Научная статья на тему 'Подавление активности гидролитических ферментов личинок колорадского жука растительными белками'

Подавление активности гидролитических ферментов личинок колорадского жука растительными белками Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

CC BY
1181
110
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Аннотация научной статьи по агробиотехнологии, автор научной работы — Шпирная И. А., Ибрагимов Р. И., Умаров И. А.

Из личинок колорадского жука Leptinotarsa decemlineata, выделены гидролитические ферменты, протеиназы и α-амилаза. Изучена протеолитическая активность на разных субстратах и взаимодействие с белками ингибиторами гидролаз из растений различных видов. Приводятся данные о содержании ингибиторов протеиназ в вегетативных органах картофеля Solanum tuberosum. Показана связь между устойчивостью растений к вредителям и содержанием в них белков ингибиторов протеиназ.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по агробиотехнологии , автор научной работы — Шпирная И. А., Ибрагимов Р. И., Умаров И. А.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Suppression of activity hydrolytic enzymes the larvaes the potato beetles of protein from plants

Hydrolitic enzymes: α -amylase and proteinases are isolated from larvae Leptinotarsa decemplineata. Proteolitic enzymes activity on different substratums and interaction with protein inhibitors of hydrolitic enzymes from different species of plants are studied. Data of concentration of proteinase inhibitor in vegetative organs of Solanum tuberosum are given. Dependence between plant resistans to blights and containing proteinase inhibitors in it is shown.

Текст научной работы на тему «Подавление активности гидролитических ферментов личинок колорадского жука растительными белками»

раздел БИОЛОГИЯ и МЕДИЦИНА

УДК 581:635.21:632.7 ББК 28.5:42.15:44.6

ПОДАВЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ЛИЧИНОК КОЛОРАДСКОГО ЖУКА РАСТИТЕЛЬНЫМИ БЕЛКАМИ Шпирная И.А., Ибрагимов Р.И., Умаров И.А.

Из личинок колорадского жука Leptinotarsa decemlineata, выделены гидролитические ферменты, протеиназы и а-амилаза. Изучена протеолитическая активность на разных субстратах и взаимодействие с белками - ингибиторами гидролаз из растений различных видов. Приводятся данные о содержании ингибиторов протеиназ в вегетативных органах картофеля Solanum tuberosum.

Показана связь между устойчивостью растений к вредителям и содержанием в них белков - ингибиторов протеиназ.

Колорадский жук является основным вредителем посадок картофеля во многих странах. Для регуляции его численности используются в основном, химические средства защиты, которые обладают побочным вредным эффектом воздействия на природные экосистемы [1]. В связи с этим, является актуальным исследования теоретических и практических аспектов взаимоотношений растений и насекомых - для разработки новых, экологически безопасных способов защиты растений от вредителей.

В комплексе свойств, определяющих степень агрессивности и вирулентности фитопатогенов и вредителей, существенная роль принадлежит их гидролитическим ферментам, при помощи которых вредные организмы, перерабатывая ткани растения хозяина, обеспечивают себе условия для роста и дальнейшего развития [2]. Другой стороной этих взаимодействий являются особенности кормового растения, выражающиеся в различных факторах, препятствующих действию гидролаз на растительные ткани. Среди них особое значение имеют белки-ингибиторы, которые присутствуют в семенах и вегетативных органах растений многих семейств: пасленовых, злаковых, бобовых и др.[3]. Эти молекулы способны инактивировать гидролазы чужеродных организмов, что является одним из факторов устойчивости растений.

Несмотря на то, что исследования взаимодействия ферментов насекомых и природных ингибиторов ведутся уже долгое время, роль ингибиторов как факторов иммунитета остается невыясненной. Очевидно, что для получения целостных представлений о физиологической роли этих молекул необходимы исследования как самих растительных ингибиторов, так и ферментов насекомых, на которые направлено их действие [4].

Целью нашей работы было изучение действия белков-ингибиторов из вегетативных органов растений на активность протеиназ и а- амилаз личинок колорадского жука.

МЕТОДИКА

Объектами служили личинки колорадского жука (далее ЛКЖ) размером 6-8 мм; клубни, ростки до 1см, листья и стебли, сортов картофеля Романо, Удача, Невский, Луговской, Снегирь, листья и плоды растений различных видов.

Гидролитические ферменты выделяли из ЛКЖ, ингибиторы гидролаз - из растительных тканей, в качестве экстрагента использовали дистиллированную воду, подробное описание методики выделения приведено в публикациях [2;5]. В экстрактах ЛКЖ определяли протеолитическую, амилазную активность методам агарозных пластин [6] для определения активности протеиназ, гидролизующих К,а-бензоил-ЭЬ-аргинин-4-нитроанилид (БАПНА) использовали метод Эрлангера [7]. Содержание белка определяли по методу Бредфорд

[8]. Статистическую обработку проводили в программе Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что в тканях личинок колорадского жука функционирует комплекс гидролитических ферментов

[9], в связи с этим нами исследовалась способность протеиназ колорадского жука к гидролизу различных субстратов.

Выделенные ферменты оказались способными гидролизовать различные белки (казеин, гемоглобин, желатин, яичный белок).

За единицу активности (ПЕ) принимали такое количество фермента, которое гидролизовало 1 мм2 субстрата.

Высокую активность эти протеиназы проявляли к желатину, гемоглобину, яичному белку. Как видно, активность протеиназ ЛКЖ по отношению к различным субстратам определяется сопоставимо с уровнем активности высокоочищенных коммерческих препаратов ферментов. Так, активность ЛКЖ по отношению к желатине составляет 32 % от активности проназы E (протеиназы актиномицетов) в концентрации 1 мг/мл (рис.1).

Интересно отметить, что мукопротеид яичного белка, подавляющий активность трипсина [10], не ингибировал протеолитическую активность ЛКЖ.

□ Проназа Е

желатин казеин гемоглобин яичный белок

Рис.1. Гидролиз белков протеолитическими ферментами

Кроме различных белков, протеиназы ЛКЖ активно гидролизовали синтетический субстрат БАПНА.

Эти факты свидетельствуют о том что, в протеолитическом комплексе личинок содержатся протеиназы различных типов.

Из литературных источников известно, что у растений ингибиторы протеиназ локализуются в основном в семенах и других запасающих органах [3; 11], в связи с этим нас интересовала активность ингибиторов протеиназ ЛКЖ и проназы Е из вегетативных органов картофеля, разных сортов. Использовали субстрат БАПНА, за 1 единицу (Е) активности фермента принимали такое его количество, которое в стандартных условиях, образует 1|іМ п-нитроанилид за 1 мин. За единицу ингибиторной активности (ИЕ) принимали такое количество ингибитора, которое на 100% подавляет активность 1 единицы фермента.

Как показали наши эксперименты (табл.1,2) вегетативные органы содержат белки - ингибиторы, подавляющие активность БАПНА- гидролизующих протеиназ. Наибольшей удельной активностью белков -ингибиторов БАПНА-аз ЛКЖ обладали стебли, возможно это один из факторов их устойчивости, наименьшей -листья картофеля, как известно, самая уязвимая часть при поражении вредителем. Белки картофеля неодинаково влияют на активность проназы Е и протеиназы колорадского жука. Как видно из табл. 2 вегетативные органы разных сортов картофеля незначительно отличаются активностью ингибиторов проназы, наибольшей удельной активностью обладают ростки, наименьшей - стебли картофеля

Таблица 1

Активность ингибиторов БАПНА-азы ЛКЖ из вегетативных органах картофеля________________________

Сорт Ингибиторы БАПНА-азы ЛКЖ

клубни ростки листья стебли

ИЕ/г массы мИЕ/мг белка ИЕ/г массы мИЕ/мг белка ИЕ/г массы мИЕ/мг белка ИЕ/г массы мИЕ/мг белка

Романо 0,22±0,02 0,9±0,06 0,3±0,011 3,3±0,2 0,32±0,01 1,1 ±0,07 0,41±0,02 4,3±0,31

Удача 0,2±0,03 0,8±0,03 0,33±0,013 3,9±0,31 0,56±0,04 1,9±0,1 0,42±0,02 2,6±0,12

Снегирь 0,3±0,02 1,5±0,12 0,29±0,02 2,4±0,15 0,27±0,02 1,2±0,09 0,56±0,04 4,13±0,36

Луговской 0,33±0,05 1,56±0,11 0,28±0,015 2,5±0,08 - - 0,3±0,011 2,4±0,14

Невский 0,28±0,02 1,09±0,09 0,27±0,018 2,3±0,03 0,37±0,025 1,4±0,11 0,56±0,041 4,13±0,25

- данные отсутствуют

Т аблица 2

__________________Активность ингибиторов проназы Е из вегетативных органах картофеля______________________

Сорт Ингибиторы проназы Е

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

клубни ростки листья стебли

ИЕ/г массы мИЕ/мг белка ИЕ/г массы мИЕ/мг белка ИЕ/г массы мИЕ/мг белка ИЕ/г массы мИЕ/мг белка

Романо 1,2±0,1 5,01±0,41 0,8±0,01 8,9±0,7 0,84±0,04 2,9±0,2 0,08±0,002 0,8±0,07

Удача 1,04±0,09 4,0±0,37 0,44±0,01 5,14±0,42 0,73±0,06 2,5±0,15 0,4±0,02 2,3±0,15

Снегирь 1,06±0,05 5,3±0,34 0,9±0,03 7,3±0,63 0,8±0,05 3,6±0,28 0,3±0,015 2,2±0,01

Луговской 1,05±0,07 5,01 ±0,28 0,9±0,03 7,8±0,52 0,7±0,05 2,5±0,16 0,08±0,002 0,6±0,04

Невский 1,05±0,1 4,05±0,36 0,9±0,025 7,2±0,29 0,64±0,03 2,4±0,14 0 0

Следует отметить, что белки из разных частей картофеля неодинаково подавляют активность проназы и протеиназы ЛКЖ. Еще более наглядно эта закономерность проявляется при анализе средних значений данных по активности ингибиторов протеиназ из пяти сортов картофеля. На рис.2 представлены средние значения активности ингибиторов протеиназ: ЛКЖ и проназы Е из клубней, ростков, листьев и стеблей. Из рис.2 видно, что, к примеру стебли картофеля при наибольшей активности ингибиторов протеиназ ЛКЖ (сравнительно с другими органами картофеля), характеризуются наименьшей активностью ингибиторов проназы Е.

Рис.2. Активность ингибиторов проназы Е и ингибиторов протеиназы ЛКЖ из картофеля.

Данные различия - свидетельство высокоспецифичного взаимодействия белка с ферментом, и как следствие растения и насекомого.

Интересные закономерности обнаруживаются при сравнительном анализе активности белков ингибиторов протеиназ, из различных частей растений (табл.3)., разных видов.

Т аблица 3

Объект Часть растения Ингибиторы проназы Е Ингибиторы п ротеиназы ЛКЖ Содержание белка, мкг/мл

ИЕ/г массы мИЕ/мг белка ИЕ/г массы мИЕ/мг белка

Одуванчик (Taraxacum sp.) листья 1,5±0,21 8,8±0,35 0,36±0,02 2,1±0,14 170

Т ополь (Populus nigra L.) листья 0 0 0,31±0,018 6,2±0,34 50

Морковь (Daucus carota) листья 0,85±0,06 4,0±0,28 * * 215

корнеплод 0 0 * * 165

ингибитор трипсина из сои (ком. препарат) * * * * 1000

(U 3 (Я о X ;(U 4 ä С Томат (Solanum lycopersicum) листья 1,2±0,09 4,6±0,36 0,54±0,03 2,1±0,17 260

плоды 0 0 * * 90

Баклажан (Solanum melongena) листья 1,4±0,12 6,1±0,45 0,22±0,011 0,96±0,05 230

Физалис (Physalis sp.) листья 0,36±0,01 1,6±0,09 0 0 230

Картофель (Solanum tuberosum) листья 0,74±0,05 2,8±0,18 0,3±0,019 1,12±0,07 290

ростки 0,8±0,03 7,3±0,51 0,3±0,015 2,9±0,22 100

стебли 0,74±0,03 2,8±0,12 0,45±0,03 3,5±0,24 130

клубни 1,08±0,09 4,7±0,41 0,27±0,02 1,2±0,09 220

цветы 0,8±0,03 4,7±0,39 0,28±0,02 1,65±0,06 170

Примечание: *- полное подавление активности ферментов (активность БАПНА-азы ЛКЖ составила - 45,8 мЕ/мл; активность проназы Е - 190 мЕ/мл.

Растения из семейства пасленовых, известные как неустойчивые культуры к колорадскому жуку, обладают высоким содержанием белков ингибиторов проназы, и напротив, сниженной, по сравнению с растениями других семейств активностью ингибиторов к протеиназе ЛКЖ.

Белки из плодов томата и корнеплодов моркови подавляют активность протеиназы жука, однако активность ингибиторов проназы в них не выявлена. По-видимому, низкая активность ингибиторов микроорганизмов в них обясняет низкую устойчивость к болезням, вызванными бактериями и патогенными грибами.

Таким образом, ингибиторы протеолитических ферментов, наряду с другими растительными веществами играют существенную роль в устойчивости растения к насекомым вредителям. Однако активность природных ингибиторов ферментов не стабильна. Она колеблется в онтогенезе и зависит от условий внешней среды [2].

В табл.4 приведены данные, полученные методом агарозных пластин, по активности гидролаз ЛКЖ (контроль). Здесь же показано как ингибиторы из вегетативных органов картофеля, разных сортов, добавленные к экстракту ЛКЖ, в соотношении 1:1, действуют на активность ферментов.

За единицу активности ингибитора (ИЕ) принимали такое количество, которое подавляет 1 единицу активности фермента.

Наши исследования показывают, что в клубнях и стеблях присутствует активность ингибиторов желатиназы ЛКЖ, в листьях такой активности не обнаружили.

Неочищенный экстракт личинок обладал также, способностью к гидролизу крахмала, т.е. проявлял амилазную активность. Белки из клубней и стеблей способны незначительно подавлять активность а-амилазы ЛКЖ. В листьях ингибирующей активности к амилазе не фиксировали (табл.4).

Т аблица 4

Активность ингибиторов желатиназы (Иж) и ингибиторов амилазы (Иа) личинок колорадского жука в различных ____________________________________________сортах картофеля_____________________________________________________

Сорт картофеля клубни, ИЕ стебли, ИЕ листья, ИЕ желатиназа ,ПЕ амилаза, АЕ

Иж Иа Иж Иа Иж Иа

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Невский 18,1 50,2 16,7 15,1 0 0 113,04 78,5

Удача 18,1 40 18 28,3 0 0

Луговской 34,5 40 12 14,8 0 0

Рамона 34,5 34,3 18 18,2 0 0

Снегирь 26,5 34,3 20,2 21,8 0 0

В итоге проведенных исследований мы можем сделать следующие выводы:

Протеолитические ферменты личинок колорадского жука, обладают широкой субстратной специфичностью.

Взаимодействие с белками - ингибиторами из разных частей растений различных видов приводит к частичному или полному подавлению их активности.

Растения из семейства пасленовых обладают сниженной, по сравнению с растениями из других семейств, активностью белков-ингибиторов протеиназ личинок колорадского жука.

ЛИТЕРАТУРА

1. Методические рекомендации по индикации и мониторингу процессов адаптации колорадского жука к генетически модифицированным сортам картофеля// Павлюшин В.А., Вилкова Н.А., Сухорученко Г.И., Фасулати С.Р. и др. издательство ВИЗР, ВНИИБЗР. Санкт-Петербург, 47 с.

2. Применение методов биохимии в исследованиях по защите растений (Методические указания) п/р К.В.Новожилова, С.Л.Тютерева, издательство ВИЗР, Ленинград, 1976 с.61-62

3. Мосолов ВВ, Валуева ТА. Ингибиторы протеиназ и их функции у растений//Прикладная биохимия и микробиология. -2005.-Т .41 №3.-с.261-282

4. Фомичева Ю.А. Пищеварительные а-амилазы и протеиназы насекомых как элемент специфичного взаимодействия в системе растение - насекомое -фитофаг: Автореф. канд.дис. Санкт -Петербург,1992. 15 с.

5. Шевченко Н.Д., Шпирная И.А. Выделение и свойства протеолитических ферментов личинок Leptinotarsa decemplineata// Тез. докладов второго международного симпозиума Сигнальные системы клеток растений: Роль в адаптации и иммунитете. Казань. 2006. С.228-229

6. Шпирная И.А.,Шевченко Н.Д. Определение активности протеолитических ферментов и их ингибиторов методом гелевых пластин// Тез. докладов второго международного симпозиума Сигнальные системы клеток растений: Роль в адаптации и иммунитете. Казань. 2006. С.230-231

7. Erlanger B.F., Kokowski N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrutes of trypsin // Arch. Biochem. Biophys.- 1961.- V. 95, N 2.- P. 271-278.

8. Bradford M.M. A rapide and sensetive method for the quantitasion of microgramm quantities of protein utilising the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. - 1976. - V.172, N 1. - P. 248 - 254.

9. Конарев Ал.В. Ингибиторы протеиназ и устойчивость картофеля к колорадскому жуку//Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку.-М. Наука, 2000.- С.35-40

10. Велобова Е. Н. Переваривание белков. Киев: гродынец,1993, 29 с.

11. Ибрагимов Р.И. Содержание ингибиторов протеиназ в семенах сельскохозяйственных культур // Качество продукции растениеводства и приемы его повышения.- Уфа: Баш. гос. агр. ун-т. - 1998.-С. 146-149.

Поступила в редакцию 14.09.06 г.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.