Почечные механизмы регуляции цикла оксида азота у белых крыс при нагрузке нитритом натрия Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

© А.И.Гоженко, С.И.Доломатов, И.Ю.Бадьин, Б.А.Насибуллин, 2005 УДК 611.61:546.173]:546.17.001.5

А.И.Гоженко, С.И.Доломатов, И.Ю.Бадьин, Б.А.Насибуллин

ПОЧЕЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ЦИКЛА ОКСИДА АЗОТА У БЕЛЫХ КРЫС ПРИ НАГРУЗКЕ НИТРИТОМ НАТРИЯ

A.I.Gozhenko, S.I.Dolomatov, I.Yu.Badyin, B.A.Nasibullin

RENAL MECHANISMS OF REGULATION OF THE NITROGEN OXIDE CYCLE IN WHITE RATS LOADED WITH SODIUM NITRITE

Научно-исследовательский институт медицины транспорта Министерства здравоохранения Украины, кафедра общей и клинической патофизиологии Одесского государственного медицинского университета, Одесса, Украина

РЕФЕРАТ

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Изучение почечного транспорта нитратов и нитритов в интактной почке. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ. В эксперимент отбирали крыс-самцов с массой тела 100-200 г. Животных случайным образом разделяли на 4 группы. Крысам 3-й и 4-й групп в составе нагрузочной пробы вводили нитрит натрия из расчета 0,2 мг на 100 г м.т. Функция почек крыс изучалась в условиях индуцированного диуреза. В качестве нагрузки использовали воду и 3% раствор химически чистого хлорида натрия (осмоляльность растворов составляла соответственно 3 и 1050 мосмоль/кг Н2О), которые вводили внутрижелудочным зондом из расчета 5% от массы тела. Воду или водный раствор нитрита натрия вводили соответственно крысам 1-й (n=12) и 3-й (n=12) групп. Введение солевого раствора и осуществляли крысам 2-й (n=13), а солевой раствор, содержащий нитрит натрия - крысам 4-й (n=12) группы. В полученных образцах мочи и плазмы крови определяли нитриты, нитраты, креатинин, а также белок мочи. РЕЗУЛЬТАТЫ. Установлено, что однократное введение нитрита натрия, независимо от вида нагрузки, сопровождается снижением клиренса креатинина, повышением выделения почками белка и не приводит к увеличению концентрации нитрит-ионов в плазме крови. В то же время выявлено увеличение концентрации нитратов в плазме крови и усиление их экскреции почками. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. (1) Установлено, что введение нитрита натрия в количестве 0,2 мг на 100 г м.т. приводит к увеличению концентрации нитратов, но не нитритов, в плазме крови и сопровождается умеренным изменением функционального состояния почек: снижением клиренса креатинина и увеличением экскреции белка. (2) Проведенные исследования позволяют высказать предположение, что детоксикация организма при поступлении экзогенных нитритов осуществляется за счет ускоренного их окисления до нитратов с последующим повышением темпов выделения нитрат-аниона почками. (3) Почки играют важную роль в регуляции цикла оксида азота в организме при введении экзогенного нитрита натрия. Ключевые слова: почки, нитрит натрия, транспорт.

ABSTRACT

THE AIM of the investigation was to study the renal transport of nitrates and nitrites in the intact kidney. MATERIALS AND METHODS. The selected for the experiments male rats with body mass 100-200 g were randomly divided into 4 groups. The rats of the third and fourth groups were given sodium nitrite (0.2 mg/100g of body mass). The kidney function was studied under conditions of induced diuresis. Water and 3% solution of chemically pure sodium chloride (osmolality of the solution was 3 and 1050 mOsm/kg H2O) was used as a load which was administered by an intragastric probe at 5% of body mass. Water or aqueous solution of sodium nitrite was administered to rats of the 1st and 3rd (n=12) groups respectively. Saline solution was administered to rats of the 2nd group (n=13), the saline solution with sodium nitrite was administered to rats of the 4th (n=12) group. Nitrites, nitrates, creatinine and urine protein were determined in samples of urine and blood plasma. RESULTS. It has been found that a single administration of sodium nitrite, independent of the kind of load, is followed by a decrease of creatinine clearance, elevation of protein eliminated by the kidneys and does not result in higher concentration of nitrite-ions in blood plasma. At the same time the concentration of nitrites in blood plasma and their excretion by the kidneys increased. CONCLUSION. 1. Administration of sodium nitrite (0.2 mg/100g of body mass) results in the increased concentration of nitrates rather than nitrites in blood plasma and is followed by a moderate change of the functional state of the kidneys: lower creatinine clearance and higher excretion of protein. 2. The investigations performed suggest that detoxication of organism after administration of exogenous nitrites is realized at the expense of their accelerated oxidation into nitrates followed by higher rate of excretion of nitrate-anion by the kidneys. 3. The kidneys play an important role in regulation of the nitrogen oxide cycle in organism after administration of exogenous sodium nitrite.

Key words: kidneys, sodium nitrite, transport.

ВВЕДЕНИЕ

По данным литературы, нитраты и нитриты эндогенного происхождения являются непосредственными продуктами метаболизма оксида азота и могут повторно включаться в цикл оксида азота, выполняя тем самым функцию депо и транспорта

оксида азота [1]. При этом почки играют важную роль в выведении из организма нитритов и нитратов эндогенного [2,3] и экзогенного [3,4] происхождения. В то же время, как показывают исследования, подавляющая часть профильтровавшихся в почечном клубочке эндогенных нитратов и нитритов под-

вергается обратному всасыванию в проксимальном сегменте нефрона [5]. Таким образом, роль почек в регуляции выделения неорганических окислов азота, согласно данным литературы, является важным физиологическим механизмом регуляции их концентрации во внеклеточной жидкости организма. При этом механизмы почечного транспорта нитритов и нитратов in vivo требуют более глубокого исследования. Целью работы было исследование почечного транспорта нитратов и нитритов в интактной почке.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В эксперимент отбирали крыс-самцов с массой тела 100-200 г. Животных случайным образом разделяли на 4 группы. Крысам 3-й и 4-й групп в составе нагрузочной пробы вводили нитрит натрия из расчета 0,2 мг на 100 г м.т. Функция почек крыс изучалась в условиях индуцированного диуреза. За 12 часов до проведения функциональных проб животным ограничивали потребление пищи. В качестве нагрузки использовали воду и 3% раствор химически чистого хлорида натрия (осмоляльность растворов составляла соответственно 3 и 1050 мосмоль/кг Н20). Воду или раствор хлорида натрия вводили внутрижелудочным зондом из расчета 5% от массы тела. Воду или водный раствор нитрита натрия вводили соответственно крысам 1-й (n=12) и 3-й (n=12) групп. Введение солевого раствора осуществляли крысам 2-й (n=13), а солевой раствор, содержащий нитрит натрия, - крысам 4-й (n=12) группы. Мочу собирали в течение 2 часов с момента введения нагрузочной пробы. Выведение животных из эксперимента осуществляли под легкой эфирной анестезией путем декапитации. Образцы полученной крови стабилизировали гепарином. Цельную кровь центрифугировали и отбирали плазму для дальнейших исследований. В полученных образцах проб мочи и плазмы крови проводили анализ химического состава по следующим методикам: белок в моче фотометрически (^=590 нм) на «КФК-3» сульфо-салициловым методом [6];

- креатинин плазмы и мочи определяли фотометрически на спектрофотометре СФ-46 (^=520 нм) по реакции с пикриновой кислотой;

- концентрацию нитратов плазмы крови и мочи определя-

ли фотометрически (^=540 нм) на спектрофотометре СФ-46 [7].

Расчетные показатели деятельности почек вычисляли с использованием ранее предложенных формул [8].

Статистический анализ результатов исследования осуществляли по общепринятым методам с использованием критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Установлено, что однократное введение водного и солевого раствора нитрита натрия в количестве 0,2 мг на 100 г м.т. сопровождается достоверным повышением концентрации креатинина в плазме крови (табл. 1, 2). Вместе с тем выявлено, что концентрация нитритов в плазме крови крыс 3-й и 4-й группы достоверно ниже, чем у контрольных животных. Однако уровень нитратов при этом достоверно превышает контрольные величины в 2,4 раза в условиях водной нагрузки и в 2 раза при нагрузке 3% раствором хлорида натрия.

Исследования функционального состояния почек показали, что однократное введение нитрита натрия приводит к умеренным изменениям показателей деятельности почек. В частности, в условиях водной нагрузки (табл. 3), на фоне несущественных изменений величины диуреза, зарегистрировано достоверное увеличение показателей концентрации белка в моче (в 2 раза) и его экскреции (в 2 раза). Вместе с тем, под влиянием нитрита натрия отмечалось снижение значений клиренса креатинина в 1,3 раза. Исследования выделения почками нитритов и нитратов показали, что темпы их экскреции в расчете на 1 мл клубочкового фильтрата возрас-

Таблица 1

Содержание нитритов и нитратов в плазме крови крыс при однократном введении водного раствора нитритов в количестве 0,2 мг/100 г м.т.^ ± m)

Исследуемые показатели Контрольная группа Введение нитритов

n=12 n=12

Креатинин плазмы крови, мкмоль/л 50±2 69±4 р<0,01

Общий кальций плазмы крови, ммоль/л 2,41±0,08 2,39±0,07

Нитраты плазмы крови, мкмоль/л 6,2±0,7 14,5±0,9 p<0,01

Примечание для табл. 1, 2: п - число наблюдений; р - показатель достоверности межгрупповых отличий

Таблица 2

Содержание нитритов и нитратов в плазме крови крыс при однократном введении нитритов в составе 3% раствора хлорида натрия в количестве 0,2 мг/100 г м.т.^ ± m)

Исследуемые показатели Контрольная группа Введение нитритов

n=13 n=12

Креатинин плазмы крови, мкмоль/л 45±2 67±5 p<0,01

Нитриты плазмы крови, мкмоль/л 5,9±0,3 1,8±0,1 p<0,01

Нитраты плазмы крови, мкмоль/л 4,8±0,03 10,5±0,08 p<0,01

Таблица 3

Показатели деятельности почек под влиянием однократного введения водного раствора нитритов в количестве 0,2 мг/100 г м.т. (X ± m)

Изучаемые показатели Контрольная группа Введение нитритов

п=12 п=12

Диурез, мл/ч 1,4±0,2 1,5±0,2

Относительный диурез, % 58,3±3,2 61,2±4,2

Креатинин мочи, мкмоль/л 1472±28 1517±27

Экскреция креатинина, мкмоль/ч 2,4±0,2 2,5±0,2

Белок мочи, мг/л 29±3 65±6 р<0,01

Экскреция белка, мг/ч 0,046±0,009 0,091±0,022 р<0,01

Клиренс креатинина, мкл/мин 733±31 547±24 р<0,01

Экскреция белка, на 1 мл КФ 0,93±0,27 2,77±0,75 р<0,01

Экскреция нитритов на 1 мл КФ (0,2±0,02)х10-4 (0,6±0,07)х10-4 р<0,01

Экскреция нитратов на 1 мл КФ (2,1±0,3)х10-4 (19,8±4,6)х10-4 р<0,01

Примечание: КФ - клубочковый фильтрат; п - число наблюдений; р - показа тель достоверности межгрупповых отличий.

тали соответственно в 3 раза и 10 раз на фоне 3-кратного повышения экскреции белка, стандартизированной на 1 мл клубочкового фильтрата.

В свою очередь, при введении нитрита натрия в составе 3% раствора хлорида натрия также не установлено достоверных межгрупповых отличий величин объема диуреза. В то же время параметры концентрации белка в моче и его экскреции достоверно превышают контрольные значения в 3 раза, а показатель экскреции белка, стандартизированный на 1 мл клубочкового фильтрата, превышает контрольный уровень в 4 раза. При этом величина клиренса креатинина на фоне введения нитрита натрия снижается в 1,4 раза, а экскреция нитритов и нитратов в расчете на 1 мл клубочко-вого фильтрата повышается соответственно в 2,5 раза и в 3 раза (табл. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ

По данным литературы, почечная экскреция продуктов окисления молекулы оксида азота - нитратов и нитритов - возрастает пропорционально увеличению скорости клу-бочковой фильтрации [9]. Также в литературе имеются сообщения о том, что у человека и животных, при определенных видах нагрузочных проб можно добиться повышения СКФ благодаря поступлению в организм животного белка или при острой нагрузке гиперосмотическим раствором [10,11]. Отмечается, что почечная экскреция нитратов вполне объективно

отражает состояние системного синтеза и скорости метаболизма молекулы оксида азота, поскольку, с одной стороны, почки являются основным органом, отвечающим за экскрецию эндогенных и экзогенных нитратов, а, с другой стороны, между величинами канальцевой загрузки и реабсорбции аниона существует линейная зависимость [12]. В то же время, в литературе имеются данные о том, что реакция почек на осмотическую нагрузку, в сравнении с водной, сопровождается существенным повышением почечной экскреции нитратов [3]. Согласно нашим данным, в группе контрольных животных под влиянием осмотической нагрузки, в сравнении с водной, наблюдается выраженное повышение концентрации нитритов и нитратов в моче. При этом увеличение стандартизированной на единицу объема фильтрата экскреции нитратов носило более выраженный характер, по сравнению с аналогичным показателем для нитритов. Целесообразность такой реакции, по нашему мнению, состоит в том, что одновременно с увеличением продукции оксида азота происходит повышение скорости его инактивации в цепи последовательных окислительных реакций NO^NO2^NO3 [13]. При этом, возрастает пул физиологически наиболее низко активного метаболита - нитрата, предотвращая тем самым возможность ресинтеза молекулы N0 в цепи нитрит-редуктазных реакций регуляции цикла оксида азота [1]. Результаты собственных исследований показывают, что однократное введение нитрита натрия в количестве 0,2 мг/100 г м.т. (независимо от вида функциональной нагрузки) не

Таблица 4

Показатели деятельности почек под влиянием однократного введения нитритов в составе 3% раствора хлорида натрия в количестве 0,2 мг/100 г м.т. (X ± m)

Изучаемые показатели Контрольная группа Введение нитритов

п=13 п=12

Диурез, мл/ч 2,6±0,3 2,8±0,3

Относительный диурез, % 112,6±6 114,3±5

Креатинин мочи, мкмоль/л 986±19 972±25

Экскреция креатинина, мкмоль/ч 2,5±0,2 2,8±0,3

Белок мочи, мг/л 23±4 65±6 р<0,01

Экскреция белка, мг/ч 0,051±0,009 0,157±0,031 р<0,01

Клиренс креатинина, мкл/мин 964±33 708±21 р<0,01

Экскреция белка на единицу объема КФ 0,88±0,25 3,39±0,61 р<0,01

Экскреция нитритов на единицу объема КФ (2,7±1,1)х10-4 (6,8±1,8)х10-4 р<0,01

Экскреция нитратов на единицу объема КФ (14,8±3,8)х10-4 (41,5±8,3)х10-4 р<0,01

Примечание: КФ - клубочковый фильтрат; п - число наблюдений; р - показатель достоверности межгрупповых отличий.

вызывает накопления нитрит-ионов в плазме крови. С нашей точки зрения, данный результат достигается благодаря нескольким механизмам. Во-первых, за счет ускоренного окисления нитритов до биологически менее активного метаболита - нитратов. Действительно, концентрация азотнокислых оснований в плазме крови превосходит контрольные показатели. Во-вторых, возрастают темпы почечного выделения нитратов, главным образом за счет снижения их канальцевой реаб-сорбции, поскольку скорость клубочковой фильтрации в данной группе ниже, чем в контроле. Увеличение канальцевой загрузки аниона вследствие повышенного его содержания в плазме крови не является основной причиной столь значимого превосходства почечной экскреции нитратов экзогенного происхождения над контрольными величинами. Справедливость наших рассуждений подтверждается результатами исследования функционального состояния канальцевого отдела не-фрона. Например, у крыс на фоне введения нитритов мы регистрируем также рост экскреции белка. Как известно, основные количества профильтровавшихся пептидов, аминокислот реабсорбируются в проксимальном отделе нефрона [14]. Поэтому, увеличение почечной экскреции белка может свидетельствовать о снижении проксимального транспорта, которое в нашем эксперименте, скорее всего, не носит избирательный по отношению к нитратам и нитритам характер. Поэтому, удаляя избыток неорганических окислов азота, организм теряет и биологически важные молекулы. Тем не менее эффективность работы названных механизмов подтверждается отсутствием превышения контрольных уровней нитритов в плазме крови экспериментальных животных независимо от вида используемой нагрузки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Установлено, что введение нитрита натрия в количестве 0,2 мг на 100 г м.т. приводит к увеличению концентрации нитратов, но не нитритов в плазме крови и сопровождается умеренным изменением функционального состояния почек: снижением клиренса креатинина и увеличением экскреции белка.

2. Проведенные исследования позволяют высказать предположение, что детоксикация организма при поступлении экзогенных нитритов осуществляется за счет ускоренного их окисления до нитратов с последующим повышением темпов выделения нитрат-аниона почками.

3. Почки играют важную роль в регуляции цикла оксида азота в организме при введении экзогенного нитрита натрия.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Реутов ВП, Сорокина ЕГ, Охотин ВЕ, Косицын НС. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих. Наука, М., 1998; 156

2. Jungersten L, Edlund A, Petersson AS, Wennmalm A. Plasma nitrate as an index of nitric oxide formation in man: analyses of kinetics and confounding factors. Clin Physiol 1996; 16(4): 369-379

3. Гоженко А1. Роль оксиду азоту в молекулярно-1штин-них мехаызмах функцп нирок. Укранський бiохiмiчний журнал 2002; 74(4а): 96

4. Cortas NK, Wakid NW. Pharmacokinetic aspects of inorganic nitrate ingestion in man. Pharmacol Toxicol 1991; 68(3): 192-195

5. Majid DS, Godfrey M, Grisham MB, Navar LG. Relation between pressure natriuresis and urinary excretion of nitrate/ nitrite in anesthetized dogs. Hypertension 1995; 25(4): 860-865

6. Михеева АИ, Богодарова ИА. К методике определения общего белка в моче на ФЭК-Н-56. Лабораторное дело 1969; (7): 441-442

7. Емченко НЛ, Цыганенко ОИ, Ковалевская ТВ. Универсальный метод определения нитратов в биосредах организма. Клиническая и лабораторная диагностика 1994; (6): 19-20

8. Наточин ЮВ. Физиология почки. Формулы и расчёты. Наука, Л.,1974; 68

9. Tolins JP, Palmer RM, Moncada S, Raij L. Role of endothelium-derived relaxing factor in regulation of renal hemodynamic responses. Am J Physiol 1990; 258(3): H655-H662

10. Гоженко АИ, Федорук АС. Влияние предуктала на развитие и течение экспериментальной острой почечной недостаточности. Нефрология 2000; 4(1): 67-71

11. Гоженко АИ, Куксань НИ, Гоженко ЕА. Методика определения почечного функционального резерва у человека. Нефрология 2001; 5(4): 70-73

12. Godfrey M, Majid DS. Renal handling of circulating nitrates in anesthetized dogs. Am J Physiol Renal Physiol 1998; 275(1): F68-F73

13. Lauer Th, Preik M, Rassaf T et al. Plasma nitrite rather than nitrate reflects regional endothelial nitric oxide synthase activity but lacks intrinsic vasodilator action. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98(22): 12814-12819

14. Ратнер МЯ, Серов ВВ, Томилина НА. Ренальные дисфункции. Медицина, М., 1977; 296

Поступила в редакцию 09.03.2005 г.