка. Если ответ клетки на накопление белков с ненативными конформациями в ЭПР был успешен, клетка возвращается к нормальному функционированию в противоположном случае инициируется апоптоз. Таким образом, активация 1ЯЕ1 является ключевым этапом сигнальной системы ИРЯ клетки. [2, 3]
ER membrane
!Gln636
Kinase /Phe637 ßC' Г —/
Mg-ADP
Activation segment
Рис. 1. Димеризованная структура вида «лицом-к-лицу» человеческого IRE1. [1]
Недавно было обнаружено, что сигнальный путь IRE1-XBP1 связан с возникновением различных заболеваний человека, в том числе некоторых видов рака, ожирением, ревматоидным артритом, боковым амиотрофическим склерозом (ALS), и болезнью Хантингтона (HD). [4] Чаще всего активацию адаптивного IRE1-XBP1 пути обнаруживают в злокачественных
новообразованиях системы крови, в том числе в множественной миеломе. [5] Для лечения онкологических заболеваний, могут быть применены соединения, способные ингибировать фермент IRE1. Такое воздействие должно устранять цитопротективное действие IRE1 и способствовать гибели раковых клеток. При этом ингибиторы IRE1 можно применять как в виде отдельных препаратов, так и в комбинации с другими соединениями. [6]
Недавно был предложен ряд ингибиторов 1ЯЕ1 на основе ароматических или гетероароматических гидроксиальдегидов. Альдегидная группа в этих соединениях может быть представлена любой из трех эквивалентных форм, показанных ниже:
Р
ХНО // ^
применимо для лечения онкологических заболеваний.
Structure"'
Structure -
Structure -
H
Общая структурная формула соединений:
R^-
Rx
ОН
С'
Rz
\ H
,0
1) заместитель ОН находится в орто-положении;
2) 0 представляет собой ароматическую, изоциклическую или гетероциклическую кольцевую систему;
3) Я Х , Я Y и Я Z может присутствовать или отсутствовать. В качестве подобных заместителей так же могут быть использованы водород, арил, гетероарил, и др. [6]
Ингибитор 11КБ1(второе название БТГ 083010) - N-[(2 - гидроксинафтален - 1- ил) метилиден] тиофен - 2 - сульфонамид. (Рис.2) [7]
Рис.2. Ингибитор 1 IRE1.
STF-083010- новый ингибитор малых молекул IRE1. Он способен проникать через клеточную мембрану и непосредственно воздействовать на IRE1, нарушая сигнальный путь IRE1-XBP1. Он селективно ингибирует ЭПР стресс -индуцированную эндонуклеазную IRE1 и, тем самым, блокирует образование сплайсинговой формы матричной РНК XPB1. Лечение с STF-083010 показало значительную
противоопухолевую активность на модельных человеческих миеломах. [5]
Еще одним представителем подобных соединений является ингибитор 2 IRE1 (3 -формил - 4 - гидрокси - 5 - метоксибифенил- 3-карбоксиамид). (Рис.3) Он проникает через клеточную мембрану и вызывает ингибирование IRE1 через блокировку образования сплайсинговой формы XPB1. Ингибирование IRE 1 приводит к повышению уровня белка CRADD / RAIDD, являющегося важным белком - адаптером для каспазы-2, и запускающим апоптоз, что так же
Показано действие еще одного ингибитора IRE1 -ингибитора 3 IRE1 ( 8 - формил-7-гидрокси-4-метилкумарин или же 4p8C). (Рис.4) Оно проникает через клеточную мембрану и селективно ингибирует IRE1 РНКазную деятельность путем ковалентного ориентирования IRE1 Lys907 через формирование стабильного основания Шиффа, тем самым эффективно предотвращая ЭПР стресс-индуцированный сайт-специфический мРНК сплайсинг, а также RIDD-регулируемую IRE1 -зависимую деградацию мРНК. Блокирует доступ субстрата в активном
НО у О О СНО
Рис. 4. Ингибитор 3 IRE1. [9,10]
Нами было проведено исследование цитопротективного действия IRE1 при химически индуцируемом стрессе эндоплазматического ретикулума в эндотелиоцитоподобных клетках EA.Hy926, представляющей собой in vitro модель выстилки сосудов. Регуляция функций и роста эндотелиоцитов - чрезвычайно важный аспект ассоциированного с новообразованиями ангиогенеза. Для исследования цитотоксичности мы использовали МТТ тест, в качестве ингибитора IRE1 был выбран ингибитор 1. Для определения цитотоксичности ингибитора 1 IRE1 была проведена его инкубация с клеточной линией эндотелиоцитов EA.Hy926 в течение 24 и 48 часов. Ингибитор 1 был растворен в ДМСО. Полученные результаты показаны в виде диаграммы (рис.5), представляющей собой зависимость оптической плотности при 544 нм, пересчитанной в % от контроля, от концентрации вещества.
Представленные данные демонстрируют, что цитотоксические свойства ингибитора 1 возрастают с увеличением его концентрации, что заметнее при инкубации в течение 48 часов.
Для исследования цитопротекторных свойств IRE1 была проведена инкубация в течение 24 и 48 часов той же клеточной линией с ингибитором 1 с добавлением тапсигаргина, являющимся индуктором стресса ЭПР. Концентрация ингибитора 1 60 мкМ была выбрана в соответствии
с данными полученными ранее и соответствовала сравнительно низкой его собственной
цитотоксичности. Полученные результаты представлены на рисунках 6,7.
Inhl IRE1, EAhy926, 24h Inhl IRE1, EAhy926, 48h
120,0 60,0 30,0 15,0 7,5 0,0 Концентрация 1пЬ I 1ЯЕ1, мкМ
Рис.5. Зависимость оптической плотности от концентрации ингибитора 1.
Как видно из диаграмм при добавлении ингибитора наблюдается повышенная гибель клеток по сравнению с образцами, содержащими только тапсигаргин. Ранее на данной линии клеток нами показано, что тапсигаргин приводит к активации 1ЯЕ1 и опосредуемому ею сплайсингу ХВР1. Рост гибели клеток, превосходящий суммарную токсичность ингибитора и тапсигаргина, указывает на цитотопротекторную роль 1ЯЕ1, то есть активация 1ЯЕ1 помогает клеткам адаптироваться к стрессовому воздействию. Особенно хорошо этот эффект заметен при увеличении времени инкубации, что согласуется с важностью сигнального пути 1ЯЕ1/ХВР1 для адаптивной фазы стресса, которая отсрочена во времени.
На основе результатов проведенного исследования, можно сделать предварительные выводы о том, что цитотоксические свойства ингибитора 1 1ЯЕ1 существенно более выражены при индуцируемом в клетках-мишенях стрессе.
SJ ~
о С
S &
H н
о S
4 «
i= а
■г ^
™ С
5 Z
С 0
О в
120 100 80 60 40 20 0
1000 100 10 0
Концентрация тапсигаргина, нМ
■ Thapsigargin 24h, Eahy
■ Thapsigargin+IRE1 inhibitor 24h, Eahy
Рис.6. Зависимость оптической плотности от концентрации тапсигаргина при инкубации клеток линии EA.Hy926 в течение 24 часов.
H О С
а
ЕС ^
С
(Т В H С
С
120 100 80
g 60
I 40
н К
s20
0
1000 100 10 0 Концентрация тапсигаргина, нМ
■ Thapsigargin 48h, Eahy
■ Thapsigargin+IREl inhibitor 48h, Eahy
Рис. 7.Зависимость оптической плотности от концентрации тапсигаргина при инкубации клеток линии EA.Hy926 в течение 48 часов. Полученные данные свидетельствуют о цитопротекторном действии самого IRE1 при остром стрессе эндоплазматического ретикулума. В контексте проведенных исследований можно предположить, что соединения, подобные ингибитору 1 IRE1, могут проявлять биологическую активность, которая может быть использована в разработке комбинированных средств в терапии онкологических заболеваний.
Павлова Ольга Валерьевна студентка 5 курса кафедры химии и технологии биомедицинских препаратов РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Московцев Алексей Александрович к.м.н., в.н.с. ФГБУНИИ ОППРАМН, Россия, Москва
Клементьева Татьяна Сергеевна аспирантка 1 года ФГБУ НИИ ОПП РАМН, Россия, Москва
Мыльникова Алена Николаевна студентка 5 курса кафедры химии и технологии биомедицинских препаратов РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Соловьева Инна Николаевна старший преподаватель кафедры химии и технологии биомедицинских препаратов РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Литература
1. Merkushkin Maruf MU Ali, Tina Bagratuni. Structure of the Irei autophosphorylation complex and implications for the unfolded protein response. // European Molecular Biology Organization - 2011 -VOL 30, № 5 - Р. 894 - 905
2. Eva Szegezdi, Susan E. Logue,Adrienne M. Gorman & Afshin Samali. Mediators of endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis. EMBO reports VOL 7 | NO 9 | 2006. 880- 885
3. Martin Schröder, Randal J. Kaufman. The mammalian unfolded protein response.// Annu. Rev. Biochem - 2005.-Р. 739 - 867
4. Stewart Siyan Cao and Randal J. Kaufman. Unfolded protein response. // Current Biology. - 2012. -Vol. 22 - p. 622-626
5. Ioanna Papandreou, Nicholas C. Denko, Michael Olson. Identification of an Irelalpha endonuclease specific inhibitor with cytotoxic activity against human multiple myeloma. // BLOOD- 2011, 27 JANUARY - VOLUME 117, NUMBER 4- Р. 1311-1314
6. John B. Patterson, David G. Lonergan, Gary A. Flynn, Qingping Zeng, Peter V. Pallai. IRE-1a INHIBITORS // Патент США - US007858666 B2.
7. Интернет сайт компании Millipore [Электронный ресурс] // Статья: IRE1 Inhibitor I.// https://www.millipore.com/catalogue/item/412510-10mg# (дата обращения 12.04.2014)
8. Интернет сайт компании millipore [Электронный ресурс] // Статья: IRE1 Inhibitor II.// https://www.millipore.com/catalogue/item/412511-25mgtf (дата обращения 12.04.2014)
9. Интернет сайт компании millipore [Электронный ресурс] // Статья: IRE1 Inhibitor III.// https://www.millipore.com/catalogue/item/412512-25mgtf (дата обращения 12.04.2014)
10. Интернет сайт компании tocris [Электронный ресурс] // Статья: 4ц8С.// https:// dispprod.php?ItemId=336106#.U1OkePl_u7w (дата обращения 13.04.2014)
Pavlova O. V.*, Moskovtsev A.A.**, Klementeva T.S. **, Mylnikova A.N. *, Solovyova I.N.*
*D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia.
**The Institute of General Pathology and pathophysiology, Moscow, Russia.
** e-mail: bioinf@mail.ru
SUPPRESSION OF IRE1 RIBONUCLEASE ACTIVITY IS A NEW APPROACH IN CANCER THERAPY
Abstract
Endoplasmic reticulum (ER) transmembrane kinase/endoribonuclease IRE lis an essential element of cell signal system which activates when misfolded proteins are accumulated in ER. Apart from cytoprotective functions IRE1 can initiate synthesis of pro-apoptotic proteins. The purpose of our work was searching IRE1 inhibitors, describing their structure and demonstrating possibility of their using as anti-cancer drugs.
Key words: enzyme IRE1; inhibitors IRE1; cytotoxicity; cytoprotector; unfolding protein response (UPR); endoplasmic reticulum (ER)
